抗蛇毒血清效价的检测方法与流程

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及抗蛇毒血清效价的检测方法。

背景技术：

传统抗蛇毒血清效价的评价常采用蛇毒与抗血清免疫扩散、酶联免疫检测(elisa)、蛋白质免疫印迹(westernblot)及小白鼠半致死剂量结合抗血清的半有效剂量测定等方法来实现的。此类方法成熟，所需器材简便，但只有一个整体的评价结果，无法精确定位到抗蛇毒血清对特定蛇毒组分的中和效果的评价，且使用小白鼠还涉及到动物伦理问题。在评估抗蛇毒血清效价时，为实现抗血清中和蛇毒不同组分的可视化精确定位和定量，减少小白鼠使用以改善动物福利，需要进一步完善传统评价方法。

基于高效液相色谱、凝胶电泳等蛋白质分离方法与质谱鉴定技术明确蛇毒全蛋白组构成特征(组分类型与相对含量)，结合待评估抗蛇毒血清亲和层析柱分离可供识别吸附和未能识别吸附组分，可有效、精准、稳定地实现对抗蛇毒血清效价的可视化评估。我国境内毒蛇资源分布广泛，种类繁多，蛇伤危害较为严重。迄今为止，国内对抗蛇毒血清效价的评价仍沿用传统评估方法，缺乏有效、精准、稳定且易可视化评判方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供抗蛇毒血清效价的检测方法，该方法可以改善动物福利，且能够实现蛇毒血清效价评价的可视化。

本发明提供的抗蛇毒血清效价的检测方法，包括：

抗蛇毒血清上亲和层析柱后，与蛇毒进行免疫亲和吸附反应，依次洗脱获得未结合蛇毒组分、结合蛇毒组分；

hplc法检测蛇毒、未结合蛇毒组分及结合蛇毒组分中的蛋白质，分别得到蛇毒、未结合蛇毒组分及结合蛇毒组分的色谱图，根据所述色谱图分析抗蛇毒血清对蛇毒各组分的结合量。

本发明提供了一种用高效液相色谱、凝胶电泳、质谱和亲和层析技术共同检测抗蛇毒血清效价的方法，即基于高效液相色谱、凝胶电泳等蛋白质分离方法与质谱鉴定技术明确蛇毒全蛋白组构成特征(组分类型与相对含量)，用抗蛇毒血清制备亲和层析柱分离蛇毒中可供识别吸附和不能识别吸附组分，实现抗蛇毒血清对蛇毒中和能力的评估。在评估方法中，所述hplc条件、亲和层析及免疫亲和吸附反应的条件有针对性的进行了优化，从而使检测结果更可靠。

本方法可实现抗蛇毒血清效价评估的可视化，借助蛇毒全蛋白组数据，可精准计量待评估抗蛇毒血清在液相峰图中可吸附和不可吸附蛇毒组分的类型及相对含量；稳定性高、重复性强，能够实现不同批次亲和吸附反应中抗蛇毒血清吸附的蛇毒同一组分含量相同；改善动物福利，不再需要借助小白鼠测定蛇毒的半致死剂量和抗蛇毒血清的半有效剂量。

本发明中，所述亲和层析柱为cnbr活化的琼脂糖4b柱；上样前，用1mmol/l冰盐酸洗脱15个柱体积，然后用含0.2mol/l碳酸氢钠的0.5mol/l氯化钠溶液洗脱3个柱体积。

本发明中，所述抗蛇毒血清经透析后冻干，以含0.2mol/l碳酸氢钠的0.5mol/l氯化钠溶液溶解后上样。

本发明中，所述抗蛇毒血清上样后，0～4℃结合；

然后1个柱体积的0.1mol/lph8.0tris盐酸缓冲液，在室温下于摇床上缓慢孵育4小时；

排空后，加入3个柱体积含0.1mol/l醋酸盐的0.5mol/lph4.0氯化钠缓冲液；

漂洗排空后，加入3个柱体积的0.1mol/lph8.5tris盐酸缓冲液，重复6次漂洗过程，最后用3个柱体积的20mmol/lph7.2磷酸盐缓冲液平衡

本发明中，所述免疫亲和吸附反应中，抗蛇毒血清与蛇毒的摩尔比为8:1，0～4℃反应8～12h。

本发明中，所述洗脱未结合蛇毒组分采用3个柱体积20mmol/lph7.2磷酸盐缓冲液；所述洗脱结合蛇毒组分3个柱体积0.1mol/lph2.0的甘氨酸盐酸缓冲液。

