一种快速提取植物韧皮部汁液的方法与流程

1.本发明属于草本植株汁液提取技术领域，尤其涉及一种快速提取植物韧皮部汁液的方法。


背景技术：

2.韧皮部是连接植物地上和地下部的重要维管组织，作为维管系统重要组成部分，不仅与维管系统其它部分一起发挥传递信息、机械支持的作用，还从光合产物形成部位运输碳水化合物、氨基酸和其它营养物到营养的储藏和代谢部位，在物质运输过程中发挥重要作用，且运输和分配的结果直接影响植物的生长过程、产量和品质。当光合产物在韧皮部进行装载和卸载时，可以清楚的了解到物质的种类和变化，从而反映植株本身的健康状况。进一步研究韧皮部汁液的成分来判断植株的健康状况，为植物养分状态的检测提供了新的思路。
3.现有韧皮部汁液提取的方法主要有：k2‑
edta渗出法、切开法、蚜虫吻针法、离心法等。k2‑
edta渗出法主要是将叶柄的尖端或者一块树皮组织放在k2‑
edta溶液中在温室中孵育几个小时，这种方法适用于大多数植物，可用于收集大量的韧皮部汁液。不足之处是通过k2‑
edta方法获得的韧皮部泌物可能被木质部和其他组织的物质污染。这种污染的源头很可能是由于edta作为螯合剂的作用，它可能从进入渗出液的细胞壁释放出金属离子，例如ca
2+
。切开方法可用于切割韧皮部组织如葫芦和蓖麻子后“自发出血”的植物。蚜虫吻针法主要是使用昆虫探针来收集韧皮部汁液，在昆虫进食韧皮部汁液的过程中切下探针，并使用微毛细管收集渗出液。该方法费力，费时并且可以收集的样本量少，无法满足正常的代谢物分析。且昆虫唾液蛋白和其他成分可能会影响收集的韧皮部汁液的化学组成。离心法主要是通过树汁来获得韧皮部汁液，所以通过离心分离树皮组织来实现的，这种方法虽然可以精确的估计韧皮部汁液成分，但是在离心的过程中细胞组分会对韧皮部汁液造成污染。


