一种测定土壤中癸甲氯铵的方法与流程

本发明涉及土壤检测领域，具体是一种测定土壤中癸甲氯铵的方法。

背景技术：

癸甲氯铵，又称二癸基二甲基氯化铵，属阳离子表面活性剂，其季铵阳离子能主动吸引并富集于带负电荷的细菌和病毒表面，阻碍细菌代谢，导致其膜的通透性发生改变。可广泛应用于各种养殖场、宠物诊所的舍内环境、饮水、动物体表、奶牛及母猪乳房、种蛋、各种设备及器具、车辆、工作人员的消毒。同时，由于癸甲氯铵大量使用，导致其随着废水、废渣排放，引起环境残留和污染，癸甲氯铵在环境中不易降解，尤其在厌氧条件(如污泥、沉积物等)可稳定存在，对环境生物产生毒性，并对人类健康产生威胁。建立各种环境介质中癸甲氯铵的分析方法，可为摸清该物质的环境残留水平，评估其环境损害水平提供技术基础。

癸甲氯铵在水和有机溶剂中均有较好的溶解性，其长碳链和n+离子的结构决定其更易于在土壤或沉积物中吸附。同时，其急性毒性lc50(96h)值为1.15mg/l，对水生生物具有潜在的威胁。目前关于癸甲氯铵的研究报道主要集中于杀菌、消毒等性能，或者生产配方等方面，对于水、土壤、植物中环境介质中的残留分析方法鲜有报道。冯璐等采用硫代硫酸钠预处理，以二氯甲烷为萃取剂，酸性蓝为指示剂，采用紫外分光光度法测定海水中的癸甲氯铵，方法的理论检出限在0.07mg/l；张向兵等采用反相高效液相色谱离子对色谱法检测消毒液中的癸甲氯铵，方法的理论检出限0.0052mg/l。以上两种方法均为液体中癸甲氯铵的检测，对于地表水中低于0.005mg/l的浓度，方法适用性不强；同时，土壤基质中大量腐殖酸和有机质的存在，将增大癸甲氯铵提取、净化过程的难度，因此，开发一种高效、直接的测定土壤中癸甲氯铵的方法已十分必要。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种简便、准确、高效地检测土壤中常见消毒剂成分癸甲氯铵的检测方法。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种测定土壤中癸甲氯铵的方法，包括如下步骤：

(1)去除待检测土壤中的杂质，进行真空冷冻干燥，以充分去除土壤中的水份；然后经研磨、过筛，得到检测土样；

(2)将甲酸、乙腈和超纯水混合得到酸性提取溶液，加入到步骤(1)得到的检测土样中，然后放入恒温摇床振荡提取，离心后过滤分离出上清液，滤渣重复上述提取分离步骤，合并两次上清液，并于4℃以下保存；

(3)在步骤(2)得到的上清液中加入florisil土，用涡旋仪将两者充分混合，然后离心后用0.22μm滤膜过滤，得到检测液；

(4)采用uplc-ms/ms测定步骤(3)检测液中的癸甲氯铵含量。

优选地，步骤(1)中，所述真空冷冻干燥的真空度控制在100pa以下，温度控制在-70℃以下冷冻干燥24h-48h；真空冷冻干燥前，将待检测土壤在-20℃以下冰箱中预冻24h以上；手动或经研磨机研磨后过20目筛，得到检测土样。在该步骤操作的同时，称取一定质量的土样，采用重量法测定含水率。相比阴干法，缩短了干燥时间；相比烘干法，避免目标物因高温产生挥发、分解等物理化学变化。

具体地，步骤(2)中，检测土样用量为干重20g，酸性提取溶液每次用量为20ml；

其中，乙腈的添加量为15ml；

若检测土样为红土，则甲酸添加量为2ml，剩余用超纯水补齐至20ml；

若检测土样为太湖水稻土，则甲酸添加量为0.01ml，剩余用超纯水补齐至20ml；

若检测土样为东北黑土，则甲酸添加量为0.02ml，剩余用超纯水补齐至20ml。

液体样品，如水样，通常采用液液萃取或固相萃取的方法进行提取或富集。而土壤样品基质复杂，含有腐殖酸、有机质等多种成分，同时目标物具有较强的土壤吸附性、中等极性和较大的水溶性，常规的有机提取溶剂不能有效地将目标物从土壤中解析出来，因此在本申请方法中加入弱有机酸，使其发生离子化，同时使用乙腈和水的混合溶剂增大了目标物的竞争解析能力，减少了土壤中其他杂质的析出，减轻后续的净化剂的负担；对比净化剂硅胶、中性氧化铝、硅藻土、psa等净化剂和florisil土的净化效果，发现psa的净化效果最差，中性氧化铝和硅藻土较差，硅胶和florisil土对极性杂质均有较好的净化去除性，但同时硅胶对目标物也具有较大的吸附性，导致回收率较差；相比之下，florisil对极性杂质净化能力强，对目标物具有吸附性低，测试回收率高。

