一种新型冠状病毒2019-nCoVIgM/IgG抗体联合检测试剂盒的制备方法与流程

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒2019-ncovigm/igg抗体联合检测试剂盒的制备方法。

背景技术：

新型冠状病毒（2019-ncov），属于线性单股正链的rna病毒，能够引发急性呼吸性疾病。在结构上，30kb的单链rna基因组是其核心组成成份，并由带有棘突的包膜蛋白外壳所包裹而成。在感染机制上，病毒利用其棘突上的s蛋白与人肺ii型上皮细胞和小肠内皮细胞上的ace2蛋白结合，随后侵入宿主细胞。据相关权威机构报道，人类彻底消灭2019-ncov仍然需要相当长的一段时间，因此在特效药和疫苗没有研制成功并市场化之前，加大对人群的排查和检测，早发现早隔离，仍不失为当下应对疫情的最好方案。

针对2019-ncov的检测，基于反转录酶和pcr反应的实时荧光rt-pcr检测法，通过对样本的中的病毒rna含量进行直接检测，一方面能够更为真实的反应患者体内病毒含量，为制定治疗方案提供参考，另一面放使得检测窗口大大提前，为隔离和治疗赢得时间，因此该法仍然是诊断2019-ncov的黄金标准。然而此方法也存在一定的缺陷和局限性，如需要精密的荧光定量pcr仪，rna易降解问题以及逆转录酶和聚合酶的扩增效率问题容易导致假阳性和假阴性的出现，存在二次感染的风险。另一种基于高通量测序仪的基因测序方法也被应用于2019-ncov的检测，此法虽然具有高效精确等特性，但也因设备昂贵限制了其使用。在免疫层面上，病毒感染机体会诱发机体的自我保护机制，产生特异性抗体和淋巴细胞对病毒进行清理，来达到自我治愈的目的。在2019-ncov感染初期，约1周以内，机体会先产生igm抗体，随后会产生igg抗体，因此通过对血液中特异性igm和igg进行检测，并基于igm和igg的检测浓度，我们可以确定患者是否感染以及感染程度，若igm升高则可以判断为近期感染，若igg检测浓度增加则为既往感染，若igg和igm同时存在则可判断为极性感染和既往感染。基于此，开发高灵敏度的igg和igm的快检试剂盒，将具有极其重要的现实意义。

技术实现要素：

针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种新型冠状病毒2019-ncovigm/igg抗体联合检测试剂盒的制备方法。该试剂盒以抗原抗体间的特异性结合和乳胶层析法为基本原理，以硝酸纤维素膜为载体，分别在t1和t2线和c线处划线包被鼠抗人igg单克隆抗体、鼠抗人igm单克隆抗体和质控物组成层析膜。并通过对特异性抗原的选择、稀释液、乳胶制备等条件的优化，极大程度上提高了试剂盒检测灵敏度。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种新型冠状病毒2019-ncovigm/igg抗体联合检测试剂盒，其特征在于采用乳胶层析法，以pvc板为载体，由左至右依次搭接贴附样品垫、复合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸构成乳胶试纸条，装载于塑料卡壳中。

所述的一种新型冠状病毒2019-ncovigm/igg抗体联合检测试剂盒，其特征在于所述样品垫用于载入待测样品，所述复合物垫为将300nm羧基红色微球颗粒交联120ug/ml重组新冠病毒抗原得到的抗原-乳胶体复合物稀释喷涂在玻璃纤维素膜上，再利用20mmph7.4磷酸盐缓冲液清洗未交联重组新冠病毒抗原后的玻璃纤维素膜，所述重组新冠病毒用于特异性结合igg和igm，所述复合物垫呈红色。

