本发明属于保健品领域，涉及一种维生素的检测方法，具体涉及一种多维片中维生素e的检测方法。
背景技术：
多维片是指含有多种维生素的保健品片剂，通常由多种维生素以及不同成分的辅料构成。为保证产品质量，多维片中不同种类维生素的准确检测是必须的。
一些多维片中含有维生素e，而维生素e性质较不稳定，易氧化，行业中一般固体原料均采用包埋技术进行抗氧化，检测时需要先破除包埋层，因此检测较为困难。现有技术中，维生素e的检测多采用气相色谱法(gc)或高效液相色谱法(hplc)，而在测定之前需要进行一定的预处理以便将维生素e从待测样品中分离出来。例如，国标(gb5009.82-2016)中规定了一种对食品所含维生素e进行检测的方法，其过程为先皂化再萃取，获得的有机相经浓缩、过滤后采用hplc进行测定。该方法步骤较多，操作繁琐，并且由于过程较长，对人员操作经验及技能有较高的要求，期间维生素e容易因氧化等原因发生含量变化，影响最终测定结果的精确性。不仅如此，对于多维片这类成分较为复杂的保健品来说，皂化萃取的预处理方法也难以有效地提取得到其中的维生素e，也使得最终的检测结果误差较大。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提出了一种能够快速且在前处理中能够有效地提取多维片中维生素e的检测方法，其特征在于，采用恒温酶解破坏蛋白质包埋层，再用有机溶剂直接提取进行预处理，包括如下步骤：步骤1，取多维片的试样加水润湿，加入预定量的蛋白酶摇匀获得混合样i；步骤2，将混合样i置于预定温度的水浴中超声预定时间，然后加入预定量的乙醇获得混合样ii；步骤3，将混合样ii在预定温度下继续超声预定时间，冷却至室温，用乙醇稀释获得混合样iii；步骤4，将混合样iii过滤后，采用hplc进行检测，并基于采用hplc检测的对照品进行计算得到试样中的维生素e的含量。
本发明提供的多维片中维生素e的检测方法，还可以具有这样的技术特征，其中，步骤2以及步骤3中的预定温度为60℃～65℃，步骤2以及步骤3中的预定时间均为20min。
本发明提供的多维片中维生素e的检测方法，还可以具有这样的技术特征，其中，步骤1中加入的蛋白酶与试样的体积质量比为1:1～5:1。
本发明提供的多维片中维生素e的检测方法，还可以具有这样的技术特征，其中，步骤1中所用的蛋白酶的酶活性≥3au-a/g。
发明作用与效果
根据本发明提供的种多维片中维生素e的检测方法，由于采用蛋白酶进行酶解前处理，且该酶解过程在60℃～65℃超声条件下进行，因此能够减小前处理过程中的维生素e损失，对操作人员经验要求较低，无转移萃取步骤，样品基本无损失，使得检测结果更加准确。另外，本发明的前处理过程操作简单，耗时短，能够实现多维片中维生素e的快速准确检测。
具体实施方式
以下说明本发明的具体实施方式。
以下各实施例以及对比例中，维生素e对照品从中检院采购所得，纯度为98％；蛋白酶的生产厂家为novozymes；其他试剂通过一般商业途径采购所得，未注明的条件和操作方法均参照现有的常规技术。另外，各实施例以及对比例所用的多维片为申请人自制，其主要成分包括：碳酸钙、硫酸锰、富马酸亚铁、硫酸锌、亚硒酸钠、硫酸铜、醋酸视黄酯、维生素d3、硝酸硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、氰钴胺、烟酰胺、叶酸、d-生物素、l-抗坏血酸、l-抗坏血酸钠、d-泛酸钙、dl-α-醋酸生育酚、dl-α-生育酚(维生素e)、微晶纤维素、辛烯基琥珀酸淀粉钠、麦芽糊精、二氧化硅、阿拉伯胶、交联羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁、白砂糖、羟丙基甲基纤维素、低取代羟丙纤维素、食用玉米淀粉、磷酸三钙、柠檬酸、柠檬酸钠、辛、癸酸甘油酯、包衣预混剂。
<实施例>
实施例的多维片中维生素e的检测方法包括如下步骤：
步骤1，取多维片的试样0.3g置于50ml棕色容量瓶中，加3ml水润湿，加入0.8g蛋白酶(novozymesalcalase3.0t)摇匀获得混合样i；
步骤2，将混合样i置于60℃～65℃水浴中超声20min，然后加入40ml的乙醇获得混合样ii；
步骤3，将混合样ii继续在60℃～65℃水浴中超声20min，冷却至室温，用乙醇稀释至刻度，充分摇匀获得混合样iii；
