氧化碳纳米颗粒纸芯片的制备方法及其在汞离子检测中的应用与流程

本发明属于纸芯片应用技术领域，具体涉及氧化碳纳米颗粒纸芯片的制备方法及其在汞离子检测中的应用。

背景技术：

汞是一种具有神经毒性的生物环境污染物，可在生物体内富集，会破坏和侵蚀人类的皮肤、大脑皮层、小脑和末梢神经及中枢神经系统，甚至可以造成语言和记忆能力障碍等永久性损伤。鉴于此，汞离子的检测具有至关重要的意义。目前检测汞离子的方法有原子吸收光谱法(aas)、电感耦合等离子-原子发射光谱法(icp-aes)、电化学传感器法、电感耦合等离子-质谱(icp-ms)法等。以上技术检测结果准确、灵敏度高，但需要繁琐的样品处理步骤和精密昂贵的仪器，同时需要专业人员进行操作，检测成本高。比色分析法是近年用于汞离子检测的一种常用的方法，该方法的检测过程简单，易于实现，且无需精密复杂的仪器，但此类方法的检测灵敏度通常较低，无法满足实际样品中低浓度汞离子直接检测的需求。

纸芯片是whitesides课题组于2007年针对发展中国家和资源匮乏地区提出的一种检测技术，以纸张作为基底材料，在纸上分割出亲水区域，利用流体在纸张多孔结构内的扩散流动进行分析检测，原材料易得，检测成本低，一经提出就引起研究人员的广泛关注，近年来在疾病诊断、环境监测、食品安全等领域得到广泛的应用。

碳纳米颗粒具有与石墨烯相似的结构，具有超强的荧光猝灭性能，是一种性能优良的荧光共振能量转移体系的受体材料。但其在水中分散性较差，溶液发生团聚，影响其分析应用。氧化碳纳米颗粒在制备过程中利用硝酸进行氧化，引入水溶性基团，改善其在水溶液中的分散性。目前有文献报道（理化检验-化学分册，2018,54,5）将氧化碳纳米颗粒用于纸芯片的构建及凝血酶的检测。报道中的氧化碳纳米颗粒直接通过硝酸氧化得到，该方法制备的材料粒径较大，一般在40～60nm，加之纳米材料负载在纸芯片表面过程中的自然团聚，使得纳米材料比表面积变小，影响其荧光猝灭效率，进而影响检测灵敏度。

技术实现要素：

为解决现有技术中汞离子检测所需的仪器复杂、步骤繁琐的问题，本发明提供一种氧化碳纳米颗粒纸芯片的制备方法及其在汞离子检测中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种氧化碳纳米颗粒纸芯片的制备方法，包括以下步骤：

a．以蜡烛灰作为碳源，在水和乙醇混合溶剂中超声制备得到碳纳米颗粒，再以硝酸和n,n二甲基甲酰胺为溶剂制备氧化碳纳米颗粒；

b．通过软件设计纸芯片图案，将滤纸粘贴于a4打印纸表面，直接在滤纸表面打印纸芯片图案，用油性笔绘制疏水壁垒，制作纸芯片；

c．在纸芯片亲水区域滴加氧化碳纳米颗粒，烘干，制得所述氧化碳纳米颗粒纸芯片。

进一步地，所述步骤a中水和乙醇体积比为1:1，超声时间为5～8h，浓硝酸和n,n二甲基甲酰胺的体积比为1:1，回流温度为100℃，回流时间为10～18h，所制备氧化碳纳米颗粒为球形，粒径为20～50nm。

进一步地，所述步骤b中的滤纸为whatman1号滤纸，所述亲水区域形状为圆形，直径为3mm。

进一步地，所述步骤c中氧化碳纳米颗粒的滴加浓度为2.8～100μg/ml。

本发明还提供一种利用任一所述制备方法制备得到的氧化碳纳米颗粒纸芯片。

本发明还提供所述的氧化碳纳米颗粒纸芯片在汞离子检测中的应用，包括以下步骤：

a.向氧化碳纳米颗粒纸芯片中加入fam-hg²⁺-aptamer反应，制备得fam-hg²⁺-aptamer/ocnps复合物负载的纸芯片基底；

b．向fam-hg²⁺-aptamer/ocnps复合物负载的纸芯片基底中加入不同浓度的汞离子溶液反应，记录各区域荧光强度，绘制荧光恢复程度与汞离子浓度之间的线性关系曲线；

