新型冠状病毒IgM/IgG抗体检测试剂盒的制作方法

新型冠状病毒igm/igg抗体检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及2019新型冠状病毒(sars-cov-2)igm/igg抗体检测试剂盒。


背景技术：

2.冠状病毒是自然界广泛存在的一个大型病毒家族，因其形态在电镜下观察似王冠而得名，主要引起呼 吸系统疾病。冠状病毒属于单股正链rna病毒，其遗传物质是所有rna病毒中最大的，分为α、β、γ和 δ四个属。
3.2020年2月11日，世界卫生组织将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“covid-19”。与此同时，国际病 毒分类委员会将新型冠状病毒命名为“sars-cov-2”。其属于β属，被列为第七类冠状病毒，其能引起病 毒性肺炎，主要临床表现为呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致 肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。病毒感染人后，机体会发生针对病毒的免疫反应并产生 抗体。igm抗体产生较快(5-7天)，数周或数月后逐渐消失；igg抗体产生较晚(10-14天)，亲和力更 高，可持续多年甚至终生存在。
4.根据目前研究结果，新型冠状病毒(sars-cov-2)的基因组排列顺序为5'-复制酶多聚糖蛋白(orf1/ab)
ꢀ-
结构蛋白[刺突糖蛋白(spike，s)-小包膜糖蛋白(envelope，e)-膜糖蛋白(membrane，m)-核衣壳 蛋白(nucleocapsid，n)]-3'。在冠状病毒中有一个关键的s蛋白(棘突蛋白，spike protein)，包含2 个亚单位：s1和s2。s1能够促进病毒与宿主细胞受体的结合，其含有一个重要的c端rbd结构域，正是 这个区域负责和受体结合。
[0005]
目前研究发现，虽然sars-cov-2与sars-cov、mers-cov同属于β-cov，其基因组与sars-cov基因 组表现出较高的序列同源性。但是，sars-cov-2基因组在两个核心位置具有高度变异性。一个是orf1ab 基因中的沉默变异，另一个为氨基酸orf8中的多态性。据预测，orf8中的突变会导致其两个变异体(即 orf8-l和orf8-s)，导致蛋白质的结构异常。在对sars-cov-2进行结构分析时发现，其刺突糖蛋白及核 衣壳蛋白发生突变。这提示sars-cov-2具有独特的基因组特征及结构特征，需要对其做进一步的研究。
[0006]
由于新型冠状病毒(sars-cov-2)的发现时间短，对其基因组特征及结构特征还在不断的研究当中。 目前的新型冠状病毒抗体检测试剂盒，也因研发周期短，检测灵敏度还有待进一步提高。


技术实现要素：

[0007]
为解决上述问题，本发明第一方面，提供一种新型冠状病毒igm/igg抗体检测试剂盒，能实现对新型 冠状病毒的igm抗体和igg抗体进行同时检测，并提高检测灵敏度。该试剂盒包括层析试纸，层析试纸包 括：样品垫、胶体金垫、层析膜、吸水材料和底板。其中，胶体金垫上包被了新型冠状病毒蛋白胶体金结 合物；层析膜上包被了鼠抗人igg单克隆抗体和鼠抗人igm单克隆抗体。其中，胶体金垫上的新型冠状病 毒蛋白胶体金结合物选自新型
冠状病毒s1蛋白胶体金结合物、新型冠状病毒s2蛋白胶体金结合物、新型 冠状病毒s蛋白胶体金结合物、新型冠状病毒rbd蛋白胶体金结合物、新型冠状病毒n蛋白胶体金结合 物中的2种或2种以上的任意组合。
[0008]
作为优选，本发明的新型冠状病毒igm/igg抗体检测试剂盒，胶体金垫上还包被了链霉亲和素胶体金 结合物、层析膜上还包被了生物素化bsa。
[0009]
作为优选，本发明的检测试剂盒中，层析膜上还包被了鼠抗人iga抗体，以实现对新型冠状病毒的 iga/igm/igg抗体进行检测。
[0010]
本发明的检测试剂盒，胶体金垫为单层结构、双层结构或者三层结构。若为单层结构，即，将两种以 上的胶体金结合物混合包被在该层胶体金垫上；若为双层结构或者三层结构，则在每层胶体金垫上包被1 种或1种以上的胶体金结合物。
[0011]