优选地，步骤(2)中，所述恒温摇床振荡提取的温度为25℃，振荡频率为220～250rpm，振荡提取时间为30～60min。

步骤(2)中，所述离心转数≥8000rpm，离心时间为5～8min，温度控制在15～20℃；离心后采用定量滤纸过滤分离出上清液。

每次提取时，应采用合适的搅拌器材(如玻璃棒，不锈钢棒)将泥块状的土样搅散，使其与酸性提取溶液混合均匀后，再开始振荡提取。采用恒温振荡提取，提取条件温和，避免土壤中过多的杂质被解吸提取出来，对测试结果的干扰(改变目标物保留时间和色谱积分值，从而造成假阳性、测试结果偏差等不利因素)。

合并两次上清液后，并于4℃以下保存，避免因微生物降解作用导致癸甲氯铵的损失。

优选地，步骤(3)中，所述上清液与florisil土的体积质量比为2ml/0.1g。

步骤(3)中，所述离心转速≥10000rpm，离心时间≥5min。

具体地，步骤(4)中，uplc条件为：agilenteclipseplusc18：150mm×21mm×3.5μm，柱温25℃，进样量5μl；流动相为两相：a相为0.2vt％甲酸水溶液，b相色谱纯乙腈，梯度洗脱程序如下：

ms/ms条件为：esi离子源，正离子扫描模式，扫描频率20msec，定性离子对为304/91，定量离子对为304/212，其余参数如下：

有益效果：

本发明采用冻干预处理、酸化有机溶液振荡提取、florisil土净化，结合uplc-ms/ms检测，与以往的技术相比，本发明具有以下优点：

(1)简便、准确。本发明操作简便易行，样品冻干、振荡提取、涡旋净化等操作简便，目标物损失小，杂质净化效果好，结果准确度高。

(2)方法可靠，精密度高。采用添加甲酸的弱酸性有机溶液作提取剂，既增强了对土壤中癸甲氯铵的解吸作用，相比其他高酸度的试剂，可减少土壤中金属、矿物质等干扰物的析出率，改善基质效应对测定结果的影响，提高方法的精密度。

(3)灵敏、选择性强。采用高分辨的ms/ms检测器，可实现对样品中目标物的准确定性和定量；选择性强，相比gc-ms法测试更稳定，灵敏度更高。

(4)实用性强。调整提取液中甲酸、水的比例，可使本发明适用于其他类型土壤中癸甲氯铵的检出，或者沉积物中癸甲氯铵的检测，适用范围广。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为癸甲氯铵的标准溶液典型uplc-ms/ms谱图。

图2为红土以峰面积(横坐标)—浓度(纵坐标)建立的癸甲氯铵工作曲线。

图3为黑土以峰面积(横坐标)—浓度(纵坐标)建立的癸甲氯铵工作曲线。

图4水稻土以峰面积(横坐标)—浓度(纵坐标)建立的癸甲氯铵工作曲线。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。

以下实施例中，uplc条件为：agilenteclipseplusc18：150mm×21mm×3.5μm，柱温25℃，进样量5μl；流动相为两相：a相为0.2vt％甲酸水溶液，b相色谱纯乙腈，梯度洗脱程序如下：

ms/ms条件为：esi离子源，正离子扫描模式，扫描频率20msec，定性离子对为304/91，定量离子对为304/212，其余参数如下：

实施例1红土中癸甲氯铵的测定

选择我国典型的土壤类型-红土作为受试土壤，测定其中的癸甲氯铵。红土采自江西，手工筛出石子、植株根系、残体等杂物，放在冰箱内预冻24h，然后将样品放入真空冷冻干燥机中，-70℃，真空度1pa下冷冻干燥至土壤中水分全部去除，手动研磨土样，并过20目筛，在锥形瓶中称取20g/份备用。

在定量管中配制酸性有机提取溶液，分别准确移取15ml乙腈/份、2.0ml甲酸/份到定量管中，补充超纯水至20ml，充分将溶液混匀，倒入土样中，在25℃，220rpm下振荡提取30min；再以8000rpm转速离心混合物5min，将上清液过滤至另一锥形瓶中，残余土样再以上述同样方法进行二次提取、离心、过滤。两次提取的滤液合并到一起，定量移取2ml滤液到5ml离心管中，加入0.1gflorisil土，以涡旋混合仪充分混合净化后，以10000rpm的转速离心5min，上清液以0.22μm滤膜过滤，取1ml滤液按照设定的uplc-ms/ms参数，进行测定。

图1是以体积比1:1的乙腈水溶液作溶剂配制1mg/l癸甲氯铵标准溶液，经uplc-ms/ms测定后得到的色谱图。在本发明设定的条件下，癸甲氯铵标准溶液的色谱保留时间为3.33min，作为其定性检测的主要依据。

以红土空白样品的提取净化液作溶剂，按设定的系列浓度分别添加癸甲氯铵后，经uplc-ms/ms测定后得到的一系列的峰面积，将二者对应建立工作曲线，如图2所示。从图2中可以看出，按本试验方法，对于红土基质，所得癸甲氯铵峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性相关系数r>0.999，可用作样品定量的方法。

