1.本发明具体涉及一种成年横膈膜整体免疫染色的前处理方法。
背景技术：
2.神经肌肉接头(nmj)是一种突触连接，它的三个组成结构为运动神经元、肌纤维和末梢雪旺细胞(darabid等人，2014年，li等人，2018年；wu等人，2010年)。nmj的形态学变化是许多神经肌肉疾病的标志，比如特征肌萎缩侧索硬化症(als)、脊髓性肌萎缩(sma)和肌营养不良症(md)(fischer等人)。病理学特征如轴突终末失去神经支配、肿胀、多神经支配、nmj复杂性丧失、nmj断裂等已被充分认识。这些都可以通过免疫染色简单地识别，有效表示突触功能。
3.在小鼠模型中，对一些薄而扁平的肌肉(如横膈膜、腹横肌、胸骨三角肌和颅肌)进行了整体染色(murray等人，2010年)。对整个神经支配模式的观察可以对病理生理变化进行无偏见的评估，运动单位大小、轴突分支和对疾病的选择易损性也可以得到充分的描述(banks等人，2003年)。在这些扁平的肌肉中，对nmj的理解尤其令人感兴趣，因为横膈膜功能障碍与呼吸功能密切相关。事实上，运动神经元疾病(如als)患者的呼吸困难可通过横膈膜无力来评估，例如，经皮膈神经刺激的诱发反应可预测als患者的通气不足和存活率(pinto等人，2009年；pinto等人，2012年)。横膈膜nmj缺失的病理学是非常重要的，许多研究利用其来检查nmj的发育，因为它是扁平的，而且容易获得，特别是在胚胎或新生儿阶段。
4.然而，对成年期完整nmj结构模式的了解仍然有限，因为横膈膜变厚并被致密的结缔组织覆盖(sefton等人，2018年)，导致抗体渗透性差，不易进行免疫染色。
技术实现要素：
5.针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种成年横膈膜整体免疫染色的前处理方法。
6.为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
7.一种成年横膈膜整体免疫染色的前处理方法，包括以下步骤：
8.(1)将解剖后的横膈膜平铺在平板上，使横膈膜展开；
9.(2)将1毫升ph7.4，4％多聚甲醛pbs缓冲溶液滴到另一平板上；
10.(3)将步骤(1)中附着有横膈膜的平板放在步骤(2)得到的平板上，横膈膜位于两平板之间，以十字交叉顺序拧紧螺栓和螺母，直到无法再拧紧为止；
11.(4)将步骤(3)得到的整个装置置于4℃下保持20分钟，固定横隔膜；
12.(5)将横隔膜从平板上取出，放在装有pbs缓冲溶液的容器中；
13.(6)清除横隔膜表面的结缔组织；
14.(7)去除结缔组织后，再次将横膈膜夹在两平板之间，以十字交叉顺序拧紧螺栓和螺母；直到无法再拧紧为止；4℃下保持20分钟；
15.(8)然后将横膈膜从装置中取出，在4℃下浸入ph7.4，4％多聚甲醛pbs缓冲溶液中
20分钟；
16.(9)然后在室温下用含有0.1％甘氨酸的pbs缓冲液洗涤横隔膜10分钟。
17.进一步地，步骤(1)与步骤(2)中，所述平板具有至少一个平整的表面，每个平板上设置有至少二个通孔。
18.进一步地，步骤(1)中，平板的平整表面与成年横膈膜接触。
19.进一步地，步骤(1)与步骤(2)中，所述平板的厚度大于等于6mm。
20.本发明的有益效果是：
21.(1)本发明通过将横膈膜夹在两块有机玻璃片之间，扩大了成年横膈膜肌纤维之间的空间，使结缔组织易于切除，而且受压的横膈膜均匀扩张，即使在移除装置后，横膈膜仍然保持平坦和扩张，压力并没有损伤横膈膜，横膈膜厚度变薄，有利于成年横膈膜整体免疫染色，免疫染色图像背景颜色较浅，更容易观察图像。
22.(2)采用本发明的前处理方法处理横膈膜，然后对成年横膈膜整体免疫染色，染色后的图像中，可辨认形态特征的细节，能够提高评估发育和退行性神经肌肉表型的可靠性。本发明的前处理方法快速、简单，便于提供nmj分布的全面视图，其中包含单个nmj的完整详细信息。
