样本分析系统、样本检测方法、组合物及其应用与流程

1.本发明属于生化分析领域，具体涉及白细胞的分类和计数。


背景技术：

2.血细胞又称“血球”，是存在于血液中的细胞，在生物体的血管中随着血液流动而遍及全身。以哺乳动物来说，血细胞主要含三个部分，红细胞、白细胞和血小板。白细胞是人体血液中非常重要的一类血细胞，它具有抵抗病原体入侵的能力，对疾病的免疫抵抗力，吞噬异物产生抗体，以及人体伤病的损伤治愈能力等。当人体出现不适时，通常会通过白细胞数量、细胞形态和类群比例的显著变化而表现出来，因此白细胞是一种非常特殊且重要的细胞，对其进行精确的测定对于临床诊断和病理分析具有重大且关键的意义。
3.目前，已研究了一些对白细胞进行测定的方式。在一个示例中，利用低渗溶液破坏白细胞细胞膜，并用荧光染料染色细胞核酸实现白细胞计数和分类。在一个示例中，使用调节溶血剂ph值或加入表面活性剂成分来改变白细胞形态和破坏细胞膜结构的溶血试剂，并结合染色核酸物质的荧光染料，通过荧光信号的强弱来实现对白细胞不同类群的区分。在一个示例中，采用使白细胞不同类群在体积和内部结构产生差别的试剂，其通过检测该试剂处理样本的电导信号(dc)和高频电流信号(rf)实现白细胞的分类。，在一个示例中，使用了溶血剂和化学染色试剂相结合的方式，该方式可以在白细胞内特定位置形成有色沉淀，并通过收集光散射信号实现区分不同白细胞。并且在一个示例中，利用荧光标记的特定单克隆抗体与白细胞表面抗原结合，通过荧光检测方法实现白细胞分类。但这些白细胞分析方法无对于提高白细胞分群的准确性和精密度能力仍然有限。
4.提高白细胞测定的准确度和精密度能够为临床诊断和病理分析提供更加确定的数据支持，同时对医疗设备的推广和提升具有重大的意义。
5.因此，本领域存在着对准确性高、精密度好的白细胞分类方式的强烈需求。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种样本分析系统，所述样本分析系统包括：
7.采样装置，包括采样器，所述采样器用于吸取样本；
8.样本制备装置，具有反应池和试剂供应部，其中，所述反应池用于接收采样装置所吸取的样本，所述试剂供应部将试剂提供给所述反应池，从而由所述采样装置所吸取的样本与由所述试剂供应部提供的试剂在所述反应池中混合，以制备成待测试样，其中，所述试剂包括溶血剂、第一染色剂和第二染色剂，所述溶血剂在溶解红细胞的同时能够维持白细胞的生理形态和结构完整性，所述第一染色剂包含核酸染料，所述核酸染料能够对白细胞的核酸物质进行染色，所述第二染色剂包含还原性染料，所述还原性染料能够在白细胞内存在的过氧化物酶的位置形成有色沉淀；
9.光学检测装置，包括光源、流动室和至少两种检测器，所述待测试样的粒子可在所述流动室内流动，所述光源所发射的光照射所述流动室中的粒子以产生光学信号，所述检
测器用于收集所述光学信号；和
10.数据处理装置，其与所述光学检测装置电连接并包括处理器和存储有计算机程序的计算机可读存储介质，其中所述数据处理装置配置为当所述计算机程序被所述处理器执行时，执行以下步骤：根据所述待测试样的至少两种光学信号获得所述待测试样中的白细胞的参数。
11.在具体的实施方式中，所述数据处理装置配置为当所述计算机程序被所述处理器执行时，执行以下步骤：
12.根据所述待测试样的荧光信号和侧向散射光信号获得所述待测试样中的白细胞的参数。
13.利用本发明的系统在一次检测中采集不同的光学信号在核酸和过氧化酶含量两个维度进行检测，能够反映接近生理状态的细胞信号。同时，采用维持白细胞的生理形态和结构完整性的溶血剂为两种染色提供了更好的分辨能力，进一步增加了白细胞分类的准确度和精确度，为临床诊断和病理分析提供更加确定的数据支持。
14.在一些的实施方式中，所述数据处理装置配置为当所述计算机程序被所述处理器执行时，执行以下步骤：
15.根据所述待测试样的荧光信号、侧向散射光信号和前向散射光信号获得所述待测试样中的白细胞的参数。
16.在具体的实施方式中，获得待测试样中的白细胞的参数包括：白细胞的分类和/或计数。
17.如本领域技术人员所理解，侧向散射光信号通常反映粒子的复杂长度，而前向散射光信号通常反映粒子的体积大小。
18.在具体的实施方式中，可通过添加表面活性剂并调节渗透压实现在能够溶解红细胞的同时维持白细胞的生理形态和结构完整性。
19.因此，在本发明中，溶血剂可包括渗透压调节剂和选自阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性离子表面活性剂组成的组中的一种或多种的表面活性剂。
