用于生物标志物的同时、多重、超灵敏和高通量光学检测的生物传感器平台和方法与流程

发明背景发明领域本发明涉及用于诊断应用的多重生物传感器(multiplexedbiosensor)，其对结合到固体感测器的生物识别层在它与包含靶分子(targetmolecules)的样本相互作用时所经历的物理变化进行检测并量化。相关技术的描述生物传感器利用一些生物分子(受体)特异性地结合到(识别)互补生物分子(配体)的能力。最典型的相互作用是互补核酸杂交和抗体/抗原结合。生物传感器在基础生物学研究、健康科学研究、药物发现和临床诊断中广受欢迎。根据所测量的物理变化，生物传感器可被分类为电化学生物传感器、机械生物传感器和光学生物传感器。在ep3153844中，提出了用于被沉积到表面上的蛋白质生物标志物的超灵敏检测的新颖的生物传感检测平台(biosensingplatform)。该生物传感检测平台的关键特征是：1)用特定类型的等离子体纳米粒子(纳米球、纳米棒、纳米立方体、纳米棱柱等)对每个生物标志物进行标记。2)将等离子体纳米粒子沉积到功能化悬浮多电介质基板(substrate)上，该功能化悬浮多电介质基板同时允许大大地增强来自等离子体纳米粒子的弱散射信号(光等离子体效应(optoplasmoniceffect))并对纳米粒子的质量进行称重。生物传感检测平台呈现基于光学检测和基于机械检测的双重转导机制(dualtransductionmechanism)，对于光学检测，等离子体纳米粒子用标准暗场显微镜被光学地检测，对于机械检测，等离子体纳米粒子的质量通过在纳米粒子的沉积之后测量悬浮的机械基板的共振频率的变化来被检测。这种生物传感检测平台是非常坚固耐用的，且已经用传染性的、炎症性的和肿瘤性的蛋白质生物标志物进行了测试，并且它呈现超高检测灵敏度，比在常规临床实践中的标准好高达六个数量级。然而，这个已知的生物传感检测平台的主要缺点是，其不可能：i.区分不同类型的纳米粒子，因为光信号在所有表面区域上被求平均，ii.区分开纳米粒子的聚集的不同状态(单体、二聚体、三聚体等)，iii.消除由基板和其他潜在杂质散射的光所引起的非特异性信号，iv.提取在表面上的纳米粒子的基本光谱特性，因为光学识别用标准暗场显微镜被执行。此外，机械转导不能产生关于单独纳米粒子的任何信息，因为只有传感器的整体机械特性可以用该平台来被测量。发明概述本发明提供了通过同时获得关于生物传感器的表面的空间和光谱分辨的信息来解决先前评述的技术问题的生物传感检测平台和方法。与以往的技术水平比较，利用这里描述的发明，可以：i)极大地增加生物传感器的信噪比，ii)显著地提高测定(assay)的特异性，iii)执行多个生物标志物的同时检测(多重检测)，以及iv)实现适合于诊断目的的高通量。重要的是，测量和分析所需的时间并不取决于在多重(multiplex)中使用的生物标志物的数量。本发明包括生物传感检测平台，其设置有生物传感器、宽带连续光谱照明源、用于检测由生物传感器散射的光的光学检测系统以及用于检测到的光信号的处理装置，其中光学检测器设置有能够同时执行散射光的空间和光谱分析的分光光度计的微米级密集阵列(micrometricallydensearray)，以及适于将生物传感器的表面的散射信号聚焦到照相机上的自动聚焦系统。该平台还设置有用于光学检测系统和/或生物传感器的平移装置，使得光学检测系统和生物传感器可以在三维中相对于彼此移动，并且其中处理装置适于从样本捕获空间和光谱分辨的光信号。来自所捕获的光信号的空间和光谱信息被处理，以便导出在生物传感器的表面上的散射粒子的位置，并从它们的光谱发射方面对它们进行表征。进一步的处理被执行以对每个粒子分类，特别是，i)确定粒子是否是用作生物传感器上的标签的纳米粒子之一，ii)在同时使用几个标签(多重)的情况下决定粒子属于哪个标签，iii)确定粒子的团聚(agglomeration)的状态(单体、二聚体等)，以及iv)丢弃未被识别为标签的所有其它粒子。对于在生物传感器上使用的标签中的每一个，对被识别为这种标签的粒子的数量进行计数。根据这些数量，在生物传感器上的每个样本中的生物标志物的浓度被量化，并作为输出结果呈现给平台的用户。附图简述为了完成描述并提供本发明的更好理解，提供了一组附图。所述附图示出了本发明的优选实施例，其不应被解释为限制本发明的范围，而仅仅作为本发明可以如何被实现的示例。图1是根据本发明的系统的示意图。图2示出了对应于具有分离的光学系统和照明系统或耦合的光学系统和照明系统的实施例的两个示意图。图3是本发明的方法的流程图。图4示出了三种不同类型的纳米粒子的三种不同的光谱指纹(spectralfingerprint)。图5是下列两个参数值的二维直方图：沿着水平轴表示的粒子的标准化亮度，以及沿着垂直轴表示的“红色”通道的相对贡献。图6将一个粒子类别的结果显示为“热图”，即，粒子编号被灰色编码(gray-coded)并以二维被表示，以便类似于在生物传感器上的位置。优选实施例的描述参考图1，本发明的生物传感检测平台包括：·用宽带连续光谱照射生物传感器的装置；·通过使用具有空间和光谱分辨率的光学检测器来从样本同时捕获空间和光谱分辨的光信号的装置；·将来自生物传感器的表面聚焦到光学传感器上的装置；·在三个空间坐标中移动生物传感器和/或光学头部(opticalhead)以修改它们的相对位置的装置。该系统包括能够捕获来自样本的散射信号的光学系统(os)、用于在打光角度(glazingangle)下照射样本的照明系统(is)、用于样本表面的同时空间和光谱分析的光学检测器(od)、用于样本表面的快速和自动聚焦的自动聚焦单元(af)以及能够在样本和光学扫描仪之间产生相对移动的机动化系统(ms)。