一种同时测定凹叶景天中多组分含量的方法与流程

本发明属于药品成份含量检测技术领域，具体涉及一种同时测定凹叶景天中多组分含量的方法。

背景技术：

凹叶景天(sedumemarginatummigo.)系指景天科景天属多年生肉质草本植物，又名为马牙半支、石板菜、打不死等。其始载于《本草纲目拾遗》，在《全国中草药汇编》、《湖南药物志》、《中国民族药志要》、《中华本草》、《中药大辞典》、《四川中药志》等均有收载，在我国主要分布于江苏、浙江、江西、福建、广西、湖北、四川等地区，其可全草供药用，味苦、酸，性凉，归心、肝经，具有清热解毒、止血和平肝的作用，可用于治蛇咬伤、黄疸、铁打损伤等病症。民间常以本品鲜品捣烂外敷，治疮疖、肿痛，内服用于吐血、便血、月经过多，在民间也有用其治肝炎等。其叶对生，先端圆而凹，近无柄，茎匍匐、易生根，喜于阴湿气候，主要生于较阴湿的水沟边、土坡岩石上、河边湿地等，因其具有生命力、适应性及耐受性强，耐寒、耐干旱，极易栽种等优势，在我国福建、安徽、广州、苏州、徐州等地区也相继引种栽培，具有一定的药用和观赏两用价值。

凹叶景天包含了没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷和木犀草素等多种组分，为了有效的研究凹叶景天的药物作用，需要对凹叶景天中各种组分进行含量测定，目前关于利用高效液相色谱法测定凹叶景天内没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷和木犀草素等多种组分含量的方法未见报道，也没有一种可以同时在同一色谱条件下测定多种组分含量的测定方法，导致了含量检测效率低的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于：针对上述存在的不足，提供一种同时测定凹叶景天中多组分含量的方法，可以同时在同一色谱条件下的方法测定凹叶景天乙酸乙酯部位干浸膏样品中没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷和木犀草素的各组分含量，具有操作简便快捷，准确、灵敏度高、含量检测效率高的优点。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种同时测定凹叶景天中多组分含量的方法，所述多组分含量测定方法是在同一色谱条件下，同时对凹叶景天药材中所含的没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素六种化合物的高效液相色谱含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

s1：制备对照品溶液：分别称取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、咖啡酸对照品、阿魏酸对照品、异槲皮苷对照品和木犀草素对照品，精密称定，加甲醇溶解并定容，然后分别制成没食子酸对照品溶液、原儿茶酸对照品溶液、咖啡酸对照品溶液、阿魏酸对照品溶液、异槲皮苷对照品溶液和木犀草素对照品溶液；

s2：制备凹叶景天供试品溶液：取凹叶景天药材粗粉，制成凹叶景天乙酸乙酯部位干浸膏样品置于干燥器中保存备用；取凹叶景天乙酸乙酯部位干浸膏样品0.1g，精密称定，置2ml离心管中，加甲醇超声溶解，转移至2ml容量瓶中并定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得凹叶景天供试品溶液；

s3：色谱条件：色谱柱为美国赛默飞thermoods-2hypersil色谱柱；流动相为乙腈-0.1％磷酸水、柱温25℃～35℃、流速0.8ml/min，采用波长转换，检测波长为255～355nm；

高效液相色谱法同时测定凹叶景天多组分含量：分别取没食子酸对照品溶液、原儿茶酸对照品溶液、咖啡酸对照品溶液、阿魏酸对照品溶液、异槲皮苷对照品溶液、木犀草素对照品溶液和凹叶景天供试品溶液，按所述色谱条件、进样量5μl、梯度洗脱时间130min，依法测定各样品峰面积，然后根据外标法计算凹叶景天乙酸乙酯部位干浸膏样品中没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素的含量。

进一步地，所述色谱条件为：流动相为乙腈-0.1％磷酸水、柱温30℃、流速0.8ml/min，采用波长转换，检测波长为：第0～13min的波长为260nm、第14～47min的波长为321nm、第48～65min的波长为255nm、第66～125min的波长为355nm。

