一种同时检测血清中6种精神类药物含量的方法与流程

本发明涉及医药检测
技术领域：
，具体涉及一种同时检测血清中6种精神类药物含量的方法。
背景技术：
：氯丙嗪是20世纪50年代开始用于临床，是第1代抗精神病药(典型抗精神病药)。主要用于治疗精神分裂症、躁狂症等。有文献报道：不同个体口服相同剂量的氯丙嗪，血药浓度可相差10倍以上。氯氮平是20世纪70年代开始进入临床的新型非典型抗精神病药，属于第2代抗精神病药。与典型抗精神病药相比具有较少引起锥体外系反应的特点，但却会引起粒细胞缺乏等致命性不良反应。阿立哌唑是二氢喹啉酮类抗精神病药，属于第3代抗精神病药，在药理作用机制上不同于其1、2代抗精神病药，不仅可以治疗谨慎分裂症的各种症状及改善认知功能，并且较少引起锥体外系症状、糖脂代谢障碍等不良反应。丙咪嗪、氯米帕明、阿米替林都属于三环类抗抑郁药，具有抗抑郁作用强、毒副作用小的特点，目前都是治疗抑郁症的主要药物。以上这些药物的有效浓度范围窄，当血药浓度超过有效浓度范围上限时，疗效反而下降；当血药浓度过高时，可能会引起严重的毒副反应，加上机体对这类药物的代谢能力个体差异大，因此被公认为是需要在血药浓度检测下使用的药物。目前常用于测定氯丙嗪、氯氮平、阿立哌唑、丙咪嗪、氯米帕明及阿米替林血药浓度的测定方法主要是采用液相色谱法(hplc)或液相色谱-串联质谱法(hplc-ms/ms)。样品的前处理一般多采用液液萃取或者离线固相萃取的方式，耗费试剂多、前处理时间长，且人为影响因素较大，常常导致测试结果偏差大。普通液相色谱法对于血清中的某些药物浓度检测灵敏度不够，而且通常都是对单一药物进行测定。液相色谱-串联质谱法虽然可以解决灵敏度问题，但因为仪器/耗材昂贵、需要专业人员操作、需要内标等因素，不容易普及。或不同目标药物采用不同的前处理方式、不同的色谱条件和/或质谱条件，不同类型的检测仪器等，这都造成了检测效率不高、成本增加、患者等待时间较长等问题。技术实现要素：为了克服上述技术缺陷，本发明的技术目的是提供一种同时检测血清中6种精神类药物含量的方法，采用二维液相色谱系统及柱切换技术相结合，血清样品仅需要简单的蛋白沉淀后即可上机检测；该方法快速、灵敏，可以满足体外诊断对于血清中6种精神类药物的含量测定要求；该方法成本较低，经过专业培训后操作人员即可操作；可以高效率利用设备，减少仪器测试不同目标药物时进行方法转换、平衡的时间。本发明提供如下技术方案：一种同时检测血清中6种精神类药物含量的方法，采用二维液相色谱系统及柱切换技术，对去蛋白后的血清待测样品进行检测。本发明的方法，所述二维液相色谱系统及柱切换技术具体是：采用4.0×20mm的一维色谱柱、3.0×100mm的二维色谱柱和4.6×10mm的中间柱，将去蛋白后的血清待测样品上样、洗脱、测定，得到色谱图，根据色谱图的峰面积，带入已建立好的标准曲线方程，计算出待测样品的目标物含量。所述一维色谱柱、二维色谱柱和中间柱可以采用苯基柱或c18柱均可；优选的是，一维色谱柱采用苯基柱、二维色谱柱和中间柱采用c18柱。本发明的方法，所述二维液相色谱系统及柱切换技术中，一维色谱流动相采用体积比为80:20的10～50mm醋酸铵(ph5～7.5之间)和乙腈等度洗脱，流速1.2ml/min；二维色谱流动相采用体积比为57:43的10～50mm醋酸铵(ph5～7.5之间)和乙腈等度洗脱，流速0.5ml/min。根据本发明一种优选的实施方式，其中：一维色谱流动相为：30mm醋酸铵(ph6.8)和乙腈(体积比80:20)等度洗脱，流速1.2ml/min；二维色谱流动相采用30mm醋酸铵(ph5.7)和乙腈(体积比57:43)等度洗脱，流速0.5ml/min。本发明的方法，所述二维液相色谱系统及柱切换技术中，色谱柱温：25～50℃，进样量是100～500μl。优选的是：色谱柱温：40℃，进样量是500μl，一维前处理与目标物转移时间共计4min，二维分析时间共计6min。本发明的方法，所述6种精神类药物是氯丙嗪、氯氮平、阿立哌唑、丙咪嗪、氯米帕明、阿米替林。在所述二维液相色谱系统中，采用二极管阵列检测器，对各目标物进行光谱扫描，以选择合适的检测波长。