作为优选，本发明的新型冠状病毒igm/igg抗体检测试剂盒，在样品垫上包被了鼠抗人红细胞单克隆 抗体，不仅适用于血清、血浆样本，还适合全血样本的检测，拓宽了试剂盒的使用范围。
[0012]
作为优选，本发明的新型冠状病毒igm/igg抗体检测试剂盒，还包括样品稀释液。样品稀释液包括： 氯化钠：8.5～9.0g/l、np-40：20～40g/l。在研发过程中，申请人意外地发现，采用添加了np-40的生理 盐水对待测样品进行稀释后的检测结果，与没有添加np-40的生理盐水相比，检测灵敏度有明显提升。此 外，申请人还发现，np-40的添加量也对检测结果有影响，例如，np-40的浓度为50g/l时，检测得到的 假阳性率高；当np-40的浓度为20、23、25、28、30、32、34、35、37、39或40g/l时，检测效果佳。
[0013]
本发明提供另一种新型冠状病毒igm/igg抗体检测试剂盒，该试剂盒包括层析试纸，层析试纸包括： 样品垫、胶体金垫、层析膜、吸水材料和底板。其中，胶体金垫上包被了新型冠状病毒s蛋白胶体金结合 物和新型冠状病毒n蛋白胶体金结合物；层析膜上包被了鼠抗人igg单克隆抗体和鼠抗人igm单克隆抗 体。
[0014]
本发明中，“新型冠状病毒s蛋白胶体金结合物”，即胶体金标记的新型冠状病毒s蛋白，是指将新型 冠状病毒s蛋白与胶体金混合反应后的产物。“新型冠状病毒n蛋白胶体金结合物”，即胶体金标记的新型 冠状病毒n蛋白，是指将新型冠状病毒n蛋白与胶体金混合反应后的产物。
[0015]“新型冠状病毒s蛋白”、“新型冠状病毒n蛋白”、“新型冠状病毒s1蛋白”、“新型冠状病毒s2蛋 白”、“新型冠状病毒rbd蛋白”，可以是天然蛋白，也可以是通过常规基因工程技术表达后得到的重组 蛋白。新型冠状病毒(sars-cov-2)的氨基酸序列及其编码核酸序列已在ncbi上公开，其基因组排 列顺序为5'-复制酶多聚糖蛋白(orf1/ab)-结构蛋白[刺突糖蛋白(spike，s)-小包膜糖蛋白(envelope，e)
ꢀ-
膜糖蛋白(membrane，m)-核衣壳蛋白(nucleocapsid，n)]-3'。在冠状病毒中有一个关键的s蛋白(棘 突蛋白，spike protein)，包含2个亚单位：s1和s2。s1能够促进病毒与宿主细胞受体的结合，其含 有一个重要的c端rbd结构域，正是这个区域负责和受体结合。
[0016]
新型冠状病毒的重组蛋白已有许多市售产品，例如四川迈克生物新材料技术有限公司生产的重组新型 冠状病毒s蛋白(货号为xcl1830)，四川迈克生物新材料技术有限公司生产的重组新型冠状病毒n蛋 白(货号为xcl1829)，北京孚博生物科技有限公司生产的重组新型冠状病毒s蛋白(货号为fb2019his)。
[0017]
作为优选，本发明的新型冠状病毒igm/igg抗体检测试剂盒，胶体金垫上还包被了链霉亲和素胶体金 结合物、层析膜上还包被了生物素化bsa。“生物素化bsa”，是指生物素修饰的牛血清白蛋白或其衍生物。
[0018]
作为优选，本发明的新型冠状病毒igm/igg抗体检测试剂盒，胶体金垫为双层结构，在第一层胶体金 垫上包被了链霉亲和素胶体金结合物和新型冠状病毒n蛋白胶体金结合物；在第二层胶体金垫上包被了链 霉亲和素胶体金结合物和新型冠状病毒s蛋白胶体金结合物。申请人意外地发现，将胶体金垫设置成双层 结构，可以实现更好的显色效果，方便对检测结果的判定。
[0019]
作为优选，本发明的新型冠状病毒igm/igg抗体检测试剂盒，在样品垫上包被了鼠抗人红细胞单克隆 抗体，不仅适用于血清、血浆样本，还适合全血样本的检测，拓宽了试剂盒的使用范围。
[0020]
作为优选，本发明的新型冠状病毒igm/igg抗体检测试剂盒，还包括样品稀释液。样品稀释液包括： 氯化钠：8.5～9.0g/l、np-40：20～40g/l。在研发过程中，申请人意外地发现，采用添加了np-40的生理 盐水对待测样品进行稀释后的检测结果，与没有添加np-40的生理盐水相比，检测灵敏度有明显提升。此 外，申请人还发现，np-40的添加量也对检测结果有影响，例如，np-40的浓度为50g/l时，检测得到的 假阳性率高；当np-40的浓度为20、23、25、28、30、32、34、35、37、39或40g/l时，检测效果佳。
[0021]
本发明的另一个方面，提供一种新型冠状病毒igm/igg抗体检测试剂盒的制备方法，包括层析试纸的 制备：