20.具体地，阳离子表面活性剂可选自十二烷基三甲基氯化铵和氯化铵等中的一种或多种。非离子表面活性剂(如脂肪酸甘油酯类、多元醇类、聚氧乙烯型)可选自由脂肪酸单甘油酯、脂肪酸二甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯、聚山梨酯、聚氧乙烯脂肪酸脂、聚氧乙烯(40)硬脂酸脂、聚氧乙烯(20)油酸脂、聚氧乙烯(23)十二烷基醇醚、聚氧乙烯(20)十六烷基醇醚、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯酚醚、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、壬基酚聚氧乙烯醚、普朗尼克68、司盘类(spans)、吐温类(tweens)、triton类(如triton x-100)、卖泽类(myri)、苄泽类(brij)和皂素组成的组中的一种或多种。两性离子表面活性剂例如可以是氨基酸型两性离子表面活性剂和/或甜菜碱型两性离子表面活性剂。
21.在优选的实施方式中，本发明的表面活性剂为非离子表面活性剂。
22.通过选择非离子表面活性剂作为溶血剂的成分，本发明进一步提高了白细胞检测的准确度。不希望受到理论的束缚，这是因为，相比于其他表面活性剂，选择非离子表面活性剂降低了对核酸染料的影响，从而改善了来自核酸染料光学信号的展出度。
23.在本发明中，表面活性剂浓度被配制为不导致白细胞形态结构的改变。可通过在加入含有表面活性剂的溶血剂后在显微镜明场下观察白细胞的结构形态来确认这样的浓
度。例如，本发明的阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂在白细胞检测过程中可以0.1-1g/l的终浓度存在；本发明的非离子表面活性剂在白细胞检测过程中可以0.5-2g/l的终浓度存在。
24.在本发明中，对于渗透压调节剂种类没有特别的限制，其例如可选自有机醇(如乙二醇、木糖醇等)、无机盐(如碳酸氢钾、氯化钠等)、有机酸碱金属盐(如乙二胺四乙酸四钠、柠檬酸和柠檬酸钠)、糖类(如葡萄糖、甘露糖等)，和氨基酸类(如甘氨酸、色氨酸等)中的一种或多种。
25.在具体的实施方式中，本发明的渗透压调节剂被配制为在白细胞检测过程中提供150mosm/kg到700mosm/kg的渗透压范围。
26.在本发明中，核酸染料是指特异性染色细胞的核酸物质的染料。在一些实施方式中，核酸染料是吉姆萨染色液。在另一些实施方式中，核酸染料是荧光核酸染料。
27.本发明的荧光核酸染料例如可选自吖啶橙(acridine orange,ao)、硫磺素(thioflavin t)、柯苯胺(chrysaniline)、噻唑橙(thiazole orange,to)、溴化已锭(ethidium bromide,eb)、碘化丙啶(pi)、4,4,6-二脒基二苯基吲哚(dapi)、hoechst(ho)、金胺o(auramine o,auo)、sybr green和花菁类化合物中一种或多种。
28.可以理解，核酸染料被配制为在白细胞检测过程中以过饱和的终浓度存在。例如，在使用吖啶橙的情况下，其在白细胞检测过程中可以≥50mg/l的浓度存在；又例如，在使用噻唑橙的情况下，其在白细胞检测过程中可以≥35mg/l的浓度存在；再例如，在使用花菁类化合物的情况下，其在白细胞检测过程中可以≥10mg/l的浓度存在。
29.在具体的实施方式中，本发明的还原性染料可选自4-氯-1-萘酚、3,3-二氨基联苯胺(dab)及其组合。对于还原性染料在白细胞检测过程中的终浓度，本发明没有特别的限制，只要相对于细胞内存在的过氧化物酶以过量地存在即可，例如100-1000mg/l。
30.此外，本发明提供了一种样本检测方法，包括：
31.获取待测样本；
32.提供试剂，所述试剂包括溶血剂、第一染色剂和第二染色剂，使用所述试剂处理待测样本以获得待测试样液；其中，所述溶血剂在溶解红细胞的同时能够维持白细胞的生理形态和结构完整性；所述第一染色剂包含核酸染料，所述核酸染料能够对白细胞的核酸物质进行染色；所述第二染色剂包含还原性染料，所述还原性染料能够在白细胞内存在的过氧化物酶的位置形成有色沉淀；
33.使所述待测试样液中的粒子逐个通过光学检测装置的检测区并且利用所述光学检测装置的光源对所述待测试样液中的粒子进行照射，以获取所述待测试样的光学信号；
34.根据所述光学信号对白细胞进行分类和/或计数。
35.在具体的实施方式中，所述光学信号包括荧光信号和侧向散射光信号，根据所述荧光信号和侧向散射光信号，对白细胞进行分类和/或计数。