所述的一种新型冠状病毒2019-ncovigm/igg抗体联合检测试剂盒，其特征在于所述硝酸纤维素膜包含3条线条，分别为涂有0.5mg/ml鼠抗人igg单克隆抗体的t1线，用于特异性结合人源igg，涂有0.5mg/ml鼠抗人igm单克隆抗体的t2线，用于特异性结合人源igm，涂有1.0mg/ml羊抗鼠单克隆抗体的c线，用于特异性结合鼠源igg，所述吸水纸用于回收多余未反应的液体。

一种新型冠状病毒2019-ncovigm/igg抗体联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将羧基红色微球颗粒与重组新冠病毒抗原交联制备抗原-乳胶体复合物；

（2）使用乳胶缓冲液对步骤（1）得到的抗原-乳胶体复合物进行稀释获得0.4w/v%的致敏乳胶溶液，使用喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维素膜上，再利用20mmph7.4磷酸盐缓冲液清洗未交联重组新冠病毒抗原，37℃干燥4小时，得到复合物垫，即刻使用或4-30℃密封避光保存备用；

（3）利用喷金划膜仪将0.5mg/ml鼠抗人igg单克隆抗体、0.5mg/ml鼠抗人igm单克隆抗体和1.0mg/ml羊抗鼠单克隆抗体分别划线于硝酸纤维素膜t1线、t2线和c线的位置上，37℃干燥4小时烘干制得硝酸纤维素膜，即刻使用或4-30℃避光密封保存备用；

（4）将样品垫、步骤（2）得到的复合物垫、步骤（3）得到的硝酸纤维素膜和吸水纸，从左至右依次搭接贴附到pcv板上，得到乳胶试纸条；

（5）将步骤（4）得到的乳胶试纸条装入塑料卡壳中，获得新型冠状病毒2019-ncovigm/igg抗体联合检测试剂盒。

所述的一种新型冠状病毒2019-ncovigm/igg抗体联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中抗原-乳胶体复合物的制备方法为：取20μl4%300nm羧基红色微球颗粒放入1.5ml离心管中，迅速混匀加入ph6.0，20mm的磷酸缓冲液，之后加入10μl10mg/mledc溶液和10μl10mg/mlnhs溶液，室温活化30min，充分混匀后12000g离心20min，弃上清，将活化后的微球用ph6.0，200μl含有0.01%sds20mm的磷酸缓冲液重悬，并加入120μg/ml重组新冠病毒抗原，室温下交联2h，之后12000g离心20min，弃上清，沉淀用ph8.0，1ml20mm磷酸盐缓冲液重悬，12000g离心20min后，弃上清，沉淀用ph8.0，1ml20mm磷酸盐缓冲液重悬，4℃存放备用。

所述的一种新型冠状病毒2019-ncovigm/igg抗体联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中乳胶缓冲液的制备方法为：在0.1mtris-hcl缓冲液中加入0.3%聚乙二醇20000、0.2%牛血清蛋白、0.2%脱脂牛奶、0.3%酪蛋白溶液、0.05%叠氮化钠、0.04%氯化钾和0.22%苷氨酸，充分溶解后，利用hcl调ph至8.0。

一种新型冠状病毒2019-ncovigm/igg抗体联合检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）前期准备，检测前将试剂盒中的乳胶试纸条、待测样本和0.5%bsa20mm磷酸盐缓冲液恢复至室温20-30℃，试剂盒即拆即用；

（2）检测，将乳胶试纸条放在实验台上，使用移液器吸取20μl待测样本，滴加到乳胶试纸条样品垫，再用滴瓶滴加2滴ph7.4的0.5%bsa20mm磷酸盐缓冲液到乳胶试纸条样品垫中，记时15min；

（3）观察结果，在15min时判定结果，若待测样本中含有新型冠状病毒2019-ncov的抗体则t1或t2线呈现红色条带，若待测样本中没有新型冠状病毒2019-ncov的抗体，则不发生结合即t1或t2线不显色，同时无论待测样本中有无新型冠状病毒2019-ncov的抗体，c线都应显示红色，若无则检测失败。