c．向fam-hg²⁺-aptamer/ocnps复合物负载的纸芯片基底中加入待测样品反应，记录反应区域荧光强度，根据工作曲线计算实际样品中汞离子浓度。

进一步地，所述步骤a中fam-hg²⁺-aptamer的浓度为100nm。

进一步地，所述步骤b中线性关系曲线的范围为1～100nm。

进一步地，所述步骤a和步骤b中反应条件是室温避光，反应时间为10～30min。

本发明提出的一种氧化碳纳米颗粒纸芯片的制备方法及其在汞离子检测中的应用，是一种基于荧光共振能量转移原理检测汞离子的方法，具体是以纸芯片为载体，以氧化碳纳米颗粒为能量受体并负载于纸芯片表面，以富含t碱基的核酸适配体序列作为识别分子并标记荧光供体fam。当向氧化碳纳米颗粒纸芯片中加如fam-hg²⁺-aptamer时，核酸适配体通过π-π堆积作用吸附在ocnps表面，供受体之间距离拉近，供体的荧光被猝灭。当向fam-hg²⁺-aptamer/ocnps复合物负载的纸芯片基底中加入汞离子时，汞离子与其核酸适配体形成t-hg²⁺-t结构，将荧光供体从ocnps表面竞争下来，供受体之间距离增大，供体的荧光逐渐恢复，荧光恢复程度与汞离子浓度之间存在相关性，据此实现汞离子的检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所使用的氧化碳纳米颗粒采用先超声，再氧化的方法制备而成，所制备材料的尺寸较小且分布均匀，在水溶液中具有优良的分散性，无需借助表面活性剂即可稳定分散。

本发明以氧化碳纳米颗粒作为荧光共振能量转移体系的能量受体构建纸芯片，氧化石墨烯等片状纳米材料相比，氧化碳纳米颗粒与纸张表面多孔结构的相容性更好，供受体间能量转移效率高，可显著提高检测灵敏度；

本发明将构建的氧化碳纳米颗粒纸芯片用于汞离子浓度的检测，检测灵敏度高，最低可检测至1nm，同时，检测速度快，10min即可出结果。

附图说明

图1为实施例1中纸芯片中溶液体积优化图；

图2为实施例2中氧化碳纳米颗粒浓度与荧光猝灭效率关系图；

图3为氧化碳纳米颗粒纸芯片检测汞离子的原理图；

图4为实施例3中汞离子检测工作曲线。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明。

本发明中使用的fam-hg²⁺-aptamer购自生工生物工程(上海)股份有限公司，纯化方式为hplc，核酸序列为：5’-fam-ttctttcttcccttgtttgtt-3’。使用前用hepes缓冲溶液（10mm，ph7.2）溶解至所需浓度。

若未特别指明，实施例中所用技术手段和原料均为本领域技术人员所熟知的常规手段和原料。

实施例1制备氧化碳纳米纸芯片

制备氧化碳纳米颗粒（ocnps）：收集新制蜡烛灰18mg于圆底烧瓶中，加入10ml高纯水和10ml无水乙醇，室温超声5h，1000rpm离心1min，除去大颗粒，上层溶液用高纯水洗涤三次，将所得沉淀转移至100ml圆底烧瓶中，加入9ml浓硝酸和9mldmf，100℃回流16h，待溶液自然冷却至室温后12000rpm离心10min，所得沉淀用无水乙醇和高纯水分别洗涤三次，洗涤完成后真空干燥，称重，分散于高纯水中配制成5mg/mlocnps分散液。

制备纸芯片基底：在绘图软件中绘制直径为3mm圆形图案，呈3×10阵列状排布，将whatman1号滤纸用双面胶粘贴于a4打印纸表面，置于打印机中，直接在滤纸表面打印上述阵列排布的圆形图案。将圆形模具（尺寸与滤纸上圆形图案相同）覆盖在滤纸表面，用日本zebra油性记号笔沿模具边缘绘制圆形疏水壁垒，将纸张翻转180°，在反面同一位置再绘制一次，绘制完后放置24h，确保油墨溶剂完全挥发，得到纸芯片基底。

制备氧化碳纳米颗粒纸芯片：在纸芯片亲水区域分别滴加1～7μl的氧化碳纳米颗粒分散液，结果如图1所示，溶液过少无法填充满整个检测区域，体积过大则会从亲水区域中溢出，因此选择滴加氧化碳纳米颗粒分散液的最佳体积为5μl，自然晾干，制得所述氧化碳纳米纸芯片。

实施例2制备fam-hg²⁺-aptamer/ocnps复合物负载的纸芯片基底

本实施例的制备氧化纳米颗粒和制备纸芯片基底的步骤与实施例1大致相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：将制备出的氧化纳米溶液分为6组，分散于高纯水中分别配制为浓度为2.8μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml和100μg/ml的氧化碳纳米颗粒溶液；

分别量取5.0μl不同浓度的氧化碳纳米颗粒溶液滴加到6组相同的纸芯片基底中，第7组滴加5.0μl的高纯水，自然晾干，得到不同浓度的氧化碳纳米纸芯片；

向上述7组氧化碳纳米纸芯片上分别滴加5.0μl浓度为100nm的fam-hg²⁺-aptamer溶液，置于暗处反应至纸张干燥，得到7组fam-hg²⁺-aptamer/ocnps复合物负载的纸芯片基底，本实施例中若fam-hg²⁺-aptamer溶液浓度过低检测信号低，浓度过高则可能超出仪器检测范围，因此100nm为最佳浓度；