照明系统(is)照明系统(is)由例如耦合到照明器装置的宽带vi-nir光源组成。术语“宽”意指光源呈现在可见光(400nm-700nm)中和/或在近红外光谱范围(从700nm到1000nm)中的非常宽的光谱发射。为了本发明的目的，宽带光源可以是卤钨灯、氙灯、超连续激光器或多个led或激光器的组合。照明器装置收集来自宽带光源的光，并以良好准直的光斑在打光角度下照射样本表面。光学系统(os)光学系统的主要目的是以非常有效的方式恢复来自样本表面的弱散射光。在本发明的优选设计中的光学系统(os)可以是基本上通过将光学物镜与镜筒透镜组合而获得的无限远校正光学系统(infinity-correctedopticalsystem)。尽管不是最佳的，但光学系统(os)可以被设计成只有一个光学物镜(有限远校正光学系统(finite-correctedopticalsystem))。如在图2的示意性描绘中所示的，光学系统(os)和照明系统(is)可以呈现分离或耦合的光路。根据所选择的几何配置(分离的或耦合的)，照明系统可以具有不同的几何配置。当照明系统(is)与光学系统(os)耦合时，照明装置可以实现或nelsonian照明器。相反，当is和os具有分离的光路时，照明系统可以使用打光角度照明器。以相同的方式，光学系统根据os和is相对于彼此的几何配置(耦合的或分离的)而呈现出显著的差异。当光学系统(os)与照明系统(is)耦合时，必须在光学系统(os)中实现能够使照明的光路与由样本散射的光的光路分离的一些元件。通常通过在光学系统(os)中安装特别为暗场显微镜应用设计的光学物镜和光束分离器(beamsplitter)来满足这一条件。相反，当光学系统(os)与照明系统(is)分离时，光学系统可以被设计有在明场应用中使用的标准光学元件。光学检测器(od)光学检测器捕获由光学系统收集的散射光，且它具有以高空间和光谱分辨率同时分辨来自样本表面的光信号的能力。为了同时执行样本的空间和光谱分析，光学检测器必须是光谱仪的微米级密集阵列。密集阵列给出了同时分析样本的不同空间位置的能力，而阵列的每个光谱仪允许在样本的每个点中的光谱分析。这里描述的光学检测器允许在空间和光谱坐标中同时分析样本。光谱仪的密集阵列可以被实现为i)与布置成镶嵌图案(mosaicpattern)的滤光器的阵列耦合的光电检测器的阵列，ii)与二向色滤光器耦合的光电检测器的多个阵列，或者iii)能够在同一空间位置处检测不同的光谱带的光电检测器的垂直堆叠的阵列。这些类型的光学检测器是用于以亚微米级分辨率(sub-micrometricalresolution)且在多个光谱带(通常至少2个且不大于30个)对样本进行同时空间和光谱分析的可行技术解决方案。优先地，应当使用具有高动态范围的光学检测器，允许仅用一次捕获来对与不同生物标志物相关联的纳米粒子进行成像，使得在使用多于一个生物标志物的情况下测量过程所需的时间不增加。自动聚焦系统(af)为了以快速且自动的方式聚焦样本表面，光学系统配备有自动聚焦系统(af)；样本的自动聚焦可以经由硬件或经由软件方案来实现。通常通过将激光投射到样本上(激光器是af的一部分)并用差分光电检测器收集从样本反射的激光来获得在文献中通常被称为主动(active)自动聚焦系统的基于硬件的自动聚焦系统。通过测量在光电检测器上的反射光的位置，可以量化样本表面离最佳聚焦位置的距离；因此，通过移动生物传感器、光学系统或它的一部分或两个硬件部件，利用能够修改在样本和光学扫描仪的头部之间的相对距离的一个或多个机动化载物台(motorizedstage)来恢复最佳位置。为了精确地聚焦样本表面，移动的典型分辨率需要远低于高分辨率光学物镜的景深(其对于100倍光学物镜通常可以达到200nm)。可以实现许多不同的技术解决方案，例如步进电机或dc电机或压电致动器。基于软件的自动聚焦系统在样本和光学头部之间的不同的相对距离处捕获样本的若干图像；可以用用于样本的光学分析的相同光学检测器或用专用光学检测器来执行图像的捕获。用专用算法分析不同的捕获图像，专用算法计算每个图像的对比度，并且可以量化样本表面离最佳聚焦位置的距离。最终用能够改变在样本和扫描仪的光学头部之间的相对距离的一个或多个机动化载物台来恢复最佳位置。平移装置(ms)因为测量需要在范围非常广的表面区域(数千cm2)上被执行，所以该系统还需要使用能够修改在生物传感器表面和光学系统之间的相对位置的机动化系统。可以用许多不同的实验配置来实现这项任务：a.样本沿着两个轴移动；光学系统保持静止。b.光学系统沿着两个轴移动；样本夹持器保持静止。c.光学系统和样本都被移动，例如，光学系统沿着一个轴，并且样本夹持器沿着第二轴。生物传感器(bs)生物传感器包括功能化基板和功能化纳米粒子。靶分析物(targetanalyte)是将从样本、特别是从生物样本检测到的要素(element)。靶分析物可以具有任何性质，例如有机或无机分子(药物、激素、胆固醇等)、生物分子(肽或蛋白质、核酸分子、生长因子、生物标志物等)、细胞(原生动物细胞、细菌细胞、真菌细胞、真核细胞)或细胞碎片(cellfragment)(细菌壁、细胞器(例如线粒体、细胞泡等))或病毒。使基板表面功能化的识别元素可以是可以识别并特异性地结合到靶分析物的任何元素。在这个意义上，识别元素可以是抗体(多克隆或单克隆抗体)、受体(诸如阿片样受体的细胞表面受体)、肽(例如阿片样肽)、蛋白质(例如凝集素(lectins))、碳水化合物(例如脂多糖o-抗原)、核酸(dna或rna序列)、细胞(原生动物细胞、细菌细胞、真菌细胞、真核细胞)、微生物或其一部分(例如细菌壁、细胞器(例如线粒体、细胞泡等))。