技术实现要素：

4.针对上述技术问题，本发明提供一种快速提取植物韧皮部汁液的方法，采用毛细玻璃管
‑
吹尘球相结合的方式，用毛细玻璃管对叶柄韧皮部汁液迅速提取，获得汁液，再通过吹尘球的气压将毛细玻璃管中的汁液储存到离心管中，可以快速直接提取和收集韧皮部汁液，解决了韧皮部渗出汁液量少，韧皮部汁液的提取和收集都费时费力的问题。本发明操作简单，成本低，中间污染少，提取的汁液纯度的较高。
5.本发明根据电镜观察的叶柄结构确定维管束的位置；首先用乙醇消毒后的刀片快速将植株叶片切下，用去离子水冲洗断面，并用脱脂棉吸取第一滴汁液，静置1分钟；然后使用毛细玻璃管，使其与叶柄断面垂直；再将毛细玻璃管口对准断面韧皮部筛管所渗出的汁液，依次将汁液提取到毛细玻璃管中；最后将吸取汁液后的毛细玻璃管尾端放置到吹尘球的出风口里面，通过挤压吹尘球将汁液压至收集管中并将收集管密封好再存储。
6.本发明通过以下技术方案实现：
7.一种快速提取植物韧皮部汁液的方法，包括以下步骤：
8.准备工作：准备毛细玻璃管、吹尘球、刀片、收集管；在取样之前选择同株样本，通过电子显微镜先找到植物叶片的叶柄断面处的维管束，得到叶柄断面处的维管束结构图；
9.叶柄切割：用消毒后的刀片从植物的叶柄靠近茎秆处将叶子切下，将切下的叶片的叶柄断面朝下；
10.伤口处理：用去离子水冲洗叶片的叶柄断面伤口处；
11.韧皮部汁液提取：对应准备工作中得到的电子显微镜下的叶柄断面处的维管束结构图，找到叶片的叶柄断面处的维管束，将毛细玻璃管与叶片的叶柄断面垂直，提取维管束中韧皮部筛管所渗出的汁液；
12.韧皮部汁液收集：吸取汁液后将毛细玻璃管的尾端放置到吹尘球的出风口里面，通过空气压缩将毛细玻璃管的汁液压至收集管中封存。
13.上述方案中，所述准备工作的步骤中的刀片浸泡在乙醇中进行消毒。
14.上述方案中，所述准备工作的吹尘球为保拉吹尘球。
15.上述方案中，所述伤口处理步骤中，还包括对伤口处理后叶片的叶柄断面用脱脂棉吸取第一滴汁液后静置。
16.进一步的，用脱脂棉吸取第一滴汁液后静置1分钟。
17.上述方案中，所述韧皮部汁液提取中将毛细玻璃管放置在与叶片的叶柄断面垂直处以下，再将毛细玻璃管口对准叶柄断面韧皮部筛管所渗出的汁液。
18.上述方案中，所述韧皮部汁液收集的步骤具体为：
19.提取完韧皮部汁液后，将毛细玻璃管尾端放置到吹尘球的出风口里面，并用手捏住出风口和毛细玻璃管的接触处，使得出风口形成密封，通过挤压吹尘球的鼓起部分，使得毛细玻璃管中的汁液快速的储存到收集管中。
20.进一步的，将毛细玻璃管尾端放置到吹尘球的出风口里面1cm处。
21.上述方案中，还包括韧皮部汁液放置的步骤：将密封好的收集管放置在液氮中备用。
22.上述方案中，所述植物为切割植物叶柄组织后韧皮部汁液自动渗出的植物。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明借助毛细玻璃管和吹尘球结合，可以迅速的提取韧皮部汁液，且迅速的将毛细玻璃管中的汁液收集到收集管中；在使用毛细玻璃管的毛细作用去收集植物韧皮部汁液，不需要特殊仪器，收集工具成本低，操作简单，汁液杂质少，经济性和重复性高。
附图说明
24.图1是本发明一实施方式的本发明原理示意图；
25.图2是本发明一实施方式的叶柄的电镜图，其中(a)为叶柄断面电镜图，(b)为部分放大图；
26.图3是本发明一实施方式的实验组和对照组物质的包含关系图；
27.图4是本发明一实施方式的实验组和对照主要物质浓度对比图。
28.图中，1、吹尘球；2、吹风口；3、毛细玻璃管。
具体实施方式
29.下面结合附图详细描述本发明的实施例，通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
30.本发明针对的植物为叶柄组织后韧皮部汁液自动渗出的植物，一种快速提取植物韧皮部汁液的方法，包括以下步骤：
31.准备工作：准备毛细玻璃管3、吹尘球1、刀片、收集管，所述刀片浸泡在乙醇中进行消毒；在取样之前选择同株样本通过电子显微镜先找到植物叶片的叶柄断面处的维管束，得到叶柄断面处的维管束结构图，如图2所示，其中(a)为叶柄断面电镜图，(b)为部分放大图；
32.叶柄切割：用消毒后的刀片快速的从植物的叶柄靠近茎秆处将叶子切下，将切下的叶片的叶柄断面朝下；
33.伤口处理：用去离子水冲洗叶片的叶柄断面伤口处，并用脱脂棉吸取第一滴汁液后静置1分钟；
34.韧皮部汁液提取：对应准备工作中得到的电子显微镜下叶柄断面处的维管束结构图，找到叶片的叶柄断面处的维管束，将毛细玻璃管3与叶片的叶柄断面垂直，将毛细玻璃管3放置在与叶片的叶柄断面垂直处以下，再将毛细玻璃管3口对准叶柄断面处韧皮部筛管所渗出的汁液，依次提取韧皮部筛管所渗出的汁液；
35.韧皮部汁液收集：提取完韧皮部汁液后，将毛细玻璃管3尾端放置到吹尘球1的出风口2里面，并用手捏住出风口2和毛细玻璃管3的接触处，使得出风口2形成密封，通过挤压吹尘球1的鼓起部分，使得毛细玻璃管3中的汁液快速的储存到收集管中，如图1所示。韧皮部汁液放置：将密封好的收集管放置在液氮中备用，可以减少汁液中物质的损坏和挥发。
36.优选的，将毛细玻璃管3尾端放置到吹尘球1的出风口2里面1cm处，可以增大气压，使得毛细玻璃管中的汁液全部挤压到收集管中储存，减少汁液的损耗。
37.本发明针对现有技术存在的不足，提出了“毛细管
‑
吹尘球1”法，该方法能够直接快速收集汁液并将其存储到收集管中。毛细玻璃管3的原理来自毛细作用。吹尘球1主要是通过挤压中间的鼓起球，造成空气的流通和挤压，且吹尘球1经济性和重复性比较高。用毛细玻璃管3提取韧皮部汁液后，将毛细玻璃管3尾部放到吹尘球1出风口2里面，通过挤压鼓起球部分，将毛细玻璃管3中的汁液挤压到离心管中。