任一方法得到的新型冠状病毒2019-ncovigm/igg抗体联合检测试剂盒在新冠病毒2019-ncov检测上的应用。

本发明具有以下有益效果：本试剂盒采用乳胶层析法，以免疫捕获法检测人全血、血清或血浆中新型冠状病毒（2019-ncov）igm抗体和igg抗体。利用上述检测方法可以快速掌握机体免疫系统应对新冠病毒的情况，因此对患者的早期诊断和治愈后复查具有极大的参考意义。此外该检测试剂盒具有灵敏度高，特异性强，操作简单，不需要复杂设备，检测时间短等特点，将会为人类消灭新冠病毒提供重要的辅助作用。

附图说明

图1为新型冠状病毒（2019-ncov）igm/igg抗体联合检测乳胶体层析条结构示意图；

图2为新型冠状病毒（2019-ncov）igm/igg抗体联合检测乳胶体层析条检测结果示意图；

图3为新型冠状病毒（2019-ncov）igm/igg抗体联合检测乳胶体层析条优化前后检测结果。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

本发明一种新型冠状病毒2019-ncovigm/igg抗体联合检测试剂盒，具体制备步骤如下：

（1）选择最优重组新冠病毒抗原：选取了三个供应商的重组新冠病毒抗原分别为np-301（杭州博岳生物技术有限公司）、ag8#（菲鹏生物股份有限公司）、2019-ncov-01（深圳重链生物科技有限公司），并以初始浓度为2mg/ml的量用于制备乳胶试纸条，通过分析这四种试纸条对测试样本中igg和igm抗体的特异性结合程度和最低检测限，确定了重组新冠病毒抗原（杭州博岳生物技术有限公司）为最适重组抗原用于试剂盒制备。

（2）选择最适重组新冠病毒抗原浓度用于制备抗原-乳胶体复合物：选取80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、140μg/ml、160μg/ml五种浓度的重组新冠病毒抗原与乳胶体进行混合来制备抗原-乳胶体复合物，通过测试抗原-乳胶体复合物对测试样本中抗体igg和igm抗体的检测下线，确定120μg/ml为最适重组新冠病毒抗原使用浓度，并以此浓度用于试剂盒制备。

（3）制备抗原-乳胶体复合物，方法为：取20μl4%300nm羧基红色微球颗粒放入1.5ml离心管中，迅速混匀加入ph6.0，20mm的磷酸缓冲液，之后加入10μl10mg/mledc溶液和10μl10mg/mlnhs溶液，室温活化30min，充分混匀后12000g离心20min，弃上清，将活化后的微球用ph6.0，200μl含有0.01%sds20mm的磷酸缓冲液重悬，并加入120μg/ml重组新冠病毒抗原，室温下交联2h，之后12000g离心20min，弃上清，沉淀用ph8.0，1ml20mm磷酸盐缓冲液重悬，12000g离心20min后，弃上清，沉淀用ph8.0，1ml20mm磷酸盐缓冲液重悬，4℃存放备用。该复合物也因乳胶体本身的颜色而呈现出红色，便于肉眼检测。

（4）制备复合物垫：使用乳胶缓冲液对步骤（1）得到的抗原-乳胶体复合物进行稀释获得0.4w/v%的致敏乳胶溶液，使用喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维素膜上，再利用20mmph7.4磷酸盐缓冲液清洗未交联重组新冠病毒抗原，37℃干燥4小时，得到复合物垫，即刻使用或4-30℃密封避光保存备用。

乳胶缓冲液的制备方法为：在0.1mtris-hcl缓冲液中加入0.3%聚乙二醇20000、0.2%牛血清蛋白、0.2%脱脂牛奶、0.3%酪蛋白溶液、0.05%叠氮化钠、0.04%氯化钾和0.22%苷氨酸，充分溶解后，利用hcl调ph至8.0。