在本发明的优选实施方案中，识别元素是抗体，更优选地是单克隆抗体。纳米粒子必须天然地具有等离子体特性。原则上，可以使用具有等离子体特性的任何类型的纳米粒子。因此，纳米粒子可以是例如金纳米粒子、银纳米粒子或等离子体超材料的纳米粒子，例如但不限于氮化钛和非化学计量氧化物(例如非化学计量的钒、钛和铝氧化物(non-stoichiometricvanadium,titaniumandaluminumoxides))。此外，纳米粒子可以采用多种形式或结构，例如纳米球、纳米棒、尖头状纳米棒(pointednanorod)、纳米壳、纳米笼/框架、中空纳米球、四面体、八面体、立方体、二十面体、菱形十二面体、凹面纳米立方体、二十四面体(tetrahexahedra)、钝角三角形双锥体(obtusetriangularbipyramids)、三八面体(trisohectahedra)和纳米棱柱。纳米粒子包括结合到其的至少一个检测元素，其可以特别结合到靶分析物。检测元素可以是可结合到靶分析物的任何类型的元素，因此原则上它的性质可以与识别元素的性质相同或相似。检测元素的功能是检测由固定在基板表面上的识别元素捕获的靶分析物的存在。因此，如果靶分析物存在于被分析的样本中，纳米粒子将仅借助于结合到其的检测元素来结合到基板。在这种情况下，识别元素可以结合到靶分析物，其然后由在夹层型布置中的检测元素来检测。在样本中的靶分析物的缺少导致识别元素不结合到靶分析物，且因此由检测元素进行的检测不会出现。总之，如果靶分析物存在于样本中，即使处于超低浓度，它也可以基于由每个单独纳米粒子产生的散射光谱被检测并量化。如果靶分析物不存在于样本中，则在基板上将没有可检测到的等离子体效应，因为纳米粒子将不存在。空间和光谱分辨的信息的分析光学系统和检测器连同平移装置一起用于获得关于生物传感器的空间和光谱分辨的信息。该信息在下文中被称为“图像”，记住这些“图像”可以包含比“典型”显微镜图像更多和/或不同的光谱信息。这些图像的分析提供在生物传感器上的每个样本中检测到的生物标志物的浓度。三个方面用来最小化在图像采集和结果之间的时间：1.分析的主要部分与图像采集并行地运行。2.并行地分析几个图像，因为分析方法允许对大多数分析独立地处理图像。3.实现高度有效的图像分析方法。分析的核心在于粒子的识别、分类和计数(见图3)。每个图像被读取，且如果需要，校正(背景、不均匀性等)被应用。粒子首先被定位在每个被分析的图像中，它们被表征(亮度、发射光谱等)，结果用于对它们分类(纳米粒子单体、簇(cluster)、灰尘等)，且最后它们按类别被计数。这些数字构成每个图像的主要结果；此外，导出另外的结果，其允许控制测量的质量(正确聚焦等)。根据每个图像中的不同粒子的数量，导出在相应样本中的相应生物标志物的浓度。优选实施例在第一实现中，基于led的白光源用于照明。选择光源，以便覆盖感兴趣粒子的散射光谱，对于球形金纳米粒子一般从蓝色(450nm)到红色(700nm)。因为较小的粒子散射较少的光并且它们的光谱朝着蓝色偏移，优选地，具有在蓝绿色区域中的较强发射的光源被选择以(部分地)补偿该效应。该补偿便于仅用光学检测器的一种设置来对所有粒子进行成像。为了实现光学系统的高光学分辨率和有效的光收集，使用具有高数值孔径(na)的暗场显微镜物镜，例如50x/0.8物镜。为了确保在整个视场(fov)上的在生物传感器上的粒子的精确表征和分类，使用在球面和色度上(chromatically)良好校正的物镜，例如平场复消色差器(planapochromat)。无限远校正物镜用于确保在与光学系统的另外的部件的组合中的灵活性。在第一实现中，使用具有rgb滤光器的ccd传感器；在第二实现中，使用具有rgb滤光器的cmos传感器；优选实施例利用具有布置成镶嵌图案的16个不同的光谱带的cmos传感器。可选地，与二向色滤光器耦合的多个单色ccd/cmos传感器可以被实现为光学检测器，或者甚至为基于foveon技术的传感器。从上文中，彩色照相机或具有多个光谱带的传感器的使用的明显的备选方案是单色照相机与外部滤光器(与一组固定滤光器；与单个但光谱可调谐滤光器等)或者与可变照明(开关光源；光源加上单色仪等)的组合。在所有这些备选方案中，照相机将为每个滤光器或照明设置拍摄一个图像，导致等效的图像堆叠。然而，由于在每个扫描位置处拍摄多于一个图像以及在图像之间改变滤光器或照明设置的必要性，这些备选方案明显较慢，导致不适合于诊断目的的非常低的通量。本发明的方法的优点是，所需的空间和光谱信息并行地而不是连续地被获得，以确保尽可能高的数据采集速度。重要的是，用于本发明的光学检测器需要同时执行样本表面的空间和光谱分析。本发明的平台允许在几分钟内测量大约100个样本的测定，这比传统的微量分光光度技术好至少10-100倍。传感器的几何尺寸被选择以近似地匹配光学系统(即，显微镜物镜)传送的图像的尺寸。在标准显微镜中，这个尺寸被称为“视场数”(fn)，且等于以毫米为单位的目镜(eyepieces)的光圈直径。如果传感器太小，它不能充分利用由物镜给出的可用视场，如果传感器太大，它只被部分地使用。因为光学系统的像差趋向于朝着图像边界增加，比fn稍小的传感器尺寸通常是确保高图像质量和因而粒子的可靠检测、表征和分类的最佳选择。在当前实现中，传感器对角线为约18mm，而fn为22mm。因为在多重通道中使用的不同类型的纳米粒子通常可以具有非常不同的散射效率并且因此将在亮度上显著改变(例如，30倍或更大)，所以具有大动态范围的传感器用于允许用单个照相机设置对所有粒子进行成像。大的动态范围通常要求具有足够大的图像像素并具有低噪声水平的传感器。