36.在一些实施方式中，所述光学信号进一步包括前向散射光信号，根据所述荧光信号、侧向散射光信号和前向散射光信号，对白细胞进行分类和/或计数。
37.在一些实施方式中，在处理样本之前还包括获得样本、将样本转移到合适的容器中并从所述容器中吸取样本的步骤；在处理样本时，将所述吸取的样本与所述溶血剂、核酸染料和还原性染料混合；随后使经处理的样本中的粒子逐个通过检测区、使用光源照射所
述粒子并通过荧光检测器采集荧光信号并通过散射光检测器采集侧向散射光信号；从所述荧光信号和侧向散射光信号的散点图中划分白细胞区域，随后基于所述白细胞区域中的散点数量实现对白细胞进行计数。
38.在一些实施方式中，所述白细胞区域选自以下项组成的组中的一种或多种：原始白细胞区域、淋巴细胞区域、单核细胞区域、中性粒细胞区域和嗜酸性粒细胞区域。
39.在一些实施方式中，所述白细胞区域包括原始白细胞区域。
40.对于溶血剂、核酸染料和还原性染料的加入顺序，本发明没有特别的限制。例如，可以先加入溶血剂、再加入核酸染料和还原性染料；又例如，可以同时加入溶血剂、核酸染料和还原性染料，但本发明不限于此。
41.在一些实施方式中，处理的时间是30-150s。
42.在优选的实施方式中，处理的时间是50-70s。
43.在本发明中，可以根据核酸染料种类确定所要收集的光学信号种类。例如，在使用吉姆萨染色液作为核酸染料的情况下，可收集反射光角度或光吸收信号；在使用荧光染料作为核酸染料的情况下，可收集荧光信号。
44.在本发明中，样本可以是血液样本，优选为外周血样本。
45.此外，本发明还提供了一种用于分析白细胞的组合物，包括：
46.溶血剂，其在溶解红细胞同时能够维持白细胞的生理形态和结构完整性；
47.第一染色剂，其包括核酸染料，所述核酸染料能够对细胞中的核酸进行染色；和
48.第二染色剂，其包括还原性染料和过氧化氢，所述还原性染料能够在白细胞内存在过氧化物酶的位置形成有色沉淀。
49.在本发明中，分析白细胞是指对白细胞进行分类，并可选地对经分类的白细胞进行计数。
50.在本发明中，核酸染料可以溶解于有机溶剂中的形式存在。可以根据核酸染料的具体种类来选择合适的有机溶剂，如乙醇、甲醇、异丙醇、乙醚、丙酮、乙腈、苯酚、二甲亚砜或二甲基甲酰胺等。
51.在本发明中，还原性染料可以溶解于缓冲液的形式存在。对于缓冲液的种类没有特别的限制，只要适合维持白细胞形态和适宜染色的进行即可。合适的缓冲液的ph可以在5～11之间，例如7～10之间。
52.在具体的实施方式中，缓冲液例如可以选自由pbs缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、邻苯二甲酸盐类、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(tris)-盐酸缓冲液、n-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ada)缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸(pipes)缓冲液、n,n-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(bes)缓冲液、n-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(tes)缓冲液、3-(n-吗啡啉)乙磺酸(mops)缓冲液、2-羟基-3-(n-吗啡啉)乙磺酸(mopso)缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲液组成的组中的一种或多种。
53.除非特殊说明，本发明中的用语“第一”和“第二”等仅用于区分多个相似的要素，而不意在表示要素之间重要性或次序等方面的任何差异。
54.在本发明中，所述溶血剂、第一染色剂和第二染色剂可以单独或组合的形式包装。例如，可以溶血剂和第二染色剂的组合以及单独的第一染色剂的形式包装；或可以溶血剂、第一染色剂和第二染色剂的形式包装。
55.此外，还提供本发明的组合物在制备白细胞分类试剂中的应用。
附图说明
56.图1示出了使用实施例1所制备的试剂盒检测白细胞时荧光信号和侧向散射信号的二维散点图，blast：原始白细胞，lym：淋巴细胞，mon：单核细胞，neu：中性粒细胞，eos：嗜酸性粒细胞；
57.图2示出了使用实施例2所制备的试剂盒检测白细胞时荧光信号和侧向散射信号的二维散点图；