23.(3)本发明提供了一个方便和通用的方法能够改善神经支配网络的可视化，不仅适用于免疫标记，而且适用于经典的酯酶银染色。
24.(4)现有组织透明技术，如3disco/idisco、cubic是最先进的技术，但在成像前需要许多耗时的步骤(总共超过10天)，当研究横膈膜等扁平肌肉时，图像细节没有改善，采用本发明的前处理方法，基于常规的免疫染色程序，可以在2天内成功完成，而且本发明的前处理方法，可以在不清除筋膜的情况下帮助抗体渗透。
25.(5)本发明的前处理方法可以有效地伸展横膈膜肌肉，同时保持整体结构的完整性；整个神经支配结构(用抗nf和抗sv2标记)被清晰地免疫染色，便于观察，有利于分析横膈膜的神经支配，同时保留不同类型的nmj结构特征。
附图说明
26.图1是通过肌肉拉伸准备横膈膜的示意图；其中(a)是用来按压横膈膜的装置示意图，(b)是横膈膜位于有机玻璃上的示意图，(c)是装置关闭后，横膈膜在两片有机玻璃之间变平并展开的示意图，(d)是装置拆除后，横隔膜保持扁平状态的示意图，(e)是2.5月龄雄性小鼠受压和未受压横膈膜的长度(腹侧到背侧)和宽度(半横膈膜中最宽的距离)的统计结果图，(f)是受压和未受压横膈膜面积统计结果图，(g)是受压和未受压横膈膜厚度统计结果图，(h)是肌纤维伸展情况的比较结果图，肌动蛋白丝用phalloidin-594标记，phalloidin(红色)，dapi(蓝色)。
27.图2是成年小鼠横膈膜中的nmjs示意图，(a)是未受压成年横膈膜的代表性免疫染色图像；框1-3中区域的放大图从左到右依次排列，密集的平行绿色线(白色箭头所指的是平行绿色线)是肌肉纤维发出的自体荧光信号；nf/sv2(绿色)，btx(红色)；(b)是受压的成年横膈膜的典型免疫染色图像，受神经支配的nmjs以黄色显示，框1-3中区域的放大图从左到右依次排列，nf/sv2(绿色)，btx(红色)，(c)是未受压和受压横膈膜突触后面积的统计图，(d)是破碎指数统计图，(e)是乙酰胆碱酯酶银法处理未受压的成年横膈膜的代表性图，
框1-2中区域的放大图从上到下依次排列，(f)是乙酰胆碱酯酶银法处理受压的成年横膈膜的代表性图像，轴突(深棕色)；终板(靛蓝)，框1-2中区域的放大图从上到下依次排列。
28.图3是sod1
g93a
小鼠病变nmjs的形态学变化，其中，(a)是疾病末期(4个月大)，sod1
g93a
小鼠横膈膜的代表性图像，大量nmjs是去神经的(白色箭头)，框1-3中区域的放大图从左到右依次排列，(b)是年龄匹配对照野生型和sod1
g93a
小鼠横膈膜突触后面积的统计，对每个横膈膜共90个终板进行了分析，每组3只小鼠，不显著，(c)是破碎指数统计，对每个横膈膜共90个终板进行分析，每组3只小鼠，非显著性，(d)是神经占用率统计，对每个横膈膜的1000多个终板进行了分析，每组3只小鼠，(e)是nmjs的高倍共聚焦图像，wt表示对照野生型小鼠横膈膜的nmjs的高倍共聚焦图像；多个神经支配的nmjs(白色箭头a)，部分神经支配的nmjs(蓝色箭头b)；完全失去神经支配的nmjs(紫色箭头c)，nf/sv2(绿色)，btx(红色)。
29.图4是图2b中的受压的横膈膜的一个放大版的代表性免疫染色图像，nf/sv2(绿色)，btx(红色)。
30.图5是用三种不同荧光团对横膈膜进行整体免疫染色示意图，nf(绿色)、sv2(蓝色)、btx(红色)。
31.图6是图2b中6个月前被染色的样本，再次重新获得的图像，nf/sv2(绿色)，btx(红色)。
具体实施方式
32.以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当指出的是，具体实施方式只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限定。以下实施例中所采用的试剂或/和装置均能够通过商业途径购得。以下实施例中所述的pbs缓冲溶液均是指0.1mol/l，ph7.4的pbs缓冲溶液，1m＝1mol/l。