[0022]
(1)样品垫的制备
[0023]
将鼠抗人红细胞单克隆抗体包被在玻璃纤维膜上，即得；
[0024]
(2)胶体金垫的制备
[0025]
将链霉亲和素与胶体金溶液进行混合反应，得到链霉亲和素胶体金结合物；
[0026]
将新型冠状病毒n蛋白与胶体金溶液进行混合反应，得到新型冠状病毒n蛋白胶体金结合物；
[0027]
将新型冠状病毒s蛋白与胶体金溶液进行混合反应，得到新型冠状病毒s蛋白胶体金结合物；
[0028]
将链霉亲和素胶体金结合物与新型冠状病毒n蛋白胶体金结合物进行混合，然后铺在第一玻璃纤维膜 上，即得第一层胶体金垫；
[0029]
将链霉亲和素胶体金结合物与新型冠状病毒s蛋白胶体金结合物进行混合，然后铺在第二玻璃纤维膜 上，即得第二层胶体金垫；
[0030]
(3)层析膜的制备
[0031]
在硝酸纤维素膜上分别划线鼠抗人igg单克隆抗体为检测线g、鼠抗人igm单克隆抗体为检测线m 和生物素化bsa为质控线c，即得层析膜；
[0032]
(4)层析试纸的组装
[0033]
将样品垫、胶体金垫、层析膜、吸水材料和底板进行组装，即得层析试纸。
[0034]
优选地，第一层胶体金垫中，链霉亲和素胶体金结合物与新型冠状病毒n蛋白胶体金结合物按照1:1～ 1:5的浓度比例进行混合，更优选地，混合比例为1:2.5；第二层胶体金垫中，链霉亲和素胶体金结合物与 新型冠状病毒s蛋白胶体金结合物按照1:1～1:5的浓度
比例进行混合，更优选地，混合比例为1:2.5。
[0035]
本发明中，表述“第一”、“第二”等仅用于描述目的，用以区分所限定的对象，而不以任何方式限定 次序或主次。
[0036]
本文中“新型冠状病毒”、“2019新型冠状病毒”、“sars-cov-2”、“2019-ncov”、“新冠病毒”可互 换，均为被国际病毒分类委员会命名为“sars-cov-2”的新型冠状病毒。
[0037]
有益效果
[0038]
与现有技术相比，申请人意外地发现，采用sars-cov-2冠状病毒n蛋白和sars-cov-2冠状病毒s蛋 白作为诊断抗原，对样品中的sars-cov-2冠状病毒igm抗体和igg抗体进行同时检测，并能提高检测试 剂盒的灵敏度、降低假阳性。并且，申请人还意外发现，在检测试剂盒中采用特殊的样品稀释液，能进一 步提高检测灵敏度、降低假阳性。
具体实施方式
[0039]
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈 现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
[0040]
以下具体实施例中涉及的试剂成分均为市售产品，例如，新型冠状病毒rbd蛋白购自四川迈克生物 新材料技术有限公司(货号：xcl1831)，新型冠状病毒n蛋白购自四川迈克生物新材料技术有限公司(货 号：xcl1829)，新型冠状病毒s蛋白购自四川迈克生物新材料技术有限公司(货号：xcl1830)，鼠抗人 igg单克隆抗体购自四川迈克生物新材料技术有限公司(货号：xcl1833)，鼠抗人igm单克隆抗体购自四 川迈克生物新材料技术有限公司(货号：xcl1832)。
[0041]
实施例1本发明的新型冠状病毒igm/igg抗体检测试剂盒
[0042]
新型冠状病毒igm/igg抗体检测试剂盒，包括层析试纸：样品垫、胶体金垫、层析膜、吸水材料和底 板。其中，样品垫上包被了鼠抗人红细胞单克隆抗体；胶体金垫有两层，其中一层胶体金垫上包被了链霉 亲和素胶体金结合物和新型冠状病毒n蛋白胶体金结合物，另外一层胶体金垫上包被了链霉亲和素胶体金 结合物和新型冠状病毒s蛋白胶体金结合物；层析膜上有检测线g、检测线m和质控线c，分别包被鼠抗 人igg单克隆抗体、鼠抗人igm单克隆抗体和生物素化bsa。
[0043]
该检测试剂盒还包括样品稀释液，该样品稀释液包括：氯化钠：8.5～9.0g/l、np-40：20～40g/l。
[0044]
该检测试剂盒的使用方法如下：
[0045]
(1)取10μl血清/血浆样本或20ul全血样本到样品稀释液中，充分混匀5s～10s；
[0046]
(2)垂直滴加2～3滴到样品垫上，室温放置；
[0047]
(3)10分钟～15分钟内观察结果，15分钟后判定无效：
[0048]