58.图3示出了使用实施例3所制备的试剂盒检测白细胞时荧光信号和侧向散射信号的二维散点图；
59.图4示出了使用实施例4所制备的试剂盒检测白细胞时荧光信号和侧向散射信号的二维散点图；
60.图5示出了使用实施例5所制备的试剂盒检测白细胞时荧光信号和侧向散射信号的二维散点图；
61.图6示出了使用实施例6所制备的试剂盒检测白细胞时荧光信号和侧向散射信号的二维散点图；
62.图7示出了使用实施例7所制备的试剂盒检测白细胞时荧光信号和侧向散射信号的二维散点图；
63.图8示出了使用实施例8所制备的试剂盒检测白细胞时荧光信号和侧向散射信号的二维散点图；
64.图9示出了处理样本40秒、60秒和120的情况下，白细胞检测的前向散射信号和侧向散射信号的二维散点图，以及前向散射信号和荧光信号的二维散点图；
65.图10示出了使用对比例1所制备的试剂盒检测白细胞时荧光信号和侧向散射信号的二维散点图；
66.图11示出了使用对比例2所制备的试剂盒检测白细胞时荧光信号和侧向散射信号的二维散点图；
67.图12示出了使用对比例3所制备的试剂盒检测白细胞时荧光信号和侧向散射信号的二维散点图；
68.图13示出了使用本发明的溶血剂和第一染色剂处理后样本在显微镜明场下的图像；
69.图14示出了使用本发明的溶血剂和第一染色剂处理后的样本在显微镜荧光下的图像；
70.图15示出了使用本发明的溶血剂和第一染色剂处理前后所检测的荧光信号和前向散射信号的二维散点图；
71.图16示出了未经处理的样本在显微镜明场下的图像；
72.图17示出了使用本发明的溶血剂和第二染色剂处理后的样本在显微镜明场下的图像；
73.图18示出了使用本发明的溶血剂和第二染色剂处理前后所检测的侧向散射信号和前向散射信号的二维散点图；
74.图19示出了示例性的本发明的血细胞分析系统的组成结构示意图。
具体实施方式
75.下面对本技术实施方式进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本技术的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本技术保护的范围。
76.如前所述，为了改善白细胞检测准确度和精密度，本发明提供了一种在维持白细胞的生理形态和结构完整性的同时，利用不同白细胞类群在核酸和过氧化酶两个维度上的染色差异对白细胞进行分类的方法。
77.在将本发明的溶血剂、核酸染料和还原性染料与血样混合后，血液样本中的红细胞被溶解破坏，部分未完全破坏的红细胞也形成了血影，对后续光学信号影响很小，同时保持细胞生理形态和结构完整的白细胞核酸物质与核酸染料和还原性染料结合。
78.不希望受到理论的束缚，由于不同白细胞具有不同的细胞特性，如粒细胞、淋巴细胞等，经处理后其膜结构的损伤程度也不径相同，进入的染料量也各有差异，并且不同细胞类型之间的核大小不同，因此对于不同类型的白细胞，与细胞内核酸物质结合的核酸染料的量也有所不同，造成了不同白细胞经核酸核酸染料染色后产生不同的光学信号。此外，还原性染料进入保持细胞生理形态和结构完整的白细胞，其在细胞内有过氧化物酶存在的位置生成有色沉淀，改变细胞内部复杂度程度，由于不同类型白细胞拥有过氧化物酶含量有所不同，因此对于不同类型的白细胞，在细胞内过氧化物酶所在位置形成有色沉淀的量也不径相同，即细胞内部复杂度改变程度不一样，造成了不同白细胞具有不同的侧向散射光信号。通过测量每个白细胞的来自核酸染料的光学信号和来自还原性染料的侧向散射光实现了不同白细胞类群的精确区分。
79.值得说明的是，在整个血液中红细胞数量平均是白细胞的1000倍左右，其中还包括影响极大的有核红细胞和网织红细胞等，因此在检测白细胞的同时为了排除红细胞对其精确分类定量造成的干扰，用溶血剂溶解样本中的红细胞十分必要。但本发明人发现，在溶血的过程中保持白细胞生理形态和结构完整是实现后续染色区分的一个重要因素，如果不对溶血剂的溶血加以限制，则使白细胞的形态结构也发生变化，造成核酸染色和过氧化物酶染色产生误差。
80.据此，本发明提供了用于实现上述方法的样本分析系统，包括：
81.采样装置，包括采样器，所述采样器用于吸取样本；
82.样本制备装置，具有反应池和试剂供应部，其中，所述反应池用于接收采样装置所吸取的样本，所述试剂供应部将试剂提供给所述反应池，从而由所述采样装置所吸取的样本与由所述试剂供应部提供的试剂在所述反应池中混合，以制备成待测试样，其中，所述试剂包括溶血剂、第一染色剂和第二染色剂，所述溶血剂在溶解红细胞的同时能够维持白细胞的生理形态和结构完整性，所述第一染色剂包含核酸染料，所述核酸染料能够对白细胞的核酸物质进行染色，所述第二染色剂包含还原性染料，所述还原性染料能够在白细胞内存在的过氧化物酶的位置形成有色沉淀；