显微镜物镜和光学检测器的组合被选择，以便允许以优于1μm(例如，一般在0.5μm和0.9μm之间)的光学分辨率对小于1μm(例如，具有在50nm和150nm之间的范围内的直径)的粒子进行成像，并导致在图像中的每粒子足够的像素(例如，每μm10个像素，指物平面(objectplane))。因此，光学检测器通常具有在4和12兆像素之间的像素和大约10×15mm2的尺寸(例如，属于所谓的1”-传感器类型)。在本发明中，所使用的光谱带的数量对图像采集或对数据分析有很少的影响；重要的是，所获取的图像可以被布置，以便具有在二维(图像像素)中的空间信息和在三维(图像层)中的光谱信息。在示例中(见图4)，假设包含具有三种不同的光谱指纹的三种类型的纳米粒子的生物传感器被成像。图像传感器传送五个图像层的堆叠，每个图像层对应于一个光谱范围。使用这五个层，将在每个图像像素处获得在右边所示的散射光谱的简化版本(仅五个数据点)。光谱层越多，散射光谱的再现就越好，且在不同粒子的光谱之间的区分就越容易。在下文中，rgb照相机作为示例用来解释在本发明中使用的图像分析方法；然而应当理解，即使我们在下文中谈到“颜色”或“颜色分量”,“颜色”总是指来自在每个图像像素处可用的所有层的完整光谱信息，以及“颜色分量”指来自这些层之一的数据。以相同的方式，空间和光谱信息的组合被称为“图像”，而与光谱层的数量无关。照相机的参数被调整以产生关于黑电平(blacklevel)和白电平(whitelevel)、白平衡和色彩再现的良好曝光的图像。设置被选择，使得用作生物标志物标签的纳米粒子可以被很好地成像，具有高于噪声水平并且低于饱和区域(通过调整灵敏度和曝光时间)的信号并且导致(通过调整颜色校正矩阵)在散射光谱(“颜色”)方面在不同粒子之间的良好区分。一般，待扫描的生物传感器包括对应于不同样本的不同区域，非常类似于多孔板(multi-wellplate)，每患者样本有一个孔。在生物传感器上的空间分辨率用两种手段来实现：光学检测器(即，照相机传感器)本身提供空间分辨率，以及生物传感器和光学系统相对于彼此移动。在当前实现中，生物传感器借助于双轴机动化载物台相对于静止光学系统移动。通常，对对应于同一样本的每个区域拍摄一个以上图像，然而，所拍摄的图像通常不完全覆盖样本区域。在一般扫描中，对于生物传感器的所有样本区域，每样本的所拍摄的图像的数量及它们在样本区域内的位置可以是相同的。然而，这不一定是最好的选择；也可以为每个样本单独地选择数量和位置，例如以便为具有低浓度的生物标志物的样本拍摄更多图像，以提高测量结果的统计稳健性。光学平台在对生物传感器的扫描期间拍摄的图像的总数的范围可以是一个到数千个。在单独图像中的数据采集的细分具有重要的优点：这些图像的分析(见相应章节)可以与扫描并行地被执行，即，同时光学平台继续采集图像。这允许平台的更高的样本通量。在扫描期间捕获的图像以常见的图像格式(例如tiff或jpeg)被保存，通常是具有每颜色通道8位的rgb图像。在大多数情况下，jpeg是优选的，因为得到的文件更小且可以更快地被写入和读取。另一方面，jpeg使用有损压缩，其尤其影响颜色表示。因为在生物传感器上的粒子的光谱表征是本发明的重要方面，所以只有相当轻微(mild)的jpeg压缩(即，高“质量因子”)用于最小化在颜色表示中的潜在失真。可选地：·图像可以以较大的颜色深度被保存为例如16位tiff图像，以避免在具有较低散射强度的粒子的情况下在图像中的伪像。·图像可以被保存为照相机原始数据。这保持照相机传感器的全动态范围(通常12-14位)以及在散射光的数量和由传感器测量的信号之间的线性相关性。·在具有多个光谱带的照相机的情况下，通常必须使用制造商的专有图像格式；除了raw格式，也可以基于tiff作为贮存器(container)。为了减少存储图像所需的时间和存储器的数量以及分析它们所需的时间，所捕获的图像被装进仓(bin)。通常，应用2x2的装仓，即，四个传感器像素产生一个图像像素。在像素之间的二次插值用于计算装仓的图像。与直接使用具有较少像素的传感器而没有图像的后续装仓的备选方案相比，该方法在颜色方面实现了在粒子之间的更好区分。因此，在当前实现中，当使用具有12mp的照相机时，图像装仓被应用；来自4mp照相机的图像没有被装仓，因为剩余的空间分辨率太低。通常，图像首先在本地存储在计算机的硬盘或类似存储装置上。可选地，可以将图像直接转移到在平台的计算机的网络内的不同计算机或存储系统。此外，如果替代地每个所捕获的图像的分析(见下面的段落)在图像仍然在计算机的存储器(ram)中的情况下被直接执行，则将图像存储到存储设备(例如，硬盘)可以被省略。对于来自扫描的图像的分析，可以使用由与matlab(在市场上从mathworks可买到)和gnuoctave(免费软件)兼容的脚本组成的分析程序。此外，可以例如使用直接连接到光学检测器的fpga(现场可编程门阵列)在硬件中实现部分或全部分析。这可以减少所需的分析时间。在实际分析之前，获取分析所需的数据采集(“扫描”)的参数；通常，它们从文件或数据库被读取，或者由用户手动地输入。这些参数应包括样本和在生物传感器上的单独图像的数量和位置、在样本中存在的生物标志物的类型、所使用的纳米粒子和生物传感器基板的类型、关于样本体积的信息、照明、以及照相机和图像捕获设置等。在当前实现中，该信息在扫描期间被自动保存在两个文本文件中；一个文件包含关于照相机、照明和自动聚焦的设置的信息，以及第二个文件包含关于在生物传感器上的样本的几何形状、在每个样本的区域内的图像的几何形状以及实际上被扫描的样本(即，所有样本或它们的子集)的信息。