若样本中有抗新冠状病毒抗原的igg抗体或者igm抗体，则先与试纸胶体金垫上胶体金标记的冠状病 毒蛋白(抗原)反应，随侧向流层析效应在层析膜上移动，样本中抗冠状病毒抗原的igg抗体与胶体金标 记的蛋白(抗原)形成的反应复合物至检测线g与鼠抗人igg单克隆抗体反应，形成抗原抗体胶体金复合 物，呈整齐的红色条带g，根据红色条带有无判定结果；样本中抗新冠状病毒抗原的igm抗体与胶体金标 记的蛋白形成的反应复合物
再至检测线m与鼠抗人igm单克隆抗体反应，形成抗原抗体胶体金复合物，呈 整齐的红色条带m，根据红色条带有无判定结果；胶体金标记的亲和素继续向前移动，至质控线c与生物 素反应，呈整齐的红色条带c，表示检测反应体系有效。
[0049]
实施例2本发明新型冠状病毒igm/igg抗体检测试剂盒的制备方法
[0050]
1、样品垫制备：
[0051]
取终浓度为0.1mg/ml的鼠抗人红细胞单克隆抗体溶液，按照40μl/cm2的处理量将其均匀倒在玻璃纤 维膜上，在室温下平衡约30min，然后于30～42℃下干燥6～24h，即得样品垫。
[0052]
2、胶体金垫制备：
[0053]
(1)以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径约40nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放 在烧杯内，用0.1m碳酸钾溶液调至ph10.0左右，按100ml胶体金溶液加入2.5mg链霉亲和素，混匀后， 反应30min，再加入5g/l的酪蛋白溶液(加入量为总体积的10％)，混匀后，反应30min。标记完成后， 10000r/m离心30分钟，弃上清，复溶至5ml，取50μl胶体金蛋白复合物，用超纯水稀释至od为1左右， 450nm～700nm波长扫描，记录最大吸收波长及其od值，并计算出胶体金蛋白复合物的原始od值；
[0054]
(2)以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm左右的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金 液放在烧杯内，用0.1m氢氧化钠溶液调至ph10.0左右，按100ml胶体金溶液加入2.5mg sars-cov-2冠 状病毒n蛋白，混匀后，反应30min，再加入5g/l酪蛋白溶液(加入量为总体积的10％)，混匀后，反应 30min。标记完成后，10000r/m离心30分钟，弃上清，复溶至5ml，取50μl胶体金蛋白复合物，用超纯 水稀释至od为1左右，450nm～700nm波长扫描，记录最大吸收波长及其od值，并计算出胶体金蛋白复合 物的原始od值；
[0055]
所需配制的金垫包被液中新冠病毒n蛋白胶体金蛋白复合物浓度为od＝10左右，链霉亲和素胶体金蛋 白复合物浓度为od＝4左右，计算出新冠病毒n蛋白胶体金蛋白复合物，链霉亲和素胶体金蛋白复合物和 复溶液的用量，将其混合均匀，按1ml溶液铺22cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置于干燥间，温 度30～42℃，湿度小于30％，干燥6～24小时；
[0056]
(3)以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放 在烧杯内，用0.1m氢氧化钠溶液调至ph10.0左右，按100ml胶体金溶液加入1.5mg sars-cov-2冠状病 毒s蛋白，混匀后，反应30min，再加入5g/l的酪蛋白溶液(加入量为总体积的10％)，混匀后，反应30min。 标记完成后，10000r/m离心30分钟，弃上清，复溶至5ml，取50μl胶体金蛋白复合物，用超纯水稀释 至od为1左右，450nm～700nm波长扫描，记录最大吸收波长及其od值，并计算出胶体金蛋白复合物的原 始od值；
[0057]
所需配制的金垫包被液中新冠病毒s蛋白胶体金蛋白复合物浓度为od＝10左右，链霉亲和素胶体金蛋 白复合物浓度为od＝4左右，再计算出新冠病毒s蛋白胶体金蛋白复合物、链霉亲和素胶体金蛋白复合物 和复溶液的用量，将其混合均匀，按1ml溶液铺22cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置于干燥间， 温度30～42℃，湿度小于30％，干燥6～24小时。