33.实施例1
34.一种用于成年横膈膜整体免疫染色前处理的装置，如图1a所示，包括至少两个平板，其中至少有两个平板，他们分别具有至少一个平整的表面，每个平板上均设置有至少二个通孔。
35.在使用时，将平板的平整表面与成年横膈膜接触。
36.一般，5cm
×
5cm的平板适用于所有成年后的小鼠的横膈膜。也可以根据动物的横膈膜大小进行相应地调整平板的大小，本发明不对平板的大小进行限定。
37.在一些优选的方式中，平板可以采用多种形状，比如长方形、圆形、菱形、其他多边形等，不管是什么形状，需要确保平板覆盖横膈膜，不能使横膈膜露出平板。
38.在一些优选的方式中，通孔可以是螺丝孔，也可以是平滑的孔，本发明不对通孔的样式进行限定。通孔的位置，可以根据实际情况来确定，本实施例中，如图1a所示，在距离边缘1cm的地方，分别在四个角处钻孔，这样的分配可以适用于各种成年后的横膈膜。
39.在一些优选的方式中，确保通孔是对称设置，这样使得横膈膜受力更加均匀。
40.在一些优选的方式中，平板的厚度大于等于6mm，本实施例中，平板的厚度为6mm，如果平板的厚度小于6mm，会影响平板在施压后的弯曲度，进而影响压力的均匀性。
41.在一些优选的方式中，该装置还包括紧固件，所述紧固件可以是螺栓与螺母，也可
以是螺丝，也可以是其他的紧固件。
42.在一些优选的方式中，平板采用透明材料制成，平板可以是有机玻璃板，平板也可以是透明塑料板。平板采用透明材料，方便观察横膈膜在装置里被挤压的情况。
43.实施例2
44.实验中所有小鼠均在标准条件下饲养，光照12小时，黑暗12小时，可自由获得食物和水。所有动物实验程序均经浙江大学动物保护与使用委员会批准。
45.横膈膜的获得：切开小鼠腹部皮肤进入腹腔，从横膈膜上切下镰状韧带，将肝脏与横膈膜分开，用镊子夹住横膈膜的脚肌，轻轻向外拉，分离横膈膜。横膈膜可以用弧形解剖剪沿背侧壁进行解剖，在pbs中清洁解剖的横膈膜，以去除血液，并通过解剖小腿肌肉和脂肪组织略微修整(sefton等人，2018年)。也可以采用现有技术中的其他的方式获得横膈膜，本发明不对横膈膜的获取方式进行限定。
46.一种成年横膈膜整体免疫染色的前处理方法，包括以下步骤：
47.(1)将解剖后的横膈膜放在一块有机玻璃板(5厘米
×
5厘米)上，并轻轻地平铺展开，以确保肌肉不会皱折，本实施例中所采用的装置如图1a所示。
48.(2)将1毫升ph7.4，4％(w/v)多聚甲醛(pfa)pbs缓冲溶液滴到另一块有机玻璃片上。本实施例中，将多聚甲醛溶液，滴在有机玻璃片正中央。
49.(3)将附着有横膈膜的有机玻璃片放在滴有多聚甲醛pbs缓冲溶液的有机玻璃片上，用手以十字交叉顺序轻轻拧紧螺栓和螺母(即按对角顺序拧紧螺栓)；用螺丝刀按同样的顺序进一步拧紧，直到无法再拧紧为止。
50.(4)将步骤(3)得到的整个装置置于4℃下保持20分钟，以固定横隔膜。这一步骤使结缔组织易于切除，并扩大了肌肉纤维之间的间隙。
51.(5)将横隔膜从有机玻璃片上取下，并放在一个装有pbs的干净培养皿中。具体地，首先去掉螺母、螺栓，然后用镊子小心地将被压过的横隔膜从有机玻璃片上取下，并放在一个有pbs的干净培养皿中。去掉螺栓、螺母之后，横隔膜组织保持其形状、体积大小几乎不变(如图1d所示)。
52.(6)横隔膜表面的结缔组织用#5镊子轻轻清除。有必要去除横隔膜表面的结缔组织，因为这会阻止抗体溶液渗入肌纤维。清理时要格外小心，以免损伤肌肉或神经纤维。
53.(7)去除结缔组织后，再次将肌肉夹在两片有机玻璃片之间(此步骤的操作与之前的步骤一样)，以十字交叉顺序轻轻拧紧螺栓和螺母(即按对角顺序拧紧螺栓)；用螺丝刀按同样的顺序进一步拧紧，直到无法再拧紧为止；4℃下保持20分钟以进一步拉伸。
54.(8)然后将横膈膜从装置中取出，在4℃下浸入ph7.4，4％(w/v)多聚甲醛pbs缓冲溶液中20分钟。
