制备人参黄酮苷的方法与流程

1.本发明涉及医药领域，具体地，本发明涉及制备人参黄酮苷的方法。


背景技术：

2.1969年，komatsu等首次从人参茎叶中分离得到人参黄酮苷(山柰酚-3-o-β-d-半乳糖(2
→
1)-β-d-葡萄糖苷)，之后学者们相继研究，发现人参黄酮苷还存在于人参花蕾及其同属植物西洋参(全株)和三七(茎叶和花蕾)中，具有酶抑制、抗癌、免疫调节等作用，充分体现了黄酮类化合物的药理活性。人参、西洋参和三七作为传统名贵中药材，其化学成分和药理作用的研究主要集中在其药用部位和非药用部位的皂苷类成分，而黄酮类成分的研究还相对较少。目前，已有文献建立了人参叶、三七叶和西洋参不同部位中人参黄酮苷含量测定的方法，还有文献建立了同时测定人参叶中不同类型成分的单柱和多柱分析方法。结果表明，不同产地或不同部位样品中人参黄酮苷含量都相差较大，说明可以同时测定样品中人参黄酮苷和皂苷成分，综合评价其质量优劣。
3.据调研，目前人参黄酮苷对照品市场资源较少且价格昂贵，文献用的人参黄酮苷对照品都是自制所得，制备方法基本如下：样品粉末先反复提取和萃取，得到的粗流分经大孔树脂分离洗脱、分析鉴定、合并浓缩后，进一步得到含人参黄酮苷的浸膏，该浸膏还需经一系列硅胶柱、ods/mci柱、凝胶柱、半制备柱等反复分离和纯化后才能得到目标化合物单体，再经红外、薄层色谱、高效液相反相色谱、质谱、核磁等方法鉴定验纯后，最终确定为人参黄酮苷。该法操作繁琐、耗时较长，反复柱层析吸附损耗样品导致得率低。同时，该法还需消耗大量有机试剂或有毒试剂，危害人体健康。如急需适量对照品用于定性或快速分析评价，采购对照品或按当前文献方法制备明显都是不合适的。
4.因此，建立一种快速制备并鉴定人参黄酮苷地方法，既能提高人参、西洋参和三七非药用部位的回收利用率，又为整体质量评价奠定基础，显得尤其重要和紧迫。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
6.为此，本发明首次采用在线hplc-spe-nmr-ms联用系统，利用常规分析色谱柱，30min内可直接从人参叶粉末中制备得到并鉴定了的高纯度(95％)人参黄酮苷单体，并且在普通高效液相色谱仪上实现了提取-分析-制备只需16min。本专利建立的方法快速高效、可重复且提取率高(90％以上)，与现有技术相比，本专利制备得到的人参黄酮苷单体得率也得到了很大的提高，这为人参黄酮苷化合物的少量快速制备提供了技术支持。
7.在本发明的第一方面，本发明提出了一种从待测样品中分离制备人参黄酮苷的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待测样品通过高效液相色谱进行分离，以便获得人参黄酮苷；其中，所述高效液相色谱是在如下条件下进行的：色谱柱为分析柱或半制备柱；流动相为35％～40％甲醇水溶液；等度洗脱；流速为0.4～0.8ml/min；检测波长为210nm或350nm；柱温为28～32℃。根据本发明实施例的方法，能够快速从待测样品中分离人参黄
酮苷单体，且人参黄酮苷单体的纯度、提取率和得率高。
8.根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
9.根据本发明的实施例，所述流动相为35％甲醇水溶液。发明人发现，当采用35％甲醇水溶液作为流动相时，人参黄酮苷与其他化合物峰分离度较好，峰形宽度更合适，能明显看到人参黄酮苷色谱峰前后包埋的杂峰，更有利于人参黄酮苷单体化合物的分离纯化。
10.根据本发明的实施例，所述等度洗脱为单流动相等度洗脱。进而进一步保证人参黄酮苷单体化合物的出峰稳定，节约制备时间，提高整体效率。
11.根据本发明的实施例，目标人参黄酮苷的收集时间为13min～16min。
12.根据本发明的实施例，所述待测样品预先进行提取处理，所述提取处理是在所述流动相中进行的。
13.根据本发明的实施例，所述待测样品预先与硅藻土混合。发明人发现，利用硅藻土微孔结构可有效解决待测样品的分散问题，将样品均匀分布于硅藻土中，可通过增大反应接触面积，降低整体系统压力，大大提高分离效率，同时，硅藻土强大的杂质去除能力也大大提高了提取效率。
14.根据本发明的实施例，所述待测样品与硅藻土的质量比为1:1。
15.根据本发明的实施例，所述提取处理是在提取装置中进行的，所述提取装置与进样器和柱温箱相连，并与色谱柱、检测器等构成一个提取系统，其中所述提取装置与所述进样器和柱温箱之间设置有阀，所述目标人参黄酮苷出峰后切换阀，以断开所述提取装置与提取系统的连接。本方法利用具有阀的提取装置，既能提高切换效率，又有效防止样品反冲，保护色谱柱和hplc-spe-nmr-ms联用系统。发明人发现，目标人参黄酮苷化合物出峰后切换阀可保证样品中的人参黄酮苷一次提取完全，进而进一步提高了人参黄酮苷的提取效率。
16.根据本发明的实施例，进一步包括所分离的目标人参黄酮苷进行质谱和/或固相萃取-核磁共振鉴定。进而可对分离得到的人参黄酮苷单体进行鉴定。
17.根据本年发明的实施例，所述质谱鉴定条件如下所述：
18.esi离子源，负离子模式，干燥气温度为320～380℃，干燥气流速为8～12l/min，雾化气压力为20～40psi，鞘气温度为280～320℃，鞘气流速为10～14l/min,毛细管电压为3400～3600v，喷雾电压为1500～2500v，片段电压为100～150v，扫描范围为m/z 100-1000，数据采集模式为auto ms/ms，碰撞能量为10v、20v或30v。