83.光学检测装置，包括光源、流动室和至少两种检测器，所述待测试样的粒子可在所
述流动室内流动，所述光源所发射的光照射所述流动室中的粒子以产生光学信号，所述检测器用于收集所述光学信号；和
84.数据处理装置，其与所述光学检测装置电连接并包括处理器和存储有计算机程序的计算机可读存储介质，其中所述数据处理装置配置为当所述计算机程序被所述处理器执行时，执行以下步骤：根据所述待测试样的至少两种光学信号获得所述待测试样中的白细胞的参数。
85.上述处理器可以是中央处理单元，还可以是其他通用处理器、数字信号处理器、专用集成电路、现成可编程门阵列或者其他可编程逻辑器件、分立门或者晶体管逻辑器件、分立硬件组件等。通用处理器可以是微处理器或者该处理器也可以是任何常规的处理器等。
86.上述计算机可读存储介质可以是易失性存储器或非易失性存储器，也可包括易失性和非易失性存储器两者。其中，非易失性存储器可以是只读存储器、可编程只读存储器、可擦除可编程只读存储器、电可擦除可编程只读存储器、磁性随机存取存储器、快闪存储器、磁表面存储器、光盘、或只读光盘；磁表面存储器可以是磁盘存储器或磁带存储器。易失性存储器可以是随机存取存储器，其用作外部高速缓存。通过示例性但不是限制性说明，许多形式的ram可用，例如静态随机存取存储器、同步静态随机存取存储器、动态随机存取存储器、同步动态随机存取存储器、双倍数据速率同步动态随机存取存储器、增强型同步动态随机存取存储器、同步连接动态随机存取存储器、直接内存总线随机存取存储器。本发明实施方式描述的存储器旨在包括这些和任意其它适合类型的存储器。
87.图19示出了根据本发明的一种具体的样本分析系统。该样本分析系统包括第一机壳100、第二机壳200、采样装置10、样本制备装置30、光学检测装置50、数据处理装置70及输出部90。在实际应用中，输出部90可以为用户界面。本实施方式中，光学检测装置50及数据处理装置70设置在第二机壳200的内部，分别设置在第二机壳200两侧。样本制备装置30设置在第一机壳100的内部，输出部90和采样装置10设置在第一机壳100的外表面。
88.采样装置10具有采样针，用于采集血液样本并将采集的血液样本输送至样本制备装置30。根据不同的实施方式，采样装置可采集多份血液样本，提供给样本制备装置的不同腔室进行不同的处理，并随后进行不同的检测。
89.样本制备装置30具有反应池和试剂供应部，试剂供应部贮存用于与血液样本反应的试剂(例如至少储存有前述溶血剂、第一染色剂和第二染色剂)并根据需要将相应的试剂供应到所述反应池。
90.样本制备装置30可包括至少一个反应池，其中至少一个反应池可配置为使得来自采样部的所述血液样本和来自试剂供应部的试剂进行反应，得到包含多个白细胞粒子的待测试液，使得所述白细胞粒子逐一流经光学检测装置的流动室。
91.所述光学检测装置50可包括：上述具有光源的光学子系统、流动室和至少两个检测器。所述检测器分别用于获得第一染色剂和第二染色剂所产生的光学信号。所述流动室，供诸如白细胞粒子的血液粒子排队通过。至少两个检测器用于收集经过流动室的血液粒子的光学信号，尤其是光强度信号。
92.在具体的样本分析系统中，所述至少两个检测器例如包括检测在流动室中流动的粒子的荧光信号的第一检测器，即，荧光检测器。所述至少两个检测器还包括第二检测器。所述第二检测器与所述光源和流动室所在的直线呈一定角度布置，以检测在流动室中流动
的粒子的侧向散射光。任选地，还可包括第三检测器，所述第三检测器通常布置在光源和流动室所在的直线上，和光源分别布置在流动室的两侧，以检测在流动室中流动的粒子的前向散射光。
93.数据处理装置70配置为根据至少光学信号，检测出流经所述流动室的血液粒子，得到对应白细胞粒子的检测结果。
94.输出部90配置为输出对应所述血液(例如白细胞)粒子的检测结果。
95.根据本发明前述的方法，所述至少两种检测器包括荧光检测器和侧向散射光检测器，且所述数据处理装置配置为当所述计算机程序被所述处理器执行时，进一步执行上述本发明的样本检测方法的各个步骤。
96.根据本发明的上述方法，该样本分析系统的数据处理装置利用荧光信号和侧向散射光信号，可进一步对白细胞进行分类，并对经分类的白细胞进行准确计数。
97.该样本分析系统的数据处理装置还可同时使用荧光、前向散射光和侧向散射光获得三维散点图，从而更好地对白细胞进行分类，并对经分类的白细胞进行准确计数。