将上述7组fam-hg²⁺-aptamer/ocnps复合物负载的纸芯片基底置于荧光分光光度计中，测试各检测区域荧光光谱图，读取最大发射波长位置的荧光强度f；设定氧化碳纳米颗粒溶液的浓度为0时，空白样强度记为f0，以荧光猝灭效率（f0-f）/f0为纵坐标，以氧化碳纳米颗粒溶液浓度为横坐标作图，得到氧化碳纳米颗粒浓度与荧光猝灭效率关系图，如图2所示。从图2中可以看出最佳的氧化碳纳米颗粒浓度为50ug/ml。

实施例3绘制汞离子检测工作曲线

本实施例采用实施例2中最佳氧化碳纳米颗粒浓度制备fam-hg²⁺-aptamer/ocnps复合物负载的纸芯片基底，制备过程与实施例2相同，不再赘述。

向上述fam-hg²⁺-aptamer/ocnps复合物负载的纸芯片基底中分别加入5.0ul不同浓度的汞离子溶液（浓度分别为：0，1，2.5，5，10，30，60，100nm），置于暗处室温反应10min，氧化碳纳米颗粒纸芯片检测汞离子的原理图如图3所示。

将反应好的纸芯片置于荧光分光光度计中，测试各检测区域荧光光谱图，读取最大发射波长位置的荧光强度f’；设定汞离子的浓度为0时，空白样强度记为f0’，以荧光恢复程度（f’-f0’）/f0’为纵坐标，以汞离子浓度为横坐标作图，见图4，即为汞离子检测工作曲线。

实施例4氧化碳纳米颗粒纸芯片用于自来水中汞离子检测

氧化碳纳米颗粒纸芯片用于自来水中汞离子检测，包括以下步骤：

以自来水为分散介质，配制浓度为100nm的汞离子溶液；向fam-hg²⁺-aptamer/ocnps复合物负载的纸芯片基底中加入5.0ul上述配制的汞离子溶液，置于暗处室温反应10min；将上述纸芯片置于荧光分光光度计中，测试各检测区域荧光光谱图，读取最大发射波长位置的荧光强度f¹；设定汞离子的浓度为0时，空白样强度记为f0¹，计算荧光恢复程度（f¹-f0¹）/f0¹，带入工作曲线中得到汞离子的浓度为99.78nm。已知自来水中加入的汞离子浓度为100nm，本发明的检测方法的回收率可以达到99.78%，三次重复测量的标准偏差为9.6%，检测结果的准确性和重复性良好。

实施例5氧化碳纳米颗粒纸芯片用于湖水中汞离子检测

氧化碳纳米颗粒纸芯片用于湖水中汞离子检测，包括以下步骤：

将湖水用0.22μm滤膜过滤除去不溶物和漂浮物，以其作为为分散介质，配制浓度为100nm的汞离子溶液；向fam-hg²⁺-aptamer/ocnps复合物负载的纸芯片基底中加入5.0ul上述配制的汞离子溶液，置于暗处室温反应10min；将上述的纸芯片置于荧光分光光度计中，测试各检测区域荧光光谱图，读取最大发射波长位置的荧光强度f²；设定汞离子的浓度为0时，空白样强度记为f0²，计算荧光恢复程度（f²-f0²）/f0²，带入工作曲线中得到汞离子的浓度为105.9nm。已知湖水中的汞离子浓度为100nm，本发明的检测方法的回收率可以达到105.9%，三次重复测量的标准偏差为11.0%，检测结果的准确性和重复性良好。

实施例6氧化碳纳米颗粒纸芯片用于河水中汞离子检测

氧化碳纳米颗粒纸芯片用于河水中汞离子检测，包括以下步骤：

将河水用0.22μm滤膜过滤除去不溶物和漂浮物，以其作为为分散介质，配制浓度为100nm的汞离子溶液；向fam-hg²⁺-aptamer/ocnps复合物负载的纸芯片基底中加入5.0ul上述配制的汞离子溶液，置于暗处室温反应10min；将上述的纸芯片置于荧光分光光度计中，测试各检测区域荧光光谱图，读取最大发射波长位置的荧光强度f³；设定汞离子的浓度为0时，空白样强度记为f0³，计算荧光恢复程度（f³-f0³）/f0³，带入工作曲线中得到汞离子的浓度为109.6nm。已知河水中的汞离子浓度为100nm，本发明的检测方法的回收率可以达到109.6%，三次重复测量的标准偏差为10.7%，检测结果的准确性和重复性良好。

可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明的各种变化和改进，都属于本发明要求保护的范围内。