步骤4，将混合样iii用0.45μm滤膜过滤后，采用hplc进行检测，并基于采用hplc检测的对照品进行计算得到试样中的维生素e的含量。
本实施例中，步骤4的hplc条件如下：
高效液相色谱仪：安捷伦，型号1260；
色谱柱：安捷伦zorbaxsb-c18；
流动相：甲醇：水＝98：2
流速：1.0ml/min
进样量：100μl
检测波长：264nm
柱温：30℃
本实施例采用外标法进行含量计算，具体操作为：取维生素e对照品用上述hplc流动相稀释至样品相当浓度，然后采用上述hplc条件进行检测。将混合样iii过滤后经hplc检测得到的峰面积用外标法公式进行计算即可得到混合样iii中维生素e的浓度，再经换算即可得到多维片试样中的维生素e含量。
<对比例1>
对比例1的多维片中维生素e的检测方法包括如下步骤：
步骤1，取多维片的试样0.3g置于50ml棕色容量瓶中，加3ml水润湿，加入1.0ml蛋白酶(novozymesalcalase3.0t或酶活性≥3au-a/g的同种类酶)摇匀获得混合样i；
步骤2，将混合样i置于60℃～65℃水浴中加热20min，然后加入40ml的乙醇获得混合样ii；
步骤3，将混合样ii继续在60℃～65℃水浴中加热20min，冷却至室温，用乙醇稀释至刻度，充分摇匀获得混合样iii；
步骤4，将混合样iii用0.45μm滤膜过滤后，采用hplc进行检测，并基于采用hplc检测的对照品进行计算得到试样中的维生素e的含量。
本对比例中所采用的hplc条件与实施例相同。
如上，本对比例与实施例的区别主要在于，步骤2以及步骤3中，仅对混合样进行加热而不进行超声。
<对比例2>
对比例2的多维片中维生素e的检测方法包括如下步骤：
步骤1，取多维片的试样0.3g置于50ml棕色容量瓶中，加3ml水润湿，加入1.0ml蛋白酶(novozymesalcalase3.0t或酶活性≥3au-a/g的同种类酶)摇匀获得混合样i；
步骤2，将混合样i置于室温水浴中超声20min，然后加入40ml的乙醇获得混合样ii；
步骤3，将混合样ii继续在室温水浴中超声20min，用乙醇稀释至刻度，充分摇匀获得混合样iii；
步骤4，将混合样iii用0.45μm滤膜过滤后，采用hplc进行检测，并基于采用hplc检测的对照品进行计算得到试样中的维生素e的含量。
本对比例中所采用的hplc条件与实施例相同。
如上，本对比例与实施例的区别主要在于，步骤2以及步骤3中，仅对混合样进行超声时温度条件为室温。
<对比例3>
对比例3的多维片中维生素e的检测方法包括如下步骤：
步骤1，取多维片的试样0.3g置于50ml棕色容量瓶中，加3ml水润湿，加入1.0ml蛋白酶(novozymesalcalase3.0t或酶活性≥3au-a/g的同种类酶)摇匀获得混合样i；
步骤2，将混合样i在室温静置20min，然后加入40ml的乙醇获得混合样ii；
步骤3，将混合样ii摇匀后继续在室温静置20min，用乙醇稀释至刻度，充分摇匀获得混合样iii；
步骤4，将混合样iii用0.45μm滤膜过滤后，采用hplc进行检测，并基于采用hplc检测的对照品进行计算得到试样中的维生素e的含量。
本对比例中所采用的hplc条件与实施例相同。
如上，本对比例与实施例的区别主要在于，步骤2以及步骤3中，混合样不进行超声，也未被加热。
<对比例4>
对比例4的多维片中维生素e的检测方法包括如下步骤：
步骤1，取多维片的试样0.3g置于50ml棕色容量瓶中，加3ml水润湿，摇匀获得混合样i；
步骤2，将混合样i置于60℃～65℃水浴中加热超声20min，然后加入40ml的乙醇获得混合样ii；
步骤3，将混合样ii继续在60℃～65℃水浴中加热超声20min，冷却至室温，用乙醇稀释至刻度，充分摇匀获得混合样iii；
步骤4，将混合样iii用0.45μm滤膜过滤后，采用hplc进行检测，并基于采用hplc检测的对照品进行计算得到试样中的维生素e的含量。
本对比例中所采用的hplc条件与实施例相同。
如上，本对比例与实施例的区别主要在于，试样中不加入蛋白酶，即，不进行酶解。
<对比例5>
对比例5的多维片中维生素e采用国标方法检测，具体包括如下步骤：
皂化：称取适量经均质处理的多维片固体试样150ml平底烧瓶中，加入约20ml温水，混匀，再加入1.0g抗坏血酸和0.1gbht，混匀，加入30ml无水乙醇，加入10ml～20ml氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于80℃恒温水浴震荡皂30min，皂化后立即用冷水冷却至室温。