98.在另一方面，本发明涉及一种用于分析白细胞的组合物，包括：
99.溶血剂，其不包含表面活性剂；
100.第一染色剂，其包括核酸染料，所述核酸染料能对细胞中的核酸进行染色；和
101.第二染色剂，其包括还原性染料和过氧化氢，所述还原性染料能在白细胞内存在过氧化物酶的位置形成有色沉淀。
102.以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
103.实施例1
104.配制如下组成的白细胞检测试剂盒：
105.溶血剂：
[0106][0107]
第一染色剂：
[0108]
花菁类化合物
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0.6mg
[0109]
乙二醇
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20ml
[0110]
第二染色剂：
[0111][0112]
在将新鲜抗凝血4μl加入到上述的1ml试剂(其中，溶血剂900μl；第一染色剂20μl；第二染色剂80μl)中，经the advanced osmometer model 3250测量渗透压为642mosm/kg。
[0113]
另取新鲜抗凝血4μl加入到上述的1ml试剂，在温度保持42℃的条件下，混合处理
60秒后用激光流式法(激发波长633～635nm)检测细胞。采用荧光检测器测定细胞的荧光信号，采用侧向散射光检测器测定细胞的侧向散射光信号。侧向散射光和荧光所形成的二维散点图，如图1所示。由图1可知，该实施例提供的白细胞检测试剂盒可以准确地对白细胞进行分类。
[0114]
实施例2
[0115]
配制如下组成的白细胞检测试剂盒：
[0116]
溶血剂：
[0117][0118]
第一染色剂：
[0119]
花菁类化合物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6mg
[0120]
乙二醇
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20ml
[0121]
第二染色剂：
[0122][0123]
参照实施例1中的方法测量渗透压，结果为213mosm/kg。
[0124]
参照实施例1中的方法反应并生成侧向散射光和荧光所形成的二维散点图，如图2所示。由图2可知，该实施例提供的白细胞检测试剂盒可以准确地对白细胞进行分类。
[0125]
实施例3
[0126]
配制如下组成的白细胞检测试剂盒：
[0127]
溶血剂：
[0128][0129]
第一染色剂：
[0130]
花菁类化合物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6mg
[0131]
乙二醇
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20ml
[0132]
第二染色剂：
[0133][0134]
参照实施例1中的方法测量渗透压，结果为158mosm/kg。
[0135]
参照实施例1中的方法反应并生成侧向散射光和荧光所形成的二维散点图，如图3所示。由图3可知，该实施例提供的白细胞检测试剂盒可以准确地对白细胞进行分类。
[0136]
实施例4
[0137]
配制如下组成的白细胞检测试剂盒：
[0138]
溶血剂：
[0139][0140][0141]
第一染色剂：
[0142]
花菁类化合物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6mg
[0143]
乙二醇
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20ml
[0144]
第二染色剂：
[0145][0146]
参照实施例1中的方法测量渗透压，结果为247mosm/kg。
[0147]
参照实施例1中的方法反应并生成侧向散射光和荧光所形成的二维散点图，如图4所示。由图4可知，该实施例提供的白细胞检测试剂盒可以准确地对白细胞进行分类。
[0148]
实施例5
[0149]
配制如下组成的白细胞检测试剂盒：
[0150]
溶血剂：
[0151][0152]
第一染色剂：
[0153]
吖啶橙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6mg
[0154]
乙二醇
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20ml