38.根据叶柄的电镜图可以观察到韧皮部在维管束中，维管束中的韧皮部筛管围绕在木质部周围，切断叶柄时，光合产物从韧皮部筛管中渗出，形成小滴的半球状汁液。由于渗出汁液量比较少，用移液器提取和储存时，会造成汁液的浪费，而毛细玻璃管3的直径比较小，用毛细玻璃管3提取，效率比较高而且还可以避免木质部汁液的污染和韧皮部汁液的浪费，从而使得提取的汁液纯度更高。再用吹尘球1将毛细玻璃管3中的汁液，挤压到离心管中进行储存，使得汁液在未凝固时就已经被收集到离心管中，减少了污染和浪费。
39.本法采用毛细作用和气压相结合将韧皮部汁液快速的提取且储存，解决了目前韧皮部汁液无法快速收集的问题。
40.在本实施例中，所述毛细玻璃管3是0.5mm型号，通过毛细作用提取渗出汁液，吹尘球1是采用保拉paola的5903型号，通过挤压鼓起球使空气压缩，挤压出毛细玻璃管3中的汁液。本发明于2019年10月至2019年12月在江苏大学现代农业装备与技术教育部重点实验室
玻璃温室中进行实验，所述植物为黄瓜，黄瓜品种选用六朝的绿翡翠。为保证韧皮部汁液的正常提取，本发明采用珍珠岩
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营养液方式进行样本培育，采用山崎培方营养液进行浇灌。从2019年10月至12月，共培育了80天，为了保证样本的代表性，对30株植株进行采样。
41.一种快速提取植物韧皮部汁液的方法，包括以下步骤：
42.准备工作：准备0.5mm毛细玻璃管3、吹尘球1、刀片和1.5ml离心管；将刀片浸泡在乙醇中，具体将乙醇倒入100ml的玻璃烧杯中，将刀片浸入乙醇中进行消毒处理；在取样之前选择同株样本，通过电子显微镜先找到植物叶片的叶柄断面处的维管束，得到叶柄断面处的维管束结构图；对取样部分，从顶芽向下数到第7片叶子做好标记作为叶柄的断面处。
43.叶柄切割：叶片中的叶绿体通过光合作用产生光合产物，经过韧皮部筛管运输到各个位置促进植物生长。光合产物从叶柄中的韧皮部筛管流出，经过茎秆中的韧皮部筛管向上运输到顶芽促进植株纵向生长，向下促进果实生长。首先轻捏着靠近叶片的叶柄处，用消毒后的刀片从植物的叶柄靠近茎秆处将叶子切下，将切下的叶片的叶柄断面朝下。在该步骤中，将切下的叶片固定于工作台高处，将断面朝下，具体为将叶片用棉绳系在工作台上，不可用棉绳过度系紧，防止挤压使得细胞破碎，对韧皮部汁液造成污染，断面朝下，断面下方20cm处不得放置任何物体。
44.伤口处理：用去离子水冲洗叶片的叶柄断面伤口处，为减少污染用脱脂棉吸取第一滴汁液后静置1分钟；
45.韧皮部汁液提取：首先将0.5mm的毛细玻璃管3，放在距离叶柄断面垂直的5mm处，再将毛细玻璃管3口对准断面韧皮部筛管所渗出的汁液，在提取韧皮部汁液时要用拇指和食指轻轻的捏着毛细玻璃管3的中间部位且不可过度挤压。由于叶柄较细，韧皮部围绕在木质部周围，首先要在断面上根据之前电镜下得到叶柄断面处的维管束结构图，找到该叶柄的维管束如图2所示，再将0.5mm的毛细玻璃管3对准韧皮部筛管所渗出的汁液，依次提取渗出的汁液，防止取错汁液造成误差。
46.韧皮部汁液收集：将毛细玻璃管3的尾端放置到吹尘球1的出风口2里面，通过空气压缩将汁液压至1.5ml的离心管中，当提取的汁液达到0.5ml至1ml后，将1.5ml的离心管密封好，具体步骤是提取完韧皮部汁液后，将0.5mm的毛细玻璃管3尾端放置到距离吹尘球1出风口2里面1cm处，并用手捏住出风口2和毛细玻璃管3的接触处，使得出风口2形成密封，通过挤压鼓起球，使得毛细玻璃管3中的汁液高速的储存到1.5ml的离心管中。
47.韧皮部汁液放置：将密封好的1.5ml的离心管放置在
‑
180
°
的液氮中备用。
48.本发明取样方法与edta取样方法效果对比：
49.在取样同时，选择同株样本，采用edta取样方法进行取样，进行样本对比实验。分别对样本中所含物质和主要物质的浓度进行对比分析
50.以本发明的“毛细管
‑
吹尘球”法取样样本为实验组，以edta法取样样本为对照组，两组样本经前处理和gcms上机测试，结果表明：
51.①“
毛细管
‑
吹尘球”法提取韧皮部汁液检测到代谢物的种类有46种，edta提取法提取韧皮部汁液检测到的代谢物种类有29种，详细物质如表1所示。
52.表1实验组与对照组检测到的代谢物对比表
53.[0054][0055]
②
采用edta提取法提取韧皮部汁液检测的物质与“毛细管
‑
吹尘球”法检测的相同的物质有23种，其中的包含关系如图3韦恩图所示。通过这两种方法提取样本，检测到的物
质差异不大，用“毛细管
‑
吹尘球”法检测到的物质不仅包含了edta提取法检测到的主要物质，还包含edta提取法检测不到的物质。
[0056]
③
两种取样方法样本中主要物质的浓度，如图4所示，实验数据表明：两种取样方法检测到的物质的变化趋势是相同的；“毛细管
‑
吹尘球”法检测到的物质的浓度要高于edta提取法检测到的物质的浓度，主要原因是在edta提取的过程中，将叶片放入蒸馏水中继续渗出韧皮部汁液，会对样本进行稀释。本发明可以快速直接提取和收集韧皮部汁液，解决了韧皮部渗出汁液量少，韧皮部汁液的提取和收集都费时费力的问题。本发明操作简单，成本低，中间污染少，提取的汁液纯度的较高。
[0057]
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。