进一步地，所述梯度洗脱按以下参数进行：流速0.8ml/min，流动相由b和d组成，其中b体积分数为0.1％磷酸，d为乙腈；

梯度洗脱以体积百分比计算为0min，b：97％、d：3％；20min，b：94％、d：6％；45min，b：88％、d：12％；65min，b：86％、d：14％；125min,b：65％、d：35％；130min,b：97％、d：3％。

进一步地，所述s1制备对照品溶液包括以下步骤：分别称取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、咖啡酸对照品、阿魏酸对照品、异槲皮苷对照品和木犀草素对照品，精密称定，加甲醇溶解并定容，分别制成单一的对照品储备液；精密吸取上述6个对照品储备液制成浓度分别为没食子酸0.2892mg/ml、原儿茶酸0.1721mg/ml、咖啡酸0.2189mg/ml、阿魏酸0.0926mg/ml、异槲皮苷0.5016mg/ml、木犀草素0.0625mg/ml，即得。

进一步地，所述s2凹叶景天供试品溶液包括以下步骤：取凹叶景天药材粗粉150g，用凹叶景天药材粗粉10倍量的70％乙醇浸泡30min，回流提取3次，纱布过滤，合并提取液，于旋转蒸发仪减压浓缩，即得到70％乙醇提取物浓缩液；再用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别对70％乙醇提取物浓缩液萃取6-7次，减压浓缩后将形成的石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和萃取后剩下的水层分别置于水浴锅中水浴加热挥发成浸膏，再分别进行减压干燥，制得石油醚部位干浸膏样品、乙酸乙酯部位干浸膏样品、正丁醇部位干浸膏样品及水部位干浸膏样品，分别置于干燥器中保存备用；取乙酸乙酯部位干浸膏样品0.1g，精密称定，置2ml离心管中，加甲醇超声溶解，转移至2ml容量瓶中并定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得凹叶景天供试品溶液。

进一步地，所述高效液相色谱法同时测定凹叶景天多组分含量包括以下步骤：

取不同产地的凹叶景天按s2步骤制成的乙酸乙酯部位干浸膏样品0.1g，精密称定，分别按s1和s2的步骤制备没食子酸对照品溶液、原儿茶酸对照品溶液、咖啡酸对照品溶液、阿魏酸对照品溶液、异槲皮苷对照品溶液和木犀草素对照品溶液和凹叶景天供试品溶液，按所述色谱条件、进样量5μl、梯度洗脱时间130min，依法测定各样品峰面积；根据外标法计算凹叶景天乙酸乙酯部位干浸膏样品中没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素的含量，测得不同产地凹叶景天乙酸乙酯部位干浸膏样品中没食子酸的含量为1.423～5.333mg/ml，原儿茶酸的含量为0.6927～3.200mg/ml，咖啡酸的含量为0.7938～4.100mg/ml，阿魏酸的含量为0.4717～0.7374mg/ml，异槲皮苷的含量为0.6893～9.375mg/ml，木犀草素的含量为0.0942～1.258mg/ml。

进一步地，所述步骤s2中3次回流提取的时间分别为2h、1.5h、1h。

进一步地，所述步骤s2中的水浴锅温度控制在60℃以下。

进一步地，所述步骤s2中的超声溶解速度为13000r/min，离心时间为10min。

综上所述，本发明由于采用了上述方案，具有以下有益效果：

1、本发明采用同一色谱条件同时检测凹叶景天中没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷和木犀草素各自的含量，操作简便快捷，时间和试剂消耗低，成本低；回流提取处理样品、水浴加热挥发成浸膏更能让有效物质的释放，将有效成分从样品中溶解出来；通过选择合适的检测条件，使得该hplc测定凹叶景天中各组分含量的分离度、准确性、重复性、稳定性等都满足标准要求。

2、本发明提供的高效液相色谱法同时测定凹叶景天中多组分含量的方法，可快速、准确、同时测定6种组分(没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素)的含量，具有操作简便快捷，准确、灵敏度高、含量检测效率高的优点，填补了现有技术中缺乏高效液相色谱法测定凹叶景天中多组分含量方法的空白，为此领域的技术人员提供了应用基础和提示；此外，进行加样回收率试验，没食子酸平均回收率为98.43％、原儿茶酸平均回收率为97.67％、咖啡酸平均回收率为100.93％、阿魏酸平均回收率为102.26％、异槲皮苷平均回收率为96.95％、木犀草素平均回收率为98.51％，rsd值均小于2.76％，加样回收率良好。