[0058]
3、层析膜制备：
[0059]
用30mm、ph10.0的tris缓冲液将生物素化bsa稀释至终浓度为2mg/ml作为质控线
包被液，用10mm、 ph 7.4的磷酸盐缓冲液将鼠抗人igg单克隆抗体和鼠抗人igm单克隆抗体分别稀释至终浓度为2mg/ml和 2mg/ml，作为鼠抗人igm单克隆抗体检测线包被液和鼠抗人igg单克隆抗体检测线包被液，将上述包被液 分别加入划膜仪的泵中，取300mm
×
60mm/15mm+25mm+20mm规格的pvc底板，将中间25mm宽的不干胶撕开， 将25mm宽的硝酸纤维素膜的下沿缘中间不干胶下端的刀线处进行粘贴，固定在pvc底板上作为层析膜， 在层析膜上分别划线鼠抗人igg单克隆抗体检测线g、鼠抗人igm单克隆抗体检测线m和质控线c，划线 后将层析膜置于干燥间，温度20℃，湿度小于30％，干燥5小时；
[0060]
4、层析试纸组装：
[0061]
带有检测线g、检测线m和质控线c的层析膜靠近c线一侧粘贴18mm的吸水纸，吸水纸上边缘与pvc 底板上边缘对齐，用裁切机将包被重组n蛋白的胶体金垫切成5mm长条，压膜下边缘1mm粘贴，再将包被 新冠病毒s蛋白的胶体金垫切成5mm长条，压包被新冠病毒n蛋白金垫3-4mm粘贴，样品垫裁切成17mm 长条，下端对齐pvc底板下边缘粘贴，将装好的大板用切条机切成4mm宽试纸条，即得。
[0062]
实施例3试剂盒的实验室性能检测
[0063]
对实施例2制备得到的检测试剂盒进行性能考察。
[0064]
1、最低检出限
[0065]
用3份sars-cov-2-igg企业最低检出限参考品检测，l1应为阳性，l2可为阳性或阴性，l3应为阴性；
[0066]
用3份sars-cov-2-igm企业最低检出限参考品检测，l1应为阳性，l2可为阳性或阴性，l3应为阴性。
[0067]
2、阳性参考品符合率
[0068]
用5份sars-cov-2-igm/igg企业阳性参考品检测，p1、p2、p3的igg抗体为阳性，p4、p5的igm抗 体为阳性，阳性符合率应不低于5/5。
[0069]
3、阴性参考品符合率
[0070]
用20份sars-cov-2-igm/igg企业阴性参考品检测，igg抗体符合率应不低于20/20，igm抗体阴性参 考品符合率应不低于18/20。
[0071]
4、重复性
[0072]
用1份sars-cov-2-igm/igg企业重复性参考品平行检测10次，igm抗体/igg抗体应均为阳性且显色 一致。
[0073]
5、抗干扰能力：常用于病原体感染治疗的药物，如α-干扰素、扎那米韦、利巴韦林、奥司他韦、帕 拉米韦、洛匹那韦、利托那韦、阿比多尔、左氧氟沙星、阿奇霉素、头孢曲松、美罗培南、妥布霉素等对 本试剂盒测定无明显影响。
[0074]
6、钩状(hook)效应：本试剂盒对高浓度特异性igm抗体和igg抗体无明显的钩状效应。
[0075]
7、试剂盒的灵敏度和特异性
[0076]
将实施例2制备得到的检测试剂盒，对64例确诊的阳性血清样本进行检测，检测结果见表1。
[0077]
表1
[0078][0079]
将实施例2制备得到的检测试剂盒，对60例正常人血清样本进行检测，检测结果见表2。
[0080]
表2
[0081][0082][0083]
从表1和表2中可见，本发明的检测试剂盒具有较高的灵敏度和特异性。
[0084]
对比例
[0085]
对比例1
[0086]
与实施例1相比，本对比例的区别仅在于：胶体金垫为单层结构，包被有链霉亲和素胶体金结合物和 冠状病毒n蛋白胶体金结合物，其余均相同。
[0087]
对比例2
[0088]
与实施例1相比，本对比例的区别仅在于：胶体金垫为单层结构，包被有链霉亲和素胶体金结合物和 冠状病毒s蛋白胶体金结合物，其余均相同。
[0089]
对比例3
[0090]
与实施例1相比，本对比例的区别仅在于：胶体金垫仍然为双层结构，将冠状病毒s蛋白替换成冠状 病毒rbd蛋白，其余均相同。
[0091]
将对比例1-3中的试剂盒，分别对64例确诊的阳性血清样本进行检测，检测结果见表3。
[0092]
表3
[0093][0094]
从表3中可见，对比例1-3的检测试剂盒的阳性检出率有待进一步提高。