此外，必须存储在生物传感器上的样本和患者信息之间的对应关系(例如，在生物传感器上的哪个孔/样本对应于哪个患者id)；该信息与分析本身无关，但对于它的结果的诊断用途当然是必不可少的。在临床环境中，该信息通常存储在中央医院信息系统(his)中。在当前实施例中，信息由制备生物传感器的人编辑，并存储在网络驱动器上的文件夹中，它可以都由本发明的平台和分析软件两者从该文件夹读取。分析用光学平台获取的所有图像(或所有图像的子集)。在计算机上，该分析可以严格地顺序地被执行(每次一个图像)，或者并行地分析若干个图像(使用计算机的多个线程，例如，每线程一个图像)。通常，选择接近于在计算机上可用的最大值的并行线程的数量(＝内核的数量或逻辑处理器的数量)，以减少分析的总时间。在当前的实现中，在控制平台的数据采集的同一台计算机上运行分析。可以通过独立地分析不同的图像来获得在生物传感器上的感兴趣的信息的可能性是本技术的一大优点：这样，最耗时的任务(每个图像的分析)可以容易地并行化，并且该并行化可以以直接、有效且经济上可行的方式(具有更多内核的计算机、若干个cpu、在网络中的若干个计算机等)按比例增加。可选地，如果图像已经存储在网络中，分析可以在与控制平台的计算机不同的计算机上运行。同样，所有图像的分析可以在网络中的几台计算机之间分开，使得每台计算机分析图像的子集，或者存储和分析都可以使用云服务来完成。并行化可以针对图像(每线程一个图像)或者细分每个图像和并行地分析子图像。分析可以在整个生物传感器被扫描之后被执行，或者它可以与扫描并行地运行(例如，每当某个样本的所有图像被拍摄时)，使得结果在扫描之后尽可能快地被获得。在分析期间，对每个图像执行以下步骤：首先，从存储装置(或直接从计算机的存储器)读取图像数据。然后，如果相应的选项已由用户选择、或者默认地被激活、或者基于关于扫描的信息(所使用的照相机传感器的类型、成像参数等)被自动激活，则图像校正和/或变换然后被计算。执行图像的背景校正以调整黑电平。在来自本发明的平台的一般图像中，感兴趣的粒子在暗背景上表现为单独的小亮斑。根据基板、照相机传感器的类型和采集参数，该背景可能不显现为“黑色的”(即传感器值接近于零，“理想”情况)，而是“灰色的”(有或没有某种色调(tint))。(例如，基于所有像素的直方图)传感器值的估计允许对信号偏移和潜在色调进行校正。这简化了在分析的稍后步骤中的粒子的表征。然后针对亮度的潜在不均匀性来校正图像。这种不均匀性可能是由于照明、光收集、照相机传感器等。一般效应是图像的中心看起来比边界更亮。这些效应的校正对于在分析的稍后步骤中确保粒子的正确表征和分类可能是必要的。执行图像的伽马曲线的修改以调整动态范围。“伽马曲线”指图像中的像素值对检测到的光的实际(物理)光量的依赖性。在标准图像(jpeg，tiff等)中，该相关性是非线性的，使得随着增加的光，像素值比成比例地更慢地增加。在分析中，使用“伽马曲线”的反函数来校正该非线性相关性，使得所获得的像素值再次与散射的光量成比例。图像数据被平滑化以减少图像噪声。如上面所陈述的，实际光学分辨率通常比在照相机传感器上的像素间距更粗略(coarser)。这意味着(来自照相机传感器，由于低光强度等的)图像噪声可以通过平滑化来减少而不影响分辨率。图像噪声的减少再次提高了粒子的正确表征和分类。在标准彩色照相机的情况下，可以执行到不同颜色空间的变换，例如从rgb到hsv、l*a*b等，其可以简化来自粒子表征的结果的解释并导致粒子在颜色方面的更精确的区分。例如，l*a*b颜色空间包含光强度(l)的一个通道，而其他两个轴描述颜色；比较起来，rgb的通道都混合了颜色和亮度。如果所使用的颜色空间不包含专用亮度值(例如，在rgb中)，则通过对每个图像像素的颜色通道求和来计算这样的值。得到的灰度图像在下文中被称为“亮度图像”。该亮度图像通常被标准化，“0”和“1”对应于在给定图像格式中的最低和最高亮度等级(8位rgb：(0|0|0)→0,(255|255|255)→1)。如果所使用的颜色空间不包含相对颜色值，则可以通过将每个颜色通道除以通道的总和来对每个像素计算这种相对颜色贡献，例如，“红色”通道的相对贡献为rrel＝r/(r+g+b)。在使用具有多个光谱带的照相机的情况下，使用在传感器的每个波长范围中测量的散射强度来代替rgb值。在这两种情况下，分析方法不会明显改变；例如，rgb图像的三个值被简单地交换为代表不同波长区域的元素的阵列。元素的数量通常大于三，以获得光谱分辨率。然而，仅仅两个良好选择的波长的组合也可以是在不同粒子之间的精确区分的合适选择。潜在粒子然后在图像中被定位：考虑所使用的实际图像采集参数(光学和传感器分辨率、放大倍数等)，计算代表在来自光学平台的图像中的纳米粒子的一般形状的灰度测试图案。该形状可以由例如二维高斯函数、airy图案、简单的圆盘形状等表示。在当前的实现中，两个高斯函数的和(g1+(-g2))用于近似地匹配单独金纳米粒子的一般“圆环”形散射图案。作为一种变形，可以使用具有颜色的图案(例如，对于每个rgb分量或者对于具有多个光谱带的照相机的每个通道具有一个图案)而不是单个灰度测试图案。这可以在形状取决于波长(例如，绿色光谱范围中的高斯形和在橙色光谱范围中的圆环形)的情况下提高潜在粒子的正确识别。计算在亮度图像和测试图案之间的标准化二维互相关。该互相关图像具有接近于在形状上类似于测试图案的图像区域的值的值。不使用亮度图像，在测试图案和例如图像的颜色通道之一(或者几个通道的线性组合或者某个其他函数)之间的互相关也可以被计算。如果例如某个图案在一个通道中比在其他通道中更明显，这是合适的方法。为图像计算二元掩膜(binarymask)。对于具有高于某个阈值(例如，>0.6)的互相关值和在某个范围内(例如，>0.03且<0.98，即，高于噪声且低于饱和度)的相对亮度的像素，掩膜等于1(＝真)。