（5）利用喷金划膜仪将0.5mg/ml鼠抗人igg单克隆抗体、0.5mg/ml鼠抗人igm单克隆抗体和1.0mg/ml羊抗鼠单克隆抗体分别划线于硝酸纤维素膜t1检测区（t1线）、t2检测区（t2线）和qc质控区（c线）的位置上，37℃干燥4小时烘干制得硝酸纤维素膜，即刻使用或4-30℃避光密封保存备用。（t1、t2检测区和qc质控区能分别特异性结合人源igg，人源igm和鼠源igg，因此能将来自复合垫中的复合物质进行特异性分离来实现目的检测。）

（6）将样品垫、步骤（2）得到的复合物垫、步骤（3）得到的硝酸纤维素膜和吸水纸，按照图1所示，从左至右依次搭接贴附到pcv板上，得到乳胶试纸条，并裁切成3.8mm宽的试剂条。

（7）将步骤（4）得到的乳胶试纸条裁切成3.8mm宽，装入塑料卡壳中，获得新型冠状病毒2019-ncovigm/igg抗体联合检测试剂盒。

实施例2：

一种新型冠状病毒2019-ncovigm/igg抗体联合检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：

（1）前期准备，检测前将试剂盒中的乳胶试纸条、待测样本和0.5%bsa20mm磷酸盐缓冲液恢复至室温20-30℃，试剂盒即拆即用。

（2）检测，将乳胶试纸条放在实验台上，使用移液器吸取20μl待测样本，滴加到乳胶试纸条样品垫，再用滴瓶滴加2滴ph7.4的0.5%bsa20mm磷酸盐缓冲液到乳胶试纸条样品垫中，记时15min。

稀释液配方的优化：通过在磷酸盐缓冲液中分别添加0.1%、0.2%、0.4%、0.5%的bsa，分别检测样本，结果添加0.5%bsa的磷酸盐缓冲液大幅度提高了检测的灵敏度。

（3）观察结果，在15min时判定结果，若待测样本中含有新型冠状病毒2019-ncov的抗体则t1或t2线呈现红色条带，若待测样本中没有新型冠状病毒2019-ncov的抗体，则不发生结合即t1或t2线不显色，同时无论待测样本中有无新型冠状病毒2019-ncov的抗体，c线都应显示红色，若无则检测失败，有效检测及无效检测情况如图2所示。

当待测样本滴入样品垫后，血清中的2019-ncov特异性igm抗体和igg抗体将与标记在玻璃纤维上的2019-ncov重组抗原结合，形成红色结合物，在毛细作用下泳动至硝酸纤维素膜的检测区时被鼠抗人igg单克隆抗体和鼠抗人igm单克隆抗体捕获，呈现红色条带。如样品中没有待测新型冠状病毒抗体，则不发生结合，即不显色。在硝酸纤维素膜检测区附近再固定上相应的质控物作为质控带，无论样品中有无待测物，质控线都应显示红色，如无，则检测失败。

实施例3：抗原-乳胶体制备工艺的优化

本发明通过增加两次清洗抗原-乳胶体复合物来减少未交联上的重组新冠病毒抗原，提高了乳胶层析条的检测灵敏度。将优化前（即没有经过两次清洗抗原-乳胶体复合物，其他条件与实施例1相同）的对比实验与优化后（即实施例1）结果相对比，如图3所示，优化后，igm和igg灵敏度样本均可以检出，与优化前相比提升了产品检测灵敏度。

未优化对比实验的具体步骤如下：取20μl4%300nm羧基红色微球颗粒放入1.5ml离心管中，迅速混匀加入ph6.0，20mm的磷酸缓冲液，之后加入10μl10mg/mledc溶液和10μl10mg/mlnhs溶液，室温活化30min，充分混匀后12000g离心20min，弃上清。将活化后的微球用ph6.0，200μl含有0.01%sds20mm的磷酸缓冲液重悬，并加入120μg/ml重组新冠病毒抗原，室温下交联2h，之后12000g离心20min，弃上清。沉淀用ph8.0，1ml20mm磷酸盐缓冲液重悬，4℃存放备用。