3、本发明利用超声法提取凹叶景天乙酸乙酯部位干浸膏样品中的有效成分，采用hplc法测定凹叶景天乙酸乙酯部位干浸膏样品中没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素的含量，通过hplc实验对凹叶景天的成分进行了研究，并结合实际分离情况，确定了凹叶景天中含有没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素有效成分，亦为凹叶景天的深入研究及临床应用提供一定的科学依据。该方法具有良好的重现性(重复性试验中，供试品中没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素含量的rsd分别为0.13％、0.23％、1.55％、1.80％、1.28％、0.46％)，真正体现了药品的安全有效性和质量可控性。本发明方法检测精准，误差小(精密度试验中同一对照品混合液连续进样6次，分别测定各色谱峰峰面积，结果计算得没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素的rsd值分别为0.67％、0.65％、0.64％、0.67％、0.63％、0.57％)，可利用本申请的方法对凹叶景天的质量进行检测控制。

4、本发明的检测方法经过系统的方法学考察，分离度、准确性、重现性、稳定性等各种方法学指标均符合含量测定的要求，是一种可靠性高的测定方法。

5、本发明利用实验室常备的高效液相色谱仪，可清楚明了地分析不同来源、批次的凹叶景天药材中没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素的含量，能满足药理活性测试以及对该中药进行常规质量控制的需要。

附图说明

图1是凹叶景天供试品溶液色谱图(流动相：甲醇-水)；

图2是凹叶景天供试品溶液色谱图(流动相：乙腈-水)；

图3是凹叶景天供试品溶液色谱图(流动相：甲醇-0.1％磷酸)；

图4是凹叶景天供试品溶液色谱图(流动相：乙腈-0.1％磷酸)；

图5是凹叶景天供试品溶液色谱图(日本岛津色谱柱)；

图6是凹叶景天供试品溶液色谱图(大连依利特色谱柱)；

图7是凹叶景天供试品溶液色谱图(美国安捷伦色谱柱)；

图8是凹叶景天供试品溶液色谱图(美国赛默飞色谱柱)；

图9是凹叶景天供试品溶液色谱图(柱温：25℃)；

图10是凹叶景天供试品溶液色谱图(柱温：30℃)；

图11是凹叶景天供试品溶液色谱图(柱温：35℃)；

图12是凹叶景天供试品溶液色谱图(流速：0.6ml·min-1)；

图13是凹叶景天供试品溶液色谱图(流速：0.8ml·min-1)；

图14是凹叶景天供试品溶液色谱图(流速:1.0ml·min-1)；

图15是凹叶景天供试品溶液色谱图(流速：1.2ml·min-1)；

图16是凹叶景天供试品溶液色谱图(采集时间130min)；

图17是凹叶景天供试品溶液全波长扫描3d色谱图；

图18是凹叶景天供试品溶液扫描波长为214nm处色谱图；

图19是凹叶景天供试品溶液扫描波长为230nm处色谱图；

图20是凹叶景天供试品溶液扫描波长为260nm处色谱图；

图21是凹叶景天供试品溶液扫描波长为270nm处色谱图；

图22是凹叶景天供试品溶液扫描波长为300nm处色谱图；

图23是凹叶景天供试品溶液样品扫描波长为355nm处色谱图；

图24是凹叶景天供试品溶液样品扫描色谱图多波长转换；

图25是混合对照品溶液色谱图(1-没食子酸，2-原儿茶酸，3-咖啡酸，4-阿魏酸，5-异槲皮苷，6-木犀草素)；

图26是凹叶景天供试品溶液色谱图(1-没食子酸，2-原儿茶酸，3-咖啡酸，4-阿魏酸，5-异槲皮苷，6-木犀草素)；

图27是没食子酸标准曲线的绘制图；

图28是原儿茶酸标准曲线的绘制图；

图29是咖啡酸标准曲线的绘制图；

图30是阿魏酸标准曲线的绘制图；

图31是异槲皮苷标准曲线的绘制图；

图32是木犀草素标准曲线的绘制图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明一种同时测定凹叶景天中多组分含量的方法，作进一步说明。