所有其他像素为零(＝假)。不是使用二元掩膜(“0”或“1”)，而是可以使用具有连续值的掩膜，例如具有接近于1的值(values)的灰度掩膜(如果约束条件被良好地匹配)，以及具有接近于0的值的灰度掩膜(如果约束条件不匹配)，其间的所有值都是可能的。相关性和亮度的给定阈值仅仅是示例；基于实际测量结果，可以选择更合适的值，或者可以选择不同和/或附加参数(颜色、信号背景比等)的阈值。然后二元掩膜与互相关图像逐像素地相乘。在得到的灰度图像中，局部最大值(＝具有比所有直接相邻像素的值更高的值的像素)被定位。不使用二元掩膜与互相关图像的乘积，可以仅从二元掩膜导出潜在粒子的位置(具有值“1”的区域的位置)。不使用乘积，而是使用其他函数，例如，取互相关图像的平方等。这些局部最大值的位置被考虑为潜在的粒子位置。一种变形是，根本不使用与测试图案的互相关，而是使用基于阈值化技术(例如，高于某一背景值的一切都被考虑为潜在粒子)、基于图像的hough变换(例如，找到某一尺寸的圆形对象)等的粒子搜索。本发明的一个重要方面是每个粒子都被单独地表征；这允许在下面的分析步骤中对粒子进行分类。表征如下进行：a)最感兴趣的参数是每个粒子的亮度和散射光谱(“颜色”)。为了获得这些参数的平均值(即，在粒子的区域上求平均值)，相应的图像(亮度图像、具有相对颜色贡献的图像等)与合适的内核，例如具有接近于预期粒子尺寸的尺寸的二维高斯或与圆盘形图案卷积。b)在之前计算的潜在粒子位置处评估得到的经过滤图像。变形：(a.-b.)在待被表征的每个图像的粒子的数量是“低”的情况下，计算整个图像与内核的卷积以提取平均值可能在计算上是低效的。替代地，直接从图像提取在每个粒子周围的小区域并使用它们来导出平均值是更有效的。什么被考虑为“低”数值取决于成像参数、计算机的硬件和分析例程的实现。对于给定的设置，可以确定交叉点，使得一种或另一种方法可以自动被使用。c)感兴趣的附加特性是粒子的尺寸和形状，例如在亮度图像中的fwhm、与测试图案的相关性的程度以及在粒子的中心处的局部形状。后一个参数允许区分开圆环形状(＝在中心处凹陷(indention))和高斯(或类似)形状(＝在中心处最大)。在当前实现中使用的分析使用与在粒子的中心处的离散拉普拉斯成比例的值；这个选择允许基于图像与3x3内核的简单卷积的高效实现。d)感兴趣的其他附加特性是局部粒子密度(例如，基于最近邻距离)以及另外的光谱特性(例如，光谱成分的差异或比率)。e)作为结果，获得了每个潜在粒子的特性(它们的位置根据前面的步骤是已知的)。对于每个图像，该中间结果被表示为一个表，每个潜在粒子有一行，并且与特性一样多的列被导出，对于表示来自一个图像的表征步骤的结果的图解的示例见表1。表的每一行对应于一个粒子，x和y是它在图像中的坐标，i是它的亮度，以及r、g、b是相对颜色贡献。根据分析，为附加的表征参数添加更多的列。表1粒子分类粒子分类允许在分析中仅考虑对生物标志物最特异性的、并且对于多重通道是不可或缺的粒子。分类如下工作：a)如果需要，某些特性可以用于从分析的另外步骤排除粒子。例如，如果只对纳米粒子的单体感兴趣并且单体显示圆环形状作为区别特征，则该参数可以用于消除所有非圆环形粒子。b)基于先前实验的信息，不同类别的粒子基于它们的特性(亮度、“颜色”、形状、尺寸)被定义，例如，不同类别的粒子如下：(1)噪声(非常低的亮度)，(2)来自生物传感器制造的残留物(某些光谱图案)，(3)灰尘(不同的光谱图案)，(4)单独纳米粒子(不同的光谱图案、亮度、形状等)，(5)纳米粒子簇(二聚体、三聚体等，基于光谱图案、亮度)。对于这些簇，它们的亮度通常系统性地取决于相应的单独纳米粒子的亮度。这个依赖性用来改进分类。c)在多重通道的情况下(＝各种生物标志物的同时检测，每个生物标志物被标记有不同的纳米粒子)，定义额外的分类组来说明所使用的所有纳米粒子。d)必要的分类参数/规则(对应于每个类别的特性的哪些组合)可以(基于以前的测量结果)被预先给出，或者可以从待分析的测量结果本身中导出。在第二种情况下，该分析通常基于来自测量结果的所有图像的组合结果，而不是单独地基于每个图像(以改进统计结果并确保分类在所有图像当中是一致的)。e)分类基本上在于参数空间的分割。它的规则可以由用户定义(例如，手动分割)，或者可以被自动导出(例如，聚类搜索、k均值方法、分割算法、机器学习算法等)。在rgb照相机的情况下，分类的一个示例是，具有在范围[>0.1,<0.7]内的标准化亮度和在范围[>0.0,<0.33]内的“红色”颜色通道的相对贡献的所有粒子被考虑为来自制造的残留物。在当前实现中，如下导出分类规则：i.选择来自表征步骤的两个参数，并计算来自所有潜在粒子的这两个参数的二维直方图。在rgb照相机的情况下，通常使用标准化亮度和“红色”通道的相对贡献作为参数。ii.在这样的二维直方图中，相同类型的粒子(例如，单独纳米粒子)将形成一种“峰”(＝直方图的或者通常参数空间的“密集”区域)，因为它们中的全部具有相似的亮度值和颜色值。由于在单独粒子之间的差异以及由于噪声和/或在测量中的精度的缺乏，这些粒子是相似的而不是相同的。iii.在一般测量中，主“峰”对应于单独纳米粒子(单体)。基于来自先前测量结果的知识，可以自动识别在待分析的数据的直方图中的这个“峰”的位置，在给定的参数范围内搜索直方图的局部最大值，给定的参数范围例如，在[0.1,0.3]中的标准化亮度和在[0.35,0.45]中的“红色”通道的相对贡献。iv.一旦单体的这个位置是已知的，二聚体、三聚体等的位置就可以基于它们的亮度是单体的亮度的大约两倍、三倍等的知识来被估计。