萃取：将皂化液用30ml水转入250ml的分液漏斗中，加入50ml石油醚-乙醚混合液，振荡萃取5min，将下层溶液转移至另一250ml的分液漏斗中，加入50ml的混合醚液再次萃取，合并醚层。
洗涤：用约100ml水洗涤醚层，约需重复3次,直至将醚层洗至中性(可用ph试纸检测下层溶液ph值)，去除下层水相。
浓缩：将洗涤后的醚层经无水硫酸钠(约3g)滤入250ml旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中，用约15ml石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发仪或气体浓缩仪上，于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚液剩下约2ml时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹至近干。用甲醇分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至10ml容量瓶中，定容至刻度。溶液过0.22μm有机系滤膜后供hplc测定。
本对比例中所采用的hplc条件以及含量计算方法与实施例相同。
<对比例6>
对比例6的多维片中维生素e的检测方法包括如下步骤：
步骤1，取多维片的试样0.3g置于50ml棕色容量瓶中，加3ml水润湿，加入0.8g蛋白酶(腾望20万酶活蛋白酶；其酶活性＜3au-a/g)摇匀获得混合样i；
步骤2，将混合样i置于60℃～65℃水浴中超声20min，然后加入40ml的乙醇获得混合样ii；
步骤3，将混合样ii继续在60℃～65℃水浴中超声20min，冷却至室温，用乙醇稀释至刻度，充分摇匀获得混合样iii；
步骤4，将混合样iii用0.45μm滤膜过滤后，采用hplc进行检测，并基于采用hplc检测的对照品进行计算得到试样中的维生素e的含量。
本对比例中所采用的hplc条件与实施例相同。
实施例的作用与效果
采用上述各实施例以及对比例的方法对同一批次的多维片进行检测，每个方法进行6个平行，检测结果如下表1。表1中，6个平行的检测结果数据之间采用分号隔开。
如表1所示，对于同一批多维片的试样，实施例的检测结果平均值为26mg/g。
与实施例相比，对比例1～对比例3的检测结果均在20mg/g左右，低于实施例的检测结果。其中，在加入蛋白酶后，对比例1未进行超声，对比例2未进行加热，对比例3则既未加热、又未超声，这三种处理方式的检测结果均低于实施例，说明酶解需要在超声以及加热的条件下进行。
与实施例以及对比例1～3相比，对比例4未加入蛋白酶，相当于完全不存在酶解处理，而该对比例4的检测结果在14mg/g左右，该结果不仅远低于实施例，也明显低于对比例1～3，说明尽管对比例1～3中酶解处理不充分，但该不充分的酶解处理仍然有一定的减小前处理过程中损失的作用。另外，实施例中采用了novozymesalcalase3.0t进行酶解，但经进一步实验发现，酶活性≥3au-a/g的同种类酶也可以达到相同的检测效果，其检测结果与实施例基本相同，在此不再赘述。
对比例5的检测方法采用了现有技术中国标的皂化前处理方法，其检测结果约为23mg/g，低于实施例的检测结果，说明实施例的前处理方法对于减小损失的效果好于现有技术中的皂化前处理方法。
对比例6的检测方法与实施例相同，不同的是其采用了酶活性＜3au-a/g的活性酶，其结果低于实施例的检测结果。该结果说明，采用更低酶活的蛋白酶进行处理时检测的回收率更低，其原因可能是酶活的大小与减小前处理损失的程度相关。相应地，采用实施例的novozymesalcalase3.0t或类似的酶活性≥3au-a/g的酶进行酶解处理，能够使前处理中的损失减小，其最终检测结果更符合多维片中维生素e的实际含量。
综上所述，实施例的多维片中维生素e的检测方法中，由于采用了酶活性≥3au-a/g的蛋白酶进行酶解前处理，且该酶解过程在60℃～65℃超声条件下进行，因此能够减小前处理过程中的维生素e损失，使得检测结果更加准确。另外，实施例的前处理操作主要为酶解、稀释、过滤，与现有技术中的皂化、萃取、浓缩等相比，操作更简单，耗时也更短，对操作人员经验要求较低，能够实现多维片中维生素e的快速准确检测。