[0155]
第二染色剂：
[0156][0157]
参照实施例1中的方法测量渗透压，结果为251mosm/kg。
[0158]
参照实施例1中的方法反应并生成侧向散射光和荧光所形成的二维散点图，如图5所示。由图5可知，该实施例提供的白细胞检测试剂盒可以准确地对白细胞进行分类。
[0159]
实施例6
[0160]
配制如下组成的白细胞检测试剂盒：
[0161]
溶血剂：
[0162][0163]
第一染色剂：
[0164]
噻唑橙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6mg
[0165]
乙二醇
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20ml
[0166]
第二染色剂：
[0167][0168]
参照实施例1中的方法测量渗透压，结果为316mosm/kg。
[0169]
参照实施例1中的方法反应并生成侧向散射光和荧光所形成的二维散点图，如图6所示。由图6可知，该实施例提供的白细胞检测试剂盒可以准确地对白细胞进行分类。
[0170]
实施例7
[0171]
配制如下组成的白细胞检测试剂盒：
[0172]
溶血剂：
[0173][0174]
第一染色剂：
[0175]
花菁类化合物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6mg
[0176]
乙二醇
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20ml
[0177]
第二染色剂：
[0178][0179][0180]
参照实施例1中的方法测量渗透压，结果为152mosm/kg。
[0181]
参照实施例1中的方法反应并生成侧向散射光和荧光所形成的二维散点图，如图7所示。由图7可知，该实施例提供的白细胞检测试剂盒可以准确地对白细胞进行分类。
[0182]
实施例8
[0183]
配制如下组成的白细胞检测试剂盒：
[0184]
溶血剂：
[0185][0186]
第一染色剂：
[0187]
花菁类化合物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6mg
[0188]
乙二醇
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20ml
[0189]
第二染色剂：
[0190][0191]
参照实施例1中的方法测量渗透压，结果为379mosm/kg。
[0192]
参照实施例1中的方法反应并生成侧向散射光和荧光所形成的二维散点图，如图8所示。由图8可知，该实施例提供的白细胞检测试剂盒可以准确地对白细胞进行分类。
[0193]
实施例9考察反应时间对区分效果的影响
[0194]
按照实施例1的记载配制反应试剂一式三份，分别处理40秒、60秒和120秒后用激光流式法(激发波长633～635nm)检测细胞。采用荧光检测器测定细胞的荧光信号，采用前向散射光检测器和侧向散射光检测器分别测定细胞的前向散射光和侧向散射光信号。前向散射光和侧向散射光，和前向散射光和荧光所形成的二维散点图分别如图9所示。
[0195]
由图9可知，随着孵育时间的延长，白细胞群的荧光逐渐增加，反应时间为120秒时仍可有效区分但逐渐有超出检测范围的趋势，当孵育时间为60秒时，不同白细胞具有较为理想的分群效果。
[0196]
对比例1使用破坏白细胞的形态和结构完整性的溶血剂
[0197]
配制如下组成的白细胞检测试剂盒：
[0198]
溶血剂：
[0199][0200]
第一染色剂：
[0201]
花菁类化合物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6mg
[0202]
乙二醇
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20ml
[0203]
第二染色剂：
[0204][0205]
参照实施例1中的方法测量渗透压，结果为85mosm/kg。
[0206]
参照实施例1中的方法反应并生成侧向散射光和荧光所形成的二维散点图，如图10所示。
[0207]
由图10可知，当使用的溶血剂溶血能力过强，无法维持白细胞的形态和结构完整性的情况下，即使使用核酸染料和还原性染料染色无法将白细胞进行准确区分。
[0208]
对比例2
[0209]
配制如下组成的白细胞检测试剂盒：
[0210]
溶血剂：
[0211][0212]
