一种分离湿地植物根表铁膜内外层物质的方法与流程

本发明涉及物质分离技术领域，特别涉及一种分离湿地植物根表铁膜内外层物质的方法。

背景技术：

开采后的矿业废弃地通常含有大量铁硫化物(如黄铁矿fes2)，其氧化酸化会导致酸性废水产生以及土壤酸化、重金属释放等问题，同时由于氮、磷、钾等营养元素供应不足，使得普通植物难以定植。湿地植物能通过根部通气组织把大气中的氧运输到根表，从而使根际处于一个相对氧化的状态，在植物根际形成微氧化环境，使淹水条件下土壤中存在的还原性物质fe²⁺发生氧化，生成主要成分为铁氧化物的根表铁膜。与铁硫循环相关的氧化(好氧)、还原(厌氧)微生物可存在于湿地植物根表微氧化环境。根系泌氧作用引起根际氧浓度由根表向外逐渐降低，导致根表铁膜内外层产生氧浓度梯度，根表铁膜内层与外层的物质组成与微生物群落结构也会存在差异。因此，分离根表铁膜内外两层物质是探究根表铁膜内外层物质结构与微生物群落差异的前提，采用化学方法分步溶解根表铁膜内外层物质，能够为随后的物质分析与微生物测序，以及揭示湿地植物与微生物驱动的生物地球化学循环提供方法支持。

现有技术中，采集根表铁膜方案为：抖动并用去离子水冲洗湿地植物根部，去除根际土后，将植物根段置于装有pbs-s溶液(磷酸缓冲液：nacl：17.60g/l,na2hpo4:2.51g/l,nah2po4:0.47g/l,silwet-77:0.2ml/l)的离心管中，离心20-30min，获得根表铁膜全部物质。

现有技术的缺点：现有技术方案仅能一次性提取根表铁膜全部物质，无法区分根表铁膜内外层物质，且耗时较长，提取不彻底，铁膜残余较多，提取效率低下。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种分离湿地植物根表铁膜内外层物质的方法，其为分离根表铁膜内外层物质提供可行性，并且能够缩短提取时间，减少铁膜残留，提高铁膜提取效率。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种分离湿地植物根表铁膜内外层物质的方法，包括如下步骤：

s1、用剪刀剪取湿地植物适量的根，抖去明土，然后用无菌水冲洗根部；

s2、冲洗后的根剪成3.5-4.5cm的根段，置于离心管中，向离心管中加入pbs-s磷酸缓冲液，涡旋5min，然后把根从离心管里取出来，离心管里的溶液离心后用于根表铁膜外层的微生物dna提取，离心管里的悬液中固体物质即为根表铁膜外层物质，对根表铁膜外层物质进行过滤收集或保存；

s3、涡旋后的根置于另一支新的离心管中，向离心管中加入0.5m羟胺-0.5m氯化氢溶液和直径3mm的无菌玻璃珠，然后手动上下晃动离心管5min直到根表面变得白净，本步骤离心管内所得悬液中固体物质即为根表铁膜内层物质，然后对根表铁膜内层物质进行过滤收集或保存。

进一步地，所述步骤s1中，冲洗次数为3次。

进一步地，所述步骤s2中，磷酸缓冲液包括如下含量的物质：17.60g/l的nacl，2.51g/l的na2hpo4，0.47g/l的nah2po4，0.2ml/l的silwet-77。

湿地植物根表存在致密铁膜，铁膜内外两层分别接触根表与土壤，它们的结构与微生物群落等特征存在不同，本发明的关键在于使用不同溶液，在不影响铁膜内外侧性质的前提下，采集根表铁膜内外层物质。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明首次提出依据氧浓度梯度将根表铁膜分离为内外两层，从而可以分别分析内外两层物质循环过程与微生物变化情况，便于更好的揭示氧浓度梯度对根际铁硫循环的影响。

附图说明

图1为本发明步骤s1中去离子水冲洗后的根表电镜成像图；

图2为本发明步骤s2中pbs-s溶液清洗后的根表电镜成像图；

图3为本发明步骤s3中0.5m的盐酸羟胺和玻璃珠清洗后的根表电镜成像图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种分离宽叶香蒲根表铁膜内外层物质的方法，包括如下步骤：