本发明中采用了如下条件：氯丙嗪254nm、氯氮平210nm、阿立哌唑218nm、丙咪嗪210nm、氯米帕明218nm、阿米替林210nm。本发明的方法，所述去蛋白的血清待测样品可以采用任何已知的去蛋白的方法得到，优选是取一定量的血清待测液，加入蛋白沉淀剂后涡旋混合，再高速离心，取上清液，待测。本发明的方法，所述标准曲线方程的建立方法是：制备标准品的至少3个不同浓度的混合标准工作液，采用上述二维液相色谱系统及柱切换技术检测，得到色谱图，根据标准工作液的浓度与峰面积建立标准曲线方程。其中，所述混合标准工作液，可以根据检测目标物来选择相同的或不同的标准工作液浓度，或选择其中某个检测目标物或某些检测目标物来制备标准工作液。所述混合标准工作液的上机浓度在7.14～1428.57ng/ml之间。所述的标准工作液上机浓度，指标准工作液经过与血清混合、除蛋白、离心等步骤后取得上清液的浓度，可以是以下不同浓度中的任意3个或多个，9种不同浓度分别为7.14ng/ml、14.29ng/ml、28.57ng/ml、71.43ng/ml、142.86ng/ml、285.71ng/ml、714.29ng/ml、1071.43ng/ml、1428.57ng/ml。混合标准工作液，也进行和血清待测样品一样的去蛋白处理，如和空白血清混合，加入蛋白沉淀剂，涡旋震荡，混合均匀。在高速离心机中离心沉淀后，取上清液待测。然后上机测定，在色谱图上得到各物质的峰面积，以某一物质的溶液浓度为横坐标x，以该物质的峰面积为纵坐标y，采用最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程y＝a*x+b。本发明的方法，将6种待测组分采用同一个前处理方法、同一个分析方法，6个待测组分相互不干扰，一次分析即可测出6种物质。大大地减少了前处理时间、分析时间、更换方法平衡系统的时间、减少了试剂的使用量；采用大体积进样的方式使得检出限和定量限也有了显著的提高。本发明采用线柱切换、多维在线固相萃取液相色谱法分析血清中6种精神类药物的血药浓度，该方法采用了二维液相色谱系统以及大体积进样方式大大提高了检测灵敏度。简单的前处理(去蛋白)方法，减少了操作过程带来的误差，提高了检测通量。相同的分析方法可以同时进行6种精神类药物的血药浓度检测，可同时建立标准曲线，且各药物之间相互不产生干扰。大大减少了样本分析时不同方法交替平衡系统的时间。附图说明图1是本发明实施例提供的标准工作液的色谱图，图中色谱峰依次代表1-氯氮平、2-丙咪嗪、3-阿米替林、4-氯丙嗪、5-氯米帕明和6-阿立哌唑。图2是本发明实施例提供的根据标准工作液的浓度与峰面积绘制的标准曲线图，图中依次代表氯氮平、丙咪嗪、阿米替林、氯丙嗪、氯米帕明和阿立哌唑。图3是本发明实施例提供的血清待测样品的色谱图。具体实施方式下面，结合实施例对本发明做进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护之中。一种检测血清中氯丙嗪、氯氮平、阿立哌唑、丙咪嗪、氯米帕明及阿米替林含量的方法，采用二维液相色谱系统及柱切换技术相结合，对去蛋白后的血清待测样品进行上机检测。所述上机检测的条件为：一维色谱柱(苯基柱)，4.0×20mm；二维色谱柱(c18柱)，3.0×100mm；中间柱(c18柱)，4.6×10mm。一维流动相采用30mm醋酸铵(ph6.8)和乙腈(体积比80:20)等度洗脱，流速1.2ml/min；二维色谱流动相采用30mm醋酸铵(ph5.7)和乙腈(体积比57:43)。进样量500μl(进样采用本领域已知的进样器来完成)，一维前处理与目标物转移时间共计4min，二维分析时间共计6min。采用二极管阵列检测器，对各目标物进行光谱扫描，以选择合适的检测波长。本实施例中采用了如下条件：氯丙嗪254nm、氯氮平210nm、阿立哌唑218nm、丙咪嗪210nm、氯米帕明218nm、阿米替林210nm。在确定好上述上机条件后，针对标准工作液和待测血清样品进行测定，步骤是：步骤1：标准工作液的制备(1)配制6种标准品的混合标准工作液，制成至少3个标准工作液。