本发明中，所述结合蛇毒组分洗脱后还包括中和的步骤，所述中和采用1mol/lph9.0的tris盐酸溶液。

本发明中，所述hplc法检测蛇毒、未结合蛇毒组分及结合蛇毒组分的方法包括：

上样缓冲液为质量分数为0.1％的三氟乙酸水溶液，

采用c18柱，流动相a为质量分数为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相b为100％乙腈，洗脱梯度为：

0～30min，流动相b相体积分数由0～15％；

30～150min，流动相b相体积分数由15％～45％；

150～170min，流动相b相体积分数由45％～75％。

本发明中，所述根据所述色谱图分析抗蛇毒血清对蛇毒各组分的结合量包括：用峰面积占比法计算结合蛇毒组分与未结合蛇毒组分两个液相图中各液相峰的百分比，与蛇毒的液相峰比较，计算获得抗蛇毒血清对蛇毒各组分的吸附量。

本发明中，所述计算的公式为：

蛇毒全毒特定峰面积＝相同位置结合蛇毒组分液相峰面积+相同位置未结合蛇毒组分液相峰面积；

结合蛇毒组分％＝结合蛇毒组分液相峰面积/相同位置全毒峰面积×100％；

未结合蛇毒组分％＝未结合蛇毒组分液相峰面积/相同位置全毒峰面积×100％；

本发明中，色谱峰面积采用empower软件计量。

上述一种抗蛇毒血清效价检测方法，具有如下优点：

1.改善动物福利。抗蛇毒血清效价的评价可直接借助液相峰图中抗蛇毒血清对蛇毒的吸附量来实现，不再需要借助小白鼠测定蛇毒的半致死剂量和抗蛇毒血清的半有效剂量。

2.稳定性好，可重复性强。亲和层析柱结合有固定载量抗蛇毒血清，当限定抗蛇毒血清与蛇毒比时，能够实现不同批次亲和吸附反应中抗蛇毒血清吸附的蛇毒同一组分含量相同。

3.可视化。借助质谱鉴定结果及液相峰与电泳条带相对含量计算方法构建的蛇毒全蛋白组数据，可精准评估亲和层析中蛇毒被抗蛇毒血清吸附组分和未被吸附组分的类型及相对含量，特定组分液相峰形的变化能可视化判断抗蛇毒血清对蛇毒的中和能力，即被吸附组分的液相峰占粗毒液相峰的比例越高，抗蛇毒血清效价越高，未被吸附组分的液相峰占粗毒液相峰的比例越高，抗蛇毒血清效价越低。

附图说明

图1是实施例中平颏海蛇毒液相分离及组分质谱鉴定与相对含量的示意图；

图2是实施例中平颏海蛇毒各液相分离峰的聚丙烯酰胺凝胶电泳的示意图；

图3是实施例中被抗银环蛇毒血清吸附的平颏海蛇毒组分与结合量的示意图；

图4是实施例中无法被抗银环蛇毒血清吸附的平颏海蛇毒组分与结合量的示意图；

图5是实施例中被抗舟山眼镜蛇毒血清吸附的平颏海蛇毒组分与结合量的示意图；

图6是实施例中无法被抗舟山眼镜蛇毒血清吸附的平颏海蛇毒组分与结合量的示意图。

具体实施方式

本发明提供了抗蛇毒血清效价的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

蛇毒蛋白组鉴定。将0.3mg平颏海蛇毒溶于100μl0.1％三氟乙酸，10000g4℃离心15分钟取上清。将上清液上样至kromasil300c18柱(250×4.6mm,5μm)，用waterse600高效液相分离。设定流速为1ml/min，流动相a为0.1％三氟乙酸，流动相b为100％乙腈，洗脱梯度为：

0～30min，流动相b相体积分数由0～15％；

30～150min，流动相b相体积分数由15％～45％；

150～170min，流动相b相体积分数由45％～75％。

收集所有流出峰(图1)，离心浓缩冻干。各流出峰用18％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(图2)，经染色脱色后，切取有效条带进行质谱鉴定。用峰面积占比法计算蛇毒液相图中各液相峰的百分比。当泳道仅有一个蛋白条带时，直接用该泳道对应的液相峰百分比表示该组分的相对含量；当泳道有两个以上蛋白条带时，需要通过计算各条带光密度占所在泳道百分比与液相峰百分比乘积来表示该组分的相对含量。平颏海蛇毒全蛋白组特征构成为：短链三指毒素(stx)占总蛇毒蛋白的37.32％，长链三指毒素(ltx)占3.68％，ltx和磷脂酶a2(pla2)混合组分占2.58％，pla2占48.12％，半胱氨酸富集分泌蛋白(crisp)占8.30％(图1)