表1是采用本发明的方法测定红土中癸甲氯铵的准确度、精密度和灵敏度结果。其中，以添加回收率表示准确度，以相对标准偏差表示精密度，以检出限表示灵敏度。经过2个添加浓度，5个平行样品测试结果验证，方法添加回收率平均可达到70％以上，相对标准偏差5％以下，可检测样品中最低浓度为0.002mg/kg。基于上结果，本发明用于红土中癸甲氯铵测定，方法准确可靠，灵敏度高。

表1

实施例2黑土中癸甲氯铵的测定

选择我国典型的土壤类型-东北黑土作为受试土壤，测定其中的癸甲氯铵。黑土采自吉林，手工筛出石子、植株根系、残体等杂物，放在冰箱内预冻24h，然后将样品放入真空冷冻干燥机中，-70℃，真空度10pa下冷冻干燥至土壤中水分全部去除，手动研磨土样，并过20目筛，在锥形瓶中称取20g/份备用。

在定量管中配制酸性有机提取溶液：分别准确移取15ml乙腈/份、0.02ml甲酸/份到定量管中，补充超纯水至20ml，充分将溶液混匀，倒入土样中。在25℃，220rpm下振荡提取样品30min；再以10000rpm转速离心提取混合物8min，将上清液过滤至另一锥形瓶中。残余土样再以上述同样方法进行二次提取、离心、过滤。两次提取的滤液合并到一起，定量移取2ml过滤液到5ml离心管中，加入0.1gflorisil土，以涡旋混合仪充分混合净化后，以10000rpm以上的转速离心，上清液以0.22μm滤膜过滤，取1ml滤液，按照设定的uplc-ms/ms参数进行测定。

以黑土空白样品的提取净化液作溶剂，按设定的一系列浓度分别添加癸甲氯铵，经uplc-ms/ms测定后得到的一系列的峰面积，将二者对应建立工作曲线，如图3所示。从图3中可以看出，按本发明的方法，对于黑土基质，所得峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性方程相关系数r>0.999，可用作样品定量检测的依据。

表2是测定黑土中癸甲氯铵准确度、精密度和灵敏度的结果。经过2个添加浓度，5个平行样品测试结果验证，方法添加回收率可达到70％以上，相对标准偏差≤5％，可检测样品中最低浓度为0.002mg/kg。因此，本发明用于测试黑土中癸甲氯铵，方法准确可靠，灵敏度高。

表2

实施例3水稻土中癸甲氯铵的测定

选择我国典型的土壤类型-太湖水稻土作为受试土壤，测定其中的癸甲氯铵。太湖水稻土采自常州，手工筛出石子、植株根系、残体等杂物，放在冰箱内预冻24h，然后将样品放入真空冷冻干燥机中，-70℃，真空度100pa下冷冻干燥至土壤中水分全部去除，手动研磨土样，并过20目筛，在锥形瓶中称取20g/份备用。

在定量管中配制酸性有机提取溶液：准确移取15ml乙腈/份，0.01ml甲酸/份，补齐超纯水至20ml，充分将溶液混匀，倒入土样中。在25℃，220rpm下振荡提取样品30min；再以10000rpm转速、20℃下离心混合物8min，将上清液过滤至另一锥形瓶中。残余土样再以上述同样方法进行二次提取、离心、过滤。两次提取的滤液合并到一起，定量移取2ml过滤液到5ml离心管中，准确加入0.1gflorisil土，以涡旋混合仪充分混合净化后，以12000rpm的转速离心，上清液以0.22μm滤膜过滤，取1ml滤液按照设定的uplc-ms/ms参数，进行定性定量测定。

以水稻土空白样品的提取净化液作溶剂，按设定的系列浓度分别添加癸甲氯铵制成系列工作溶液后，经uplc-ms/ms测定后得到的一系列的峰面积，将二者对应建立工作曲线，如图4所示。从图4中可以看出，按本发明的方法，对于水稻土基质，所得峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性方程相关系数r>0.999，可用作样品定量检测的依据。

表3是测定水稻土中癸甲氯铵的准确度、精密度和灵敏度结果。经过2个添加浓度，5个平行样品测试结果验证，方法添加回收率可达到70％以上，相对标准偏差≤10％，可检测样品中最低浓度为0.002mg/kg。因此，本发明用于测试水稻土中癸甲氯铵，方法准确可靠，灵敏度高。

表3

实施例4

以实施例1中的红土作为受试土壤，癸甲氯铵添加量为0.01mg/kg，采用相同的方法步骤测定其中的癸甲氯铵。选用不同的净化剂：硅胶、中性氧化铝、硅藻土、psa和florisil土，分别设定各净化剂的添加量为0.01mg、0.05mg、0.1mg的梯度，测定不同净化剂添加量对回收率的影响，结果见表4。从表中数据可以看出：在每种添加剂设定的添加量梯度范围内，回收率基本是随着添加量的增加而增大；相同的添加剂量下，目标物的回收率比较结果是：psa<中性氧化铝<硅藻土<硅胶<florisil土。即florisil土为最佳的净化剂，且达到最佳回收率的添加量为0.1mg/kg，此时癸甲氯铵回收率达到76％，满足测试方法的要求。

表4

本发明提供了一种测定土壤中癸甲氯铵的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。