一种同时测定凹叶景天中多组分含量的方法，包括以下步骤：

s1：制备对照品溶液：分别称取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、咖啡酸对照品、阿魏酸对照品、异槲皮苷对照品和木犀草素对照品，精密称定，加甲醇溶解并定容，然后分别制成单一的对照品储备液；精密吸取上述6个对照品储备液制成浓度分别为没食子酸0.2892mg/ml、原儿茶酸0.1721mg/ml、咖啡酸0.2189mg/ml、阿魏酸0.0926mg/ml、异槲皮苷0.5016mg/ml、木犀草素0.0625mg/ml，即分别得到没食子酸对照品溶液、原儿茶酸对照品溶液、咖啡酸对照品溶液、阿魏酸对照品溶液、异槲皮苷对照品溶液和木犀草素对照品溶液；

s2：制备凹叶景天供试品溶液：取凹叶景天药材粗粉150g，用凹叶景天药材粗粉10倍量的70％乙醇浸泡30min，回流提取3次，3次回流提取的时间分别为2h、1.5h、1h，纱布过滤，合并提取液，于旋转蒸发仪减压浓缩，即得到70％乙醇提取物浓缩液；再用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别对70％乙醇提取物浓缩液萃取6-7次，减压浓缩后将形成的石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和萃取后剩下的水层分别置于水浴锅中水浴加热挥发成浸膏，水浴锅温度控制在60℃以下，再分别进行减压干燥，制得石油醚部位干浸膏样品、乙酸乙酯部位干浸膏样品、正丁醇部位干浸膏样品及水部位干浸膏样品，分别置于干燥器中保存备用；取乙酸乙酯部位干浸膏样品0.1g(相当于生药材7g)，精密称定，置2ml离心管中，离心10min，加甲醇超声溶解，超声溶解速度为13000r/min，然后转移至2ml容量瓶中并定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得凹叶景天供试品溶液；

s3：色谱条件为：流动相为乙腈-0.1％磷酸水、柱温30℃、流速0.8ml/min，采用波长转换，检测波长为：第0～13min的波长为260nm、第14～47min的波长为321nm、第48～65min的波长为255nm、第66～125min的波长为355nm；

梯度洗脱按以下参数进行：流速0.8ml/min，流动相由b和d组成，其中b体积分数为0.1％磷酸，d为乙腈；

梯度洗脱以体积百分比计算为0min，b：97％、d：3％；20min，b：94％、d：6％；45min，b：88％、d：12％；65min，b：86％、d：14％；125min,b：65％、d：35％；130min,b：97％、d：3％；

高效液相色谱法同时测定凹叶景天多组分含量：取10个不同产地的按s2步骤制成的凹叶景天乙酸乙酯部位干浸膏样品0.1g，精密称定，分别按s1和s2的步骤制备没食子酸对照品溶液、原儿茶酸对照品溶液、咖啡酸对照品溶液、阿魏酸对照品溶液、异槲皮苷对照品溶液和木犀草素对照品溶液和凹叶景天供试品溶液，按色谱条件、进样量5μl、梯度洗脱时间130min，依法测定各样品峰面积，然后根据外标法计算10批凹叶景天乙酸乙酯部位干浸膏样品中没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素的含量。

同时测定凹叶景天中多组分含量的方法

1、色谱条件的考察

1.1不同流动相系统的考察

对凹叶景天供试品溶液考察了4个流动相系统，具体见表1，结果如附图1-4所示，当以甲醇/乙腈-水为流动相时峰形较丑，峰数目少，当以甲醇/乙腈-0.1％磷酸为流动相时，峰形尖锐，峰数目多，综合考虑主要色谱峰的分离度，表明乙腈-0.1％磷酸为流动相是最佳选择。

表1不同流动相系统的考察

1.2不同色谱柱的考察

本实验考察了4种不同厂家的色谱柱，具体见表2，结果表明不同厂家色谱柱的色谱图具有一定的差别，其中thermoods-2hypersil色谱柱能有效地分离主要化合物，且基线较平稳，峰形较好，故最佳色谱柱为美国赛默飞：thermoods-2hypersil色谱柱，参见附图5-8。