再次，估计结果用于指导实际局部最大值的搜索。v.单体、二聚体等的峰倾向于稍微重叠。为了将粒子分配到一个峰或另一个峰，定义在这两个峰之间的“边界”：例程对最好地定义在这两个峰之间的“谷”的(直)线进行搜索。vi.直方图中的在单体、二聚体、三聚体和纳米粒子的较大团聚(agglomeration)之间的位置和分隔线如上所述被识别。将粒子分类为例如二聚体的规则于是为，粒子的参数对应于在直方图中的在分离单体和二聚体的“边界(border)”的“右侧”(＝更高的标准化亮度)的点以及在分离二聚体和三聚体的“边界”的左侧(＝更低的亮度)的点。此外，数据点必须在关于“红色”通道的贡献的某个范围内(例如，大于0.34且小于0.6)。vii.在当前的实现中，纳米粒子被分类为单体、二聚体、三聚体和“更大团聚”(即，n≥4)。viii.除了针对单体、二聚体、三聚体和纳米粒子的更大团聚的自动适应的四个规则外，还为又四种类型的“粒子”定义固定规则：(1)噪音：具有低于0.1的标准化亮度且不属于纳米粒子的已经定义的组的所有“粒子”。(2)具有低亮度的残留物：“红色”低于0.33，亮度在范围[＞0.1，＜0.7]内。(3)具有高亮度的残留物：“红色”低于0.33，亮度在范围[＞0.7，＜1.0]内。(4)饱和粒子：包含具有等于1(＝饱和)的亮度值的图像像素。f)在纳米粒子批次之间有差异、照明变化、检测参数变化等的情况下，可以手动或自动适应分类。g)作为结果，所有潜在粒子的分类被获得。该结果的表示基于在表征步骤中生成的表，添加了具有分类结果的列，对于图解见表2，该图解示出了一个图像的来自分类步骤的结果。与表1相比，一列被添加到右侧，指示相应粒子所属的“类别”。在本示例中，类别用整数表示。表2xyirgb......类别12360.130.450.330.22417200.570.420.340.237181020.020.330.370.301...粒子计教这里描述的方法是一种“数字”技术：不是在生物传感器的某个区域上整合来自所标记的生物标志物的光信号，而是对检测到的所标记的生物标志物的实际数量进行计数。这使得该方法变得稳健得多并且独立于图像采集参数(例如照明的亮度或光谱)以及独立于生物传感器基板、纳米粒子等的变化。粒子计数如下工作：a)在每个分类组中的粒子的数量被计数。b)该“计数”可以是直接的(一个粒子，一个计数)或加权的(例如，用在一组中的每个粒子的亮度加权，或用正确分类的概率的估计等加权)。c)作为结果，为每个图像获得每分类组的粒子的数量。该结果可以被表示为表格，例如每图像一行和每个分类组一列。在多重通道的情况下，可能出现某些组在参数空间中显著重叠，例如不太亮的纳米粒子的簇(二聚体、三聚体等)与不同(更亮)纳米粒子的单体。在这种情况下，必须校正所计算的数字：a)只有一种类型的纳米粒子存在的测量结果用于计算在多重通道中使用的每种类型的纳米粒子的单体、二聚体、三聚体等之间的比率。b)对于这些粒子，计算它们中的哪个部分将落入属于所使用的另外类型的纳米粒子的参数空间的区域中。c)例如以最低亮度的单体开始，它们的数量用于估计相应二聚体、三聚体等的数量以及它们中有多少出现在对应于其他纳米粒子的参数空间的区域中。d)这些数字用于校正在某个区域中计数的粒子的数量，即，从未校正的计数中减去簇的数量。e)例如以增加亮度的顺序对剩余的纳米粒子重复该过程。变形：在直方图中的来自两种(或更多种)类型的粒子的密集区域之间的相当大的重叠的情况下，在它们之间的简单边界的分配的可能导致大量错误分类的粒子。这可以用可选的方法来减少：函数的适当的和用于拟合从所有图像获得的直方图或密度分布，对于每种感兴趣的粒子类型(在直方图中的“峰”)有至少一个分量。然后，对于每个图像的所有粒子(或对应于同一样本的所有粒子)，确定最好地匹配该图像(或样本)的直方图的这些分量的权重，并且使用这些权重来代替先前解释的粒子计数。质量控制为了评估总体测量质量且特别是每个图像的质量，·计算饱和出现于的图像的区域(即，标准化亮度接近于1的区域)，·导出代表图像的聚焦程度的值(例如，单独纳米粒子的平均测量尺寸)。除了一般的质量控制外，这些值还可以用于指导分析结果的计算，见以下步骤。总体分析结果在为同一样本获取多于一个图像的情况下，从同一样本的所有图像计算合适的统计值(例如，来自图像的值的平均值或总和、切尾均值(trimmedmean)、中值、分位数等)。在当前实现中，从属于同一样本的所有图像计算具有40％的对称切尾的切尾均值。在该值的计算中，与图像的质量相关的参数可以用于指导样本的最具代表性的图像的选择，例如省略具有饱和出现于的太大区域(例如，饱和区域>10％)那些图像或者没有很好地聚焦(例如，单体的fwhm>1μm)的那些图像。对于每个样本，计算与在样本中存在的生物标志物的数量相关的值。在多重通道的情况下，为每个生物标志物计算一个这样的值。该值的合适选择是用作标签的单独纳米粒子的数量。结果可以被呈现为每图像的粒子的平均数、粒子密度(例如，每mm2的粒子)或者对在样本区域内的粒子的总数的外推(外推是因为所拍摄的图像通常不覆盖整个区域)。后一表示是优选的，因为它解释起来最直接，意味着在生物传感器上使用的某个(已知)数量的患者样本中，该数量的生物标志物被检测到。呈现给用户的值例如基于它们的标准偏差或它们的变异系数(cv)被提供有它们的不确定性的适当度量。可以从来自同一样本的不同图像当中的变化和/或从在单独图像内的变化来估计这些不确定性。它们可以直接被报告为数字(n±δn个粒子)和/或用于指示结果是否是可靠的。如果样本的结果的不确定性高于某个限制，分析软件可以将这一发现反馈给生物传感检测平台。