55.(9)然后在室温(rt)下用含有0.1％甘氨酸的pbs缓冲液(w/v)洗涤横膈膜10分钟。
56.非受压对照组：将横膈膜与胸腔固定在一起(不施加压力)，20分钟，并移除结缔组织。其他实施方式与实验组是一样的。
57.横膈膜免疫染色
58.在室温条件下，将横膈膜在1ml封闭缓冲液中培养30分钟，同时轻轻搅拌，所述封闭缓冲液为包括1％triton-x100(v/v)、2％牛血清白蛋白bsa(w/v)和含有4％正常山羊血清(v/v)的pbs缓冲液。将横膈膜组织转移到一种新型阻断缓冲液，所述新型阻断缓冲液包
括抗神经丝和抗突触囊泡蛋白2抗体，抗神经丝蛋白nf抗体(按照1:500稀释，兔单克隆，抗体货号2837s；cell signalling technology公司)和抗突触囊泡蛋白2抗体(sv2浓缩液，按照1:500稀释，小鼠单克隆，dshb)。
59.将上述得到的组织在4℃的缓冲液中孵育过夜，轻轻摇动，第二天用pbs缓冲液洗涤三次，共30分钟。然后，横膈膜肌肉在含有alexafluor488-结合抗体(按照1:1000稀释，山羊抗鼠igg和山羊抗兔igg，invitrogen)和2μg/mlα-银环蛇毒素四甲基罗丹明(t0195，sigma)封闭缓冲液中，于室温下避光孵育1小时。所有孵育和洗涤步骤都在摇动或者晃动中进行。建议在安装前检查样品的荧光信号。如果信号微弱或断断续续，可以重复步骤(3)，再次按压处理，进行抗体处理。
60.随后，横膈膜肌肉用水溶性安装介质固定(f4680，sigma)，盖上盖子，并在4℃下放置过夜，以便安装介质凝固。如果需要长期保存，则用透明指甲油密封试样边缘。标本至少可保存6个月没有明显的荧光强度损失(如图2b和图6所示)。为了评估压力可能导致的肌肉损伤，用phalloidin-594(按照1:1000稀释，a12381，invitrogen)对受压和未受压的横膈膜进行染色，以在室温rt条件下标记肌动蛋白条带1小时。将标本安装、覆盖并在4℃下储存，直到成像。
61.对横膈膜进行乙酰胆碱酯酶银染
62.对横膈膜进行轴突和终板染色(kiernan，1996)。简单地说，在含有0.02m cacl2、0.01m k3[fe(cn)6]和0.01m k4[fe(cn)6]的0.02m tris缓冲液(ph 7.2)中终板染色45分钟。然后用水冲洗横膈膜两次，并通过分级乙醇系列(70％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、二甲苯、100％乙醇、95％乙醇、70％乙醇)在每个溶液中脱水/再水化2分钟。
[0063]
之后，用清水冲洗横膈膜三次。轴突用质量分数20％的硝酸银溶液染色20min，然后用水冲洗三次，用氢醌(质量分数0.2％氢醌在质量分数1％na2so3溶液中)还原银10min，直至轴突呈深棕色或黑色。用水冲洗两次后，在质量分数0.2％氯化金溶液中用金调色3min可进一步提高轴突的对比度。此时，轴突将不那么暗，显影过程在质量分数5％的na2s2o3溶液中停止5分钟。如前所述，将样品安装并覆盖。
[0064]
成像
[0065]
采用leica tcs sp8 x，配备488nm和561nm波长的激光和适当的滤光片组合，在pmt检测器上对红色标记的突触后(簇状乙酰胆碱受体或achrs)和绿色标记的神经部分(nf和sv2)进行成像。变焦因子设置为1.28倍，激光强度、共焦孔径和光电倍增管增益等参数在样品间保持恒定。对于488nm，0.5％的最大激光功率，增益设置为740，偏移量为-1，无平均值。对于561-nm，2.6％的最大激光功率，增益设置为780，偏移量为-1，无平均值。利用las-x软件(leica)将z-stacks投影到单个图像中，不使用z补偿。用10倍物镜收集全装显微照片，然后用lasx缝合。用63x/1.4na油浸物镜测定精细细节。
[0066]