表2不同厂家色谱柱

1.3不同柱温的考察

本实验考察了3个不同的柱温25℃、30℃、35℃，根据分析图谱可知，不同的柱温条件下出峰时间、化合物的分离度都有差异，温度越低柱压越高，保留时间越长，25℃柱温下基线漂移，主要色谱峰分离度达不到要求，35℃柱温下主要色谱峰分离度也达不到要求，因此选择30℃柱温，此温度下色谱峰的分离度较好，柱压也在要求范围内，参见附图9-11。

1.4不同流速的考察

本实验考察了30℃下0.6ml·min^-1、0.8ml·min^-1、1.0ml·min^-1，1.2ml·min^-1的流速，结果表明，当流速越快，柱压越高，化合物的保留时间越短，因此，为了考虑主要化合物的分离度，0.8ml·min^-1的流速是最佳选择，该流速下各色谱峰有好的分离度，保留时间适宜，参见附图12-15。

1.5采集时间的考察

参见附图16可知凹叶景天供试品溶液色谱峰主要集中在130min以内，故选择记录时间为130min。

1.6检测波长的考察

据查阅文献，所需测的成分最大吸收波长在200-400nm范围内，本实验通过全波长扫描发现没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素分别在270nm、260nm、321nm、321nm、255nm、347nm波长时紫外吸收较佳。因此，本实验在考察214nm、230nm、260nm、270nm、300nm和355nm波长下色谱图的同时，还考察了多波长法下的色谱图，即检测波长在0～13min(260nm)、14～47min(321nm)、48～65min(255nm)、66～125min(355nm)，结果如附图17-24所示，表明多波长法能更好的分离主要的色谱峰，且基线也较平稳光滑，多波长法进行后续实验的测定是最佳选择。

2、最佳色谱条件的确定

综合上述考察结果，最终确定凹叶景天多组分含量测定的最佳色谱条件如表3所示，梯度洗脱见表4，其混合对照品色谱图及凹叶景天供试品溶液色谱图如附图25-26所示。

表3最佳色谱条件

表4梯度洗脱

3、标准曲线的绘制

称取没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷和木犀草素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定容，分别制成单一的对照品储备液，精密吸取上述6个对照品储备液制成浓度分别为没食子酸0.2892mg/ml、原儿茶酸0.1721mg/ml、咖啡酸0.2189mg/ml、阿魏酸0.0926mg/ml、异槲皮苷0.5016mg/ml、木犀草素0.0625mg/ml的混合对照品溶液，用甲醇逐级稀释成一系列不同浓度的混合对照品溶液，按表3所示项下的最佳色谱条件，进样5μl测定。以进样浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标进行线性回归，求得没食子酸的回归方程为y＝1.58e+004x+4.46e+004(r＝0.9997)；原儿茶酸的回归方程为y＝2.33e+004x+3.76e+004(r＝0.9997)；咖啡酸的回归方程为y＝3.40e+004x+4.59e+004(r＝0.9997)；阿魏酸的回归方程为y＝3.56e+004x+1.86e+004(r＝0.9996)；异槲皮苷的回归方程为y＝1.47e+004x+6.21e+004(r＝0.9998)；木犀草素的回归方程为y＝2.73e+004x+9.55e+003(r＝0.9997)。实验结果表明，没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素分别在15.20μg/ml～304.0μg/ml、8.700μg/ml～173.0μg/ml、11.40μg/ml～220.8μg/ml、4.900μg/ml～98.10μg/ml、24.20μg/ml～484.1μg/ml、3.200μg/ml～63.10μg/ml范围内呈良好的线性关系(n＝7)。结果见表5-10，附图27-32。

表5没食子酸峰面积(y)与进样浓度(x)的线性关系考察结果(n＝7)

表6原儿茶酸峰面积(y)与进样浓度(x)的线性关系考察结果(n＝7)

表7咖啡酸峰面积(y)与进样浓度(x)的线性关系考察结果(n＝7)

表8阿魏酸峰面积(y)与进样浓度(x)的线性关系考察结果(n＝7)

表9异槲皮苷峰面积(y)与进样浓度(x)的线性关系(n＝7)

表10木犀草素峰面积(y)与进样浓度(x)的线性关系考察结果(n＝7)

4、精密度试验

精密吸取同一对照品混合液各5μl，按表3所示项下的最佳色谱条件，连续进样6次，分别测定各色谱峰峰面积，结果计算得没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素的rsd值分别为0.67％、0.65％、0.64％、0.67％、0.63％、0.57％，表明仪器精密度良好，参见表11-16。