第一染色剂：
[0213]
cy5.5羧酸
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6mg
[0214]
乙二醇
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20ml
[0215]
第二染色剂：
[0216][0217][0218]
参照实施例1中的方法反应并生成侧向散射光和荧光所形成的二维散点图，如图11所示。
[0219]
由图11可知，当使用cy5.5羧酸染色剂时，即使保持白细胞的形态和结构完整性，也难以从荧光染料和还原性染料染色这两个维度将白细胞进行准确区分。
[0220]
对比例3
[0221]
配制如下组成的白细胞检测试剂盒：
[0222]
溶血剂：
[0223][0224]
第一染色剂：
[0225]
花菁类化合物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6mg
[0226]
乙二醇
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20ml
[0227]
第二染色剂：
[0228]
碱性红
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
200mg
[0229]
乙醇
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10ml
[0230]
tris-盐酸缓冲液(0.05m)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
190ml
[0231]
参照实施例1中的方法反应并生成侧向散射光和荧光所形成的二维散点图，如图12所示。
[0232]
由图12可知，当使用针对细胞颗粒的碱性红染色剂，即使保持白细胞的形态和结
构完整性，也难以从核酸染料侧向散射光这两个维度将白细胞进行准确区分。
[0233]
实施例10使用本发明的溶血剂和第一染色剂进行检测
[0234]
配制如下组成的白细胞检测试剂盒：
[0235]
溶血剂：
[0236][0237]
第一染色剂：
[0238]
花菁类化合物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6mg
[0239]
乙二醇
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20ml
[0240]
按照实施例1中记载的方法首先使用溶血剂和第一染色剂处理血样，随后在明场下观察经处理的白细胞，结果如图13所示，在经溶血剂和第一染色剂处理后，在显微镜明场下白细胞形态结构完整，能看到清晰的细胞膜、细胞质和细胞核结构。随后在显微镜荧光下，观察经处理后的血样，结果如图14所示，能观察到细胞核发出清晰的荧光。
[0241]
接下来，在溶血剂和第一染色剂处理前后，用激光流式法(激发波长633～635nm)检测细胞。采用测定角度为90度的前向荧光测定细胞的荧光信号，采用测定前方低角度散射光测定细胞的前向散射光信号，结果如图15所示，不同种类细胞荧光染色程度不同引起荧光信号上的差异。
[0242]
实施例11使用本发明的溶血剂和第二染色剂进行检测
[0243]
配制如下组成的白细胞检测试剂盒：
[0244]
溶血剂：
[0245][0246]
第二染色剂：
[0247][0248]
首先，取未处理的新鲜抗凝血血样于显微镜明场下观察，结果如图16所示。随后按照实施例1中记载的方法使用溶血剂和第二染色剂处理该血样，在明场下观察经处理的白细胞，结果如图17所示。比较图16和17可知，在溶血剂和第二染色剂处理前，白细胞在显微镜明场下轮廓较模糊，细胞整体透明无色；而溶血剂和化学显色剂处理后，白细胞在显微镜
明场下形态结构完整，并且在某些白细胞细胞质中能看到清晰的有色沉淀颗粒。
[0249]
在溶血剂和第二染色剂处理前后，用激光流式法(激发波长633～635nm)检测细胞。采用测定前方低角度散射光测定细胞的前向和侧向散射光信号，结果如图18所示。可见，经过溶血剂和化学显色剂处理后，不同种类白细胞的过氧化物酶含量差异使细胞内形成颗粒沉淀数量不同，即细胞内部复杂度改变程度不一样，引起侧向散射光的差异。
[0250]
上述内容仅是示范性的实施方式，并不应被解释为对本公开保护范围的限制。显而易见地，在本公开保护范围内所做出的任何修改和变化仍属于本公开的说明书所披露和权利要求所限定的范围。