用image j软件测量横膈膜面积和突触后的面积。统计分析采用graphpad prism软件。数据采用双尾t检验，以平均值
±
sem表示。统计学意义上的差异显示为*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。
[0067]
结果分析
[0068]
图1是通过肌肉拉伸准备横膈膜的示意图；其中，non-pressed表示未受压的对照组，pressed表示受压的实验组；(a)是用来按压横膈膜的装置示意图，(b)是横膈膜位于有
机玻璃上的示意图，此时横膈膜没有被按压，(c)是装置关闭后，横隔膜在两片有机玻璃之间变平并展开的示意图，(d)是装置拆除后，横隔膜保持扁平状态的示意图，(e)是2.5月龄雄性小鼠受压和未受压横膈膜的长度(腹侧到背侧)和宽度(半横膈膜中最宽的距离)的统计结果图，每组n＝3只小鼠，p<0.01；(f)是受压和未受压横膈膜面积统计结果图，在image j软件中手动绘制横膈膜轮廓，进行面积计算得到，每组n＝3只小鼠，p<0.01；(g)是受压和未受压横膈膜厚度统计结果图；为了确定厚度，利用样本一侧的背景信号，直到在共焦显微镜下没有检测到信号为止，在横膈膜中心区域周围测量三个点，以获得平均值，n＝3只小鼠，p<0.001。(h)是肌纤维伸展情况的比较，肌动蛋白丝用phalloidin-594标记，h区位于两条明亮的肌动蛋白带之间，下面的1、2是从上图裁剪的单个肌纤维图像，phalloidin(红色)，dapi即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(蓝色)。
[0069]
由图1b和1c所示，受压的横膈膜均匀扩张，即使在移除装置后，横膈膜仍然保持平坦和扩张，如图1d所示。受压横膈膜的长度和宽度都增加了，如图1e所示，显示出比原始面积大约2.5倍(受压的横膈膜面积：8.65
±
0.63cm2；对照组未受压的横膈膜面积：3.49
±
0.34cm2，p<0.01，如图1f所示)。加压横膈膜的厚度也减少了45％(未受压横膈膜厚度：141.6
±
3.6μm；受压横膈膜厚度：78.2
±
0.7μm，p<0.001，如图1g所示)。
[0070]
用phalloidin-594染色肌动蛋白，发现h区空间增加，但没有明显的压力损伤(如图1h所示)。这些数据表明，本发明方法可以有效地伸展横膈膜肌肉，同时保持整体结构的完整性。
[0071]
图2是成年小鼠横膈膜中的nmjs示意图，其中，non-pressed表示未受压的对照组，pressed表示受压的实验组；(a)是未受压成年横膈膜的代表性免疫染色图像；框1-3中区域的放大图从左到右依次排列，密集的平行绿色线(白色箭头指示的部分)是肌肉纤维发出的自体荧光信号；nf/sv2(绿色)，btx(红色)；(b)是受压的成年横膈膜的典型免疫染色图像，受神经支配的nmjs以黄色显示，表示神经丝和sv2覆盖在终板上，框1-3中区域的放大图从左到右依次排列，nf/sv2(绿色)，btx(红色)，(c)是未受压和受压横膈膜突触后面积的统计，每个横膈膜总共测量了30个终板，每组3只小鼠，p<0.01，(d)是破碎指数统计，每组3只小鼠，每个横膈膜总共测量了30个终板，每组3只小鼠，非显著性，(e)是乙酰胆碱酯酶银法处理未受压的成年横膈膜的代表性图，框1-2中区域的放大图从上到下依次排列，(f)是乙酰胆碱酯酶银法处理受压的成年横膈膜的代表性图像，轴突(深棕色)；终板(靛蓝)，框1-2中区域的放大图从上到下依次排列。
[0072]
当横膈膜仅在固有力的作用下伸展(即固定在胸腔内的pfa)，通常免疫标记出现在接近背侧/腹侧较薄的部位，或通常由于面部切除而造成损伤的区域(图2a)。而银环蛇毒素(～8kda)容易到达突触后靶面(achrs)，但是抗体(约150kda)很难与组织深处的抗原结合，最终导致突触前器官染色不均匀(图2a)。因为光散射，样品的厚度会影响图像的分辨率。然而，免疫染色后的平坦度(即免疫染色后按压横膈膜)并不能改善图像质量。