抗蛇毒血清亲和层析柱制备。选取市售抗银环蛇血清和抗舟山眼镜蛇毒血清各1ml，用milliq超纯水透析24小时，期间每隔4小时换一次水，然后将透析完的抗蛇毒血清冷冻干燥后保存于4℃备用。将1mlcnbr活化的琼脂糖4b填料装填至3ml针管式层析柱，用1mmol/l冰盐酸洗脱15个柱体积，随后用含0.2mol/l碳酸氢钠的0.5mol/lph8.3氯化钠溶液洗脱3个柱体积。将上述冻干粉用含0.2mol/l碳酸氢钠的0.5mol/lph8.3氯化钠溶液复溶，取含40mg抗蛇毒血清的复溶液放入层析柱，4℃下翻转摇床缓慢摇动过夜。在280nm下测定抗蛇毒血清复溶液在与cnbr活化的琼脂糖4b填料结合前后的吸光值，以抗体蛋白在1cm光路下消光系数为1.4时的浓度定为1mg/ml用于计算抗蛇毒血清在填料上的结合量，最终获得两根分别结合19.6mg抗银环蛇毒血清和19.8mg抗舟山眼镜蛇毒血清的亲和层析柱。抗血清结合过程结束后，在层析柱中加入1个柱体积的0.1mol/lph8.0tris盐酸缓冲液，在室温下于摇床上缓慢孵育4小时。排空后，加入3个柱体积含0.1mol/l醋酸盐的0.5mol/lph4.0氯化钠缓冲液；漂洗排空后，加入3个柱体积的0.1mol/lph8.5tris盐酸缓冲液，重复6次漂洗过程，最后用3个柱体积的20mmol/lph7.2磷酸盐缓冲液平衡。

免疫亲和吸附反应。称取600μg平颏海蛇毒冻干粉，用1ml20mmol/lph7.2磷酸盐缓冲液溶解，按照抗体与蛇毒8：1摩尔浓度比，在两根抗蛇毒血清亲和层析柱中各加入0.5ml含300μg平颏海蛇毒的溶液，随后在翻转摇床上于4℃缓慢摇晃过夜。用3个柱体积20mmol/lph7.2磷酸盐缓冲液洗脱未结合蛇毒组分并收集，随后再用3个柱体积0.1mol/lph2.0的甘氨酸盐酸洗脱结合的蛇毒组分并收集，用1mol/lph9.0的tris盐酸溶液及时中和，所有收集组分离心浓缩冻干。

抗蛇毒血清对蛇毒各组分吸附量评估。将前述收集的蛇毒结合与未结合组分溶于100μl0.1％三氟乙酸，10000g4℃离心15分钟取上清。将上清液上样至kromasil300c18柱(250×4.6mm,5μm)，用waterse600高效液相分离。设定流速为1ml/min，流动相a为0.1％三氟乙酸，流动相b为100％乙腈，洗脱梯度为：

0～30min，流动相b相体积分数由0～15％；

30～150min，流动相b相体积分数由15％～45％；

150～170min，流动相b相体积分数由45％～75％。

用峰面积占比法计算蛇毒结合组分与未结合组分两个液相图中各液相峰的百分比，并与蛇毒蛋白组液相峰比较用以计算抗蛇毒血清对蛇毒各组分的吸附量。如抗银环蛇毒血清对平颏海蛇毒stx的吸附量仅占该组分的5％，ltx和pla2混合组分占35％，pla2占42％，能吸附全部的ltx和crisp(图3)；未能吸附组分分别为stx95％，ltx和pla2混合组分65％，pla258％(图4)。如抗舟山眼镜蛇毒血清对平颏海蛇毒stx的吸附量仅占该组分的29％，ltx占78％，ltx和pla2混合组分占34％，pla2占41％，能吸附全部的crisp(图5)；未能吸附组分分别为stx71％，ltx22％，ltx和pla2混合组分66％，pla259％(图6)

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。