表11没食子酸精密度试验结果(n＝6)

表12原儿茶酸精密度试验结果(n＝6)

表13咖啡酸精密度试验结果(n＝6)

表14阿魏酸精密度试验结果(n＝6)

表15异槲皮苷精密度试验结果(n＝6)

表16木犀草素精密度试验结果(n＝6)

5、凹叶景天中多组分含量测定

取10个不同产地凹叶景天乙酸乙酯部位干浸膏样品0.1g，精密称定，分别按s1和s2的步骤制备没食子酸对照品溶液、原儿茶酸对照品溶液、咖啡酸对照品溶液、阿魏酸对照品溶液、异槲皮苷对照品溶液和木犀草素对照品溶液和凹叶景天供试品溶液，按表3所示项下的最佳色谱条件进样，依法测定各样品峰面积。根据外标法计算10批凹叶景天乙酸乙酯部位干浸膏样品中没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素的含量，结果显示10个不同产地凹叶景天乙酸乙酯部位中没食子酸的含量为1.423～5.333mg/ml，原儿茶酸的含量为0.6927～3.200mg/ml，咖啡酸的含量为0.7938～4.100mg/ml，阿魏酸的含量为0.4717～0.7374mg/ml，异槲皮苷的含量为0.6893～9.375mg/ml，木犀草素的含量为0.0942～1.258mg/ml，参见表17。

表1710个不同产地凹叶景天乙酸乙酯部位样品中6种成分的含量测定结果(mg/g)

6、稳定性试验

称取d1产地凹叶景天乙酸乙酯部位干浸膏样品中0.1g，精密称定，按s2步骤制备凹叶景天供试品溶液，按表3所示项下的最佳色谱条件分别于0h、2h、4h、15h、20h、22h、24h进样，依法测定各色谱峰峰面积，测得没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素的rsd值均小于1.80％，表明凹叶景天供试品溶液稳定性良好，具体见表18-23。

表18没食子酸稳定性试验结果(n＝7)

表19原儿茶酸稳定性试验结果(n＝7)

表20咖啡酸稳定性试验结果(n＝7)

表21阿魏酸稳定性试验结果(n＝7)

表22异槲皮苷稳定性试验结果(n＝7)

表23木犀草素稳定性试验结果(n＝7)

7、重复性试验

称取d1产地凹叶景天乙酸乙酯部位干浸膏样品6份，每份0.1g，精密称定，按s2的步骤制备凹叶景天供试品溶液，按表3所示项下的最佳色谱条件进样，依法测定各色谱峰峰面积，计算得没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素的rsd值均小于2.08％，表明该方法重复性良好，具体见表24-29。

表24没食子酸重复性试验结果(n＝6)

表25原儿茶酸重复性试验结果(n＝6)

表26咖啡酸重复性试验结果(n＝6)

表27阿魏酸重复性试验结果(n＝6)

表28异槲皮苷重复性试验结果(n＝6)

表29木犀草素重复性试验结果(n＝6)

8、加样回收试验

取已知含量的上述d1产地凹叶景天乙酸乙酯部位干浸膏样品共6份，每份0.05g，精密称定，按s1和s2的步骤制备对照品溶液和凹叶景天供试品溶液，每份凹叶景天供试品溶液分别加入没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷和木犀草素的混合对照品溶液，按表3所示项下的最佳色谱条件进样，依法测定并计算加样回收率，结果测得没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、异槲皮苷、木犀草素的rsd值均小于2.76％，表明加样回收率良好，具体见表30-35。

表30没食子酸加样回收试验结果(n＝6)

表31原儿茶酸加样回收试验结果(n＝6)

表32咖啡酸加样回收试验结果(n＝6)

表33阿魏酸加样回收试验结果(n＝6)

表34异槲皮苷加样回收试验结果(n＝6)

表35木犀草素加样回收试验结果(n＝6)

综上所述，本发明结合各系统适用性参数情况，并经方法学验证，该法精密度、稳定性、重复性、回收率等指标均良好，提高了凹叶景天的质量控制标准，为凹叶景天的再开发应用提供试验依据。

以上所述仅为发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。