[0073]
整个神经支配图案(用抗nf和抗sv2标记)被清晰地免疫染色(如图2b、图4和5所示)。受神经支配的nmjs呈黄色，绿色(突触前末梢)、红色(突触后achrs)，绿色与红色混合在一起。终板尺寸被扩大(未受压面积：314.70
±
19.90μm2；受压面积：429.10
±
11.29μm2，p<0.01，图2c)，但是碎裂指数无明显变化，进一步支持了受压nmjs结构完整性的保留(未受压：1.096
±
0.013；受压：1.148
±
0.047；图2d)。
[0074]
未受压的横膈膜(图2a)相比，受压横膈膜(图2b)中的自体荧光信号似乎更少。与未受压的横膈膜相比，受压横膈膜的背景颜色要浅得多，可能是因为扩张肌纤维中色素沉积较少(如图2e和2f)。更薄的样品也使光的传输更有效，更容易观察图像。总之，本发明的前处理方法提供了一个方便和通用的方法来改善神经支配网络的可视化，不仅适用于免疫标记，而且适用于经典的酯酶银染色。
[0075]
组织透明技术，如3disco/idisco、cubic是最先进的技术，但在成像前需要许多耗时的步骤(总共超过10天)，当研究横膈膜等扁平肌肉时，图像细节没有改善(ert
ü
rk et al.，2012；khan等人，2016年；renier等人，2014年；susaki等人，2014年；williams等人，2019年)，采用本发明的前处理方法，基于常规的免疫染色程序，可以在2天内成功完成。本发明的前处理方法，可以在不清除筋膜的情况下帮助抗体渗透。
[0076]
图3是sod1
g93a
小鼠病变nmjs的形态学变化，其中，(a)是疾病末期(4个月大)，sod1
g93a
小鼠横膈膜的代表性图像，大量nmjs是去神经的(白色箭头指示的部分)，框1-3中区域的放大图从左到右依次排列，(b)是年龄匹配的对照野生型wt和sod1
g93a
小鼠横膈膜突触后面积的统计，对每个横膈膜共90个终板进行了分析，每组3只小鼠，不显著，(c)是破碎指数统计，对每个横膈膜共90个终板进行分析，每组3只小鼠，非显著性，(d)是神经占用率统计，对每个横膈膜的1000多个终板进行了分析，每组3只小鼠，(e)是nmjs的高倍共聚焦图像，wt表示对照野生型小鼠横膈膜的nmjs的高倍共聚焦图像，显示出了健康的nmj图像；1-sod1
g93a
表示sod1
g93a
小鼠横膈膜的nmjs的高倍共聚焦图像，其中显示出多个神经支配的nmjs(白色箭头)；部分神经支配的nmjs(蓝色箭头)；2-sod1
g93a
表示sod1
g93a
小鼠横膈膜的nmjs的高倍共聚焦图像，其中，显示出完全失去神经支配的nmjs(紫色箭头)，nf/sv2(绿色)，btx(红色)。sod1
g93a
小鼠表示渐冻症模型小鼠(sod1蛋白的93位氨基酸从甘氨酸突变为丙氨酸)。
[0077]
本发明展示了sod1
g93a
小鼠als模型的横膈膜的整体染色，这使得能够系统地评估nmjs的形态学变化(图3a)。在4个月大的sod1
g93a
小鼠中，突触后面积和碎片指数没有显著差异(图3b和3c)，但与野生型对照组相比，有大量失去神经支配和部分失去神经支配的nmjs(野生型wt：4.02
±
1.66％；sod1
g93a
：44.25
±
5.67％，图3d)。高倍图像显示了详细的形态学特征，健康的nmjs的特征是突触前和突触后元件的结构复杂性(上图3e)。病理学特征，如多神经支配、部分神经支配和去神经支配也得到了清楚的说明(中间和底部，图3e)，与之前的发现一致(martin等人，2015年；valdez等人，2012年)。这表明，本发明的前处理方法能够使得有效地分析横膈膜的神经支配，同时保留不同类型的nmj结构特征。
[0078]
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。