6种目标物既可以选择相同的标准工作液浓度，也可以选择不同的标准工作液浓度；也可根据实际工作需要，选择某个目标物或某些目标物制备标准工作液。(2)不同浓度的标准工作液分别和空白血清混合，加入蛋白沉淀剂，涡旋震荡，混合均匀。(3)在高速离心机中离心沉淀后，取上清液待测。步骤2：待测血清样品的前处理待检测血液，进行离心分离操作，取上清液血清，将血清冷冻保存。用移液枪移取一定量的血清样品，加入蛋白沉淀剂，涡旋震荡，混合均匀。在高速离心机中离心沉淀后，取上清液待测。血清样品的前处理主要是为了去蛋白，本领域技术人员都可以根据其已有的知识来选择所需要的技术参数，在本实施例中，为了达到便捷快速的检测，采用的去蛋白步骤具体是：用移液枪精确移取300μl血清样品至1.5ml的离心管中，然后加入600-1200μl的蛋白沉淀剂。在1000-2500rpm的转速下涡旋混合1-3min。在10000-15000rpm的高速离心机中离心5-15min，移取上清液即为待测液。步骤3：标准曲线方程的建立将步骤1中制备得到的标准工作液，上机测定。在色谱图(如附图1所示)上得到各物质的峰面积，以某一物质的溶液浓度为横坐标x，以该物质的峰面积为纵坐标y，采用最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程y＝a*x+b。所述的标准溶液上机浓度，指标准溶液经过与血清混合、除蛋白、离心等步骤后取得上清液的浓度，可以是以下不同浓度的标准溶液中的任意3个或多个，9种不同浓度分别为7.14ng/ml、14.29ng/ml、28.57ng/ml、71.43ng/ml、142.86ng/ml、285.71ng/ml、714.29ng/ml、1071.43ng/ml、1428.57ng/ml。步骤4：待测血清样品的测定将步骤2中制备得到的待测血清样品溶液，上机测定。在色谱图上得到不同物质的峰面积，根据步骤3中建立的标准曲线方程，计算氯丙嗪、氯氮平、阿立哌唑、丙咪嗪、氯米帕明及阿米替林的浓度。步骤5：结果计算(1)标准曲线方程以9个不同浓度的标准品浓度为横坐标(x)，以9个标准品实测的峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线(如附图2所示)。氯氮平、丙咪嗪、阿米替林、氯丙嗪、氯米帕明和阿立哌唑在7.14～1428.57ng/ml的浓度范围内线性关系良好，相关系数r2>0.999。#化合物名称标准曲线方程相关系数r21氯氮平y＝2992.6x-27854.50.99982丙咪嗪y＝4847.1x+34382.00.99943阿米替林y＝6170.4x-19821.20.99984氯丙嗪y＝3486.3x-15190.30.99985氯米帕明y＝3947.9x-16724.70.99996阿立哌唑y＝2642.2x-32720.40.9997(2)检出限与定量限以信号噪声比(s/n)>3，3次测试结果的重复性(rsd)<20％为检出限。以信号噪声比(s/n)>10，3次测试结果的重复性(rsd)<20％为检出限。测试结果表明，氯氮平、丙咪嗪、阿米替林、氯丙嗪、氯米帕明和阿立哌唑的检出限与定量限见下表。#化合物名称检出限(ng/ml)定量限(ng/ml)1氯氮平0.41.32丙咪嗪0.20.63阿米替林0.20.84氯丙嗪0.51.85氯米帕明0.51.76阿立哌唑1.03.4(3)血清待测样品的检测结果本实施例的血清待测样品检测结果见图3，根据标准曲线方程，计算得该样品中氯氮平浓度为362.1ng/ml。其余无检出。从上述实施例可以看出，本发明的方法采用了二维液相色谱系统，通过大体积进样方式大大提高了检测灵敏度。简单的前处理(去蛋白)方法，减少了操作过程带来的误差，提高了检测通量。相同的分析方法可以进行6种精神类药物的血药浓度检测，可同时建立标准曲线，且各药物之间相互不产生干扰。大大减少了样本分析时不同方法交替平衡系统的时间。以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。当前第1页12