用剪刀剪取宽叶香蒲适量的根，镊子夹住抖去明土，然后用无菌水冲洗3次，冲洗下来的土作为根际土置于离心管中，去离子水冲洗后的根表电镜成像图如图1所示；

将冲洗3次后的根剪成4cm左右的根段，置于另一支离心管中，向离心管中加入pbs-s溶液(磷酸缓冲液：nacl：17.60g/l,na2hpo4:2.51g/l,nah2po4:0.47g/l,silwet-77:0.2ml/l)，涡旋5min，然后把根从离心管里取出来，管里的溶液离心后用于根表铁膜外层的微生物dna提取，管内悬液中固体物质即为根表铁膜外层物质。pbs-s溶液清洗后的根表电镜成像图如图2所示；

涡旋后的根置于一支新的离心管中。向离心管中加入0.5m羟胺-0.5m氯化氢溶液和直径3mm的无菌玻璃珠。然后手动上下晃动离心管5min直到根表面变得白净，本步骤离心管内所得悬液中固体物质即为根表铁膜内层物质。0.5m的盐酸羟胺和玻璃珠清洗后的根表电镜成像图如图3所示。

图1-3所示的经过三个步骤的冲洗后根表残留物质电镜成像图，可以看出三个步骤分别获取根表不同区域的物质。图1到图2过程为根表铁膜外层物质提取，图2到图3为根表铁膜内层物质提取，由图3可以看出根表已完全洗净，根表组织清晰可见，由此可知根表铁膜已被采集完全。

通过电镜照片表示根表铁膜附着情况，去离子水冲洗冲下根际土，此时电镜照片看到铁膜整体附着于根表；pbs-s冲洗冲下铁膜外层物质，此时电镜照片看到铁膜内层物质附着于根表；最后一步冲洗冲下铁膜内层物质，此时电镜照片看到根表已洗净，可看到根表组织形态，无铁膜附着。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：

1.一种分离湿地植物根表铁膜内外层物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

s1、用剪刀剪取湿地植物适量的根，抖去明土，然后用无菌水冲洗根部；

s2、冲洗后的根剪成3.5-4.5cm的根段，置于离心管中，向离心管中加入pbs-s磷酸缓冲液，涡旋5min，然后把根从离心管里取出来，离心管里的溶液离心后用于根表铁膜外层的微生物dna提取，离心管里的悬液中固体物质即为根表铁膜外层物质；

s3、涡旋后的根置于另一支新的离心管中，向离心管中加入0.5m羟胺-0.5m氯化氢溶液和直径3mm的无菌玻璃珠，然后手动上下晃动离心管5min直到根表面变得白净，本步骤离心管内所得悬液中固体物质即为根表铁膜内层物质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s1中，冲洗次数为3次。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s2中，磷酸缓冲液包括如下含量的物质：17.60g/l的nacl，2.51g/l的na2hpo4，0.47g/l的nah2po4，0.2ml/l的silwet-77。

技术总结
本发明公开了一种分离湿地植物根表铁膜内外层物质的方法，包括S1、取根并抖去明土，然后用无菌水冲洗根部；S2、将根剪成根段置于离心管中，加入PBS‑S磷酸缓冲液并涡旋，然后把根从离心管里取出来，溶液离心后用于根表铁膜外层的微生物DNA提取，离心管里的悬液中固体物质即为根表铁膜外层物质；S3、涡旋后的根置于另一支新的离心管中，离心管中各加入0.5M羟胺‑0.5M氯化氢溶液和无菌玻璃珠，手动上下晃动离心管5min直到根表面变得白净，离心管内所得悬液中固体物质即为根表铁膜内层物质。本发明可分析内外两层物质循环过程与微生物变化情况，便于更好的揭示氧浓度梯度对根际铁硫循环的影响。

技术研发人员：迟浩淳;袁永强;王诗忠;仇荣亮;汤叶涛;晁元卿
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2020.04.03
技术公布日：2020.07.17