在这种情况下，扫描仪可以获取相应样本的附加图像以验证一致的结果是否可以被获得。作为另一步骤，分析结果可以直接指导整个扫描，即，对于每个样本，图像被获取，直到满足某些质量参数或者达到每样本的图像的时间或数量的上限为止。每个样本和每个生物标志物的总体结果可以是定性的(生物标志物的存在或缺乏)或定量的(生物标志物的浓度)。用于生物传感检测应用的等离子体纳米粒子的概念验证实验、多重空间和光谱分析：制备用于检测两种生物标志物的生物传感器，这两种生物标志物是复式(duplex)的白细胞介素il-6和il-10使用具有96个孔的生物传感器，且八种不同的生物标志物浓度(从1fg/ml到1ng/ml，加上阴性对照(negativecontrol))每个被重复12次。尺寸为120mmx80mm的基于si的多电介质基板用于生物传感器。在表面的硅烷化之后，使基于感兴趣的生物标志物的两种捕获抗体的1:1混合物的自组装单分子层生长。用可移除的上部结构(gracebio)来实现生物传感器在96个矩形孔中的划分。分别用il-6和il-10检测抗体来将具有100nm和80nm的直径的球形金纳米粒子(gnp)(nanopartz)功能化。制备两种类型的功能化gnp的1:1混合物。对于样本，缓冲溶液(pbst-25％fbs)被加有连续稀释的生物标志物(1:10)，得到从1ng/ml到1fg/ml的最终浓度，加上阴性对照。每孔使用200μl的溶液。表3中示出了样本的分布；浓度以g/ml为单位，“0”是阴性对照。每种浓度(行1…8)重复12次(列1…12)。表3在两个培养步骤(首先用样本，然后用gnp)之后，移除96孔上部结构。生物传感器基板被洗涤若干次，且最后用干氮气吹干。在该实验中，使用根据本发明的具有下列部件的平台：·暗场显微镜物镜50×/0.8·使用高功率白光led光源的暗场epi照明·具有12兆像素cmosrgb传感器的照相机·在以jpeg文件格式存储之前应用的图像的2×2装仓在生物传感器的每个孔中，拍摄了13×13个图像。总共16224个图像的采集时间为约100分钟，即几乎10,000个图像/小时。大量图像被选择以允许生物传感器的同质性的详细分析。对于感兴趣的主要结果——两种生物标志物的浓度，少得多的数量的图像将是足够的；例如3×3个图像的采集将只需要大约5:20分钟。显微镜物镜的放大倍数和照相机传感器的尺寸产生对应于在生物传感器上的208×284μm2的视场的图像；在装仓之后有1504×2056个像素，图像标度为每像素0.138μm。图像的分析在控制平台的其余部分的同一计算机上与数据采集并行地被执行。每当一个孔的所有169个图像被获取时，它们使用计算机的11个线程被并行地分析。因为图像的rgb格式不提供独立的亮度和颜色值，这样的标准化值首先被计算：·亮度＝rgb值的和，被标准化到范围0…1。·相对分量＝每个rgb分量除以rgb值的和；也被标准化到范围0…1。如上所述执行粒子的定位。使用由两个二维高斯函数之和组成的灰度图案以匹配来自单独金纳米粒子的发射的圆环形状；图案的fwhm(半峰全宽)对应于0.7μm的表观粒子尺寸。在图案和图像之间的至少0.6的相关性被用作潜在粒子的接受标准；0.03相对亮度的较低阈值被设置以定位具有小于gnp的亮度的10％的更潜在粒子(evenpotentialparticles)。为了获得每个粒子的强度和发射光谱的平均值，先前计算的图像层(标准化亮度、标准化相对颜色分量)用具有2.5像素的σ的高斯滤光器来平滑化，这对应于在具有大约0.8μm(即，接近于典型的表观粒子尺寸)的fwhm的图像区域上的平均化。在定位步骤中获得的位置处评估过滤层，得到每个粒子的特性的列表(每图像一个列表)。根据在前一步骤中获得的特性，选择标准化亮度和一个颜色分量以基于找到的所有粒子来计算二维直方图。两个最突出的“峰”对应于具有80nm(m80)和100nm(m100)的粒子的单体。也可以容易地区分相应的二聚体(d80,d100)，而较大的团聚基本上重叠(见图5)。在低亮度值(<0.1)处，可以看到被分类为“噪声”的粒子；来自制造过程的残留物可以由于它们的不同发射光谱(<0.33)而被区分；根据它们的亮度，它们被分类为两种类别(0.1…0.7低；>0.7高)。基于该直方图，分类规则被定义。分类规则应用于来自表征步骤的结果，使得粒子类别被添加到所发现的每个粒子的已经知道的特性中。基于在前一步骤中获得的分类，在每个图像中对在每个类别中的粒子进行计数。结果可以被显现为一个表，每图像一行以及每粒子类别一列。每粒子类别的结果还被显现为“热图”，即，粒子数被显示为具有类似于在生物传感器上的位置(见图6)的子图(axes)的彩色编码或灰度图像。一般，每孔多于一个图像(在该实验中为13×13个图像)被拍摄以改善计数统计结果。在这里，孔的图像的外部两行和两列在生物传感器的非敏感区域内。剩余的9×9＝81个图像在敏感区域内，并用于计算该孔的主要结果——平均值加上它的变异系数(cv)。在该实验中，在对81个图像应用40％的切尾之后，计算粒子的平均数量。一旦获得了将例如一种类型的gnp的单体的数量与样本中的感兴趣的生物标志物的浓度相关联的校准曲线，粒子计数就可以被转换成生物标志物浓度(见表4)。表4如在本文中使用的，术语“包括(comprises)”及其派生词(例如“包括(comprising)”等)不应在排除意义上被理解，也就是说，这些术语不应被解释为排除所描述和定义的事物可以包括另外的元件、步骤等的可能性。另一方面，本发明显然不限于本文描述的特定实施例，但还包括可以由本领域中的技术人员考虑为在如在权利要求中限定的本发明的总体范围内的任何变形(例如，关于材料、尺寸、部件、配置等的选择)。当前第1页12