19.根据本发明具体的实施例，所述质谱鉴定条件如下所述：esi离子源，负离子模式，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10l/min，雾化气压力为30psi，鞘气温度为300℃，鞘气流速为11l/min。毛细管电压为3500v，喷雾电压为2000v，片段电压为120v，扫描范围为m/z 100-1000，数据采集模式为auto ms/ms，碰撞能量为10v、20v或30v。
20.根据本发明的实施例，所述nmr谱鉴定条件如下所述：
21.将所述高效液相色谱分离所得目标色谱峰加入至固相萃取柱中进行萃取，得到萃取物；将所述萃取物用氘代甲醇洗脱至核磁共振仪的流通池中，采用毛细管探头和超低温探头进行分析，其中，核磁共振鉴定温度为280～320k。
22.根据本发明的具体实施例，所述固相萃取-核磁共振鉴定条件如下所述：经hplc分离的色谱峰首先被捕获至prospekt 2固相萃取系统的spe c18小管柱上，通过管柱后端的
补充泵加水稀释，降低流动相中的有机溶剂比例，然后用氮气干燥。重复萃取3次，获得足够核磁共振仪分析的样品量后，用160μl氘代甲醇溶解样品，并洗脱至bruker 600mhz超低温核磁共振仪的流通池中(60μl)，通过cryofit毛细管探头和cryoprobe超低温探头进行分析，实验温度300k，采集1hnm光谱，化学位移值以3.299ppm的氘代甲醇为参考。
23.在本发明的第二方面，本发明提出了一种从待测样品中分离制备人参黄酮苷的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待测样品预先与硅藻土混合，所述待测样品与硅藻土的质量比为1:1；将待测样品和硅藻土混合物采用流动相进行提取处理，所述流动相为35％甲醇水溶液，所述提取处理是在提取装置中进行的，所述提取装置与进样器和柱温箱相连，并与色谱柱、检测器等构成一个提取系统，其中所述提取装置与所述进样器和柱温箱之间设置有阀；将待测样品通过高效液相色谱进行分离，当目标人参黄酮苷出峰后切换阀，以断开所述提取装置与提取系统的连接，并对分离到的目标人参黄酮苷进行质谱和/或固相萃取-核磁共振鉴定，同时在13min～16min内，收集人参黄酮苷；其中，所述高效液相色谱是在如下条件下进行的：色谱柱为分析柱或半制备柱；流动相为35％甲醇水溶液；等度洗脱；流速为0.6ml/min；检测波长为210nm；柱温为30℃。根据本发明实施例的方法能够快速提取得到的人参黄酮苷，且人参黄酮苷提取率可达常规提取技术的90％以上。与现有技术相比，本发明制备得到的人参黄酮苷单体得率也得到了很大的提高。
24.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
25.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
26.图1是根据本发明实施例的提取-分析-鉴定-制备设置连接示意图；
27.图2是根据本发明实施例的提取溶剂(即流动相)考察结果图；
28.图3是根据本发明实施例的提取率考察(210nm)结果图；
29.图4是根据本发明实施例的提取泵考察(210nm)结果图；
30.图5是根据本发明实施例的二元泵单流动相提取重复性考察(210nm)结果；以及
31.图6是根据本发明实施例的色谱柱考察(210nm)结果。
具体实施方式
32.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
33.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
34.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内
部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。在本发明中，“分离”为高效液相色谱峰的分离；“制备”为收集得到最终化合物。
35.根据本发明的具体实施例，本发明提供了一种直接从人参叶粉末中快速制备并鉴定人参黄酮苷的方法。样品无需复杂前处理，只需一种方法即可同时提取、分离、鉴定和制备人参黄酮苷，具体方法如下所述：
36.样品罐制备：精密称取0.5g人参叶粉末(过三号筛)和0.5g硅藻土粉末至研钵中，充分研磨，混合均匀，即得人参叶-硅藻土(1:1)混合样品。精密称取13mg混合样品(1:1)，填充进菲罗门security guard空预柱芯(4.00mm
×
3.00mm)中，两端用有机微孔滤膜密封，安装于匹配的预柱套中，即得。
37.系统：如图1搭建提取-分离-鉴定-收集系统，提取溶剂为35％甲醇溶液(质谱分析时加入适量乙酸铵)，利用阀切换先通过样品罐提取，然后进入色谱柱分析，流速为0.6ml/min，提取温度为30℃。为保证充分提取，目标化合物出峰结束后再切换阀，断开提取罐。
38.色谱条件：色谱柱为agilent zorbax sb c18色谱柱(4.6mm
×
150mm，5μm)，提取溶液即为流动相，35％-40％甲醇等度洗脱，流速0.6ml/min，检测波长210nm和350nm，柱温30℃，进样0μl启动提取过程。分析物经hplc分离检测后，用分流器分成两部分：95％进入固相萃取-系统进行柱后峰捕获，5％进入质谱仪进行数据采集分析。
39.质谱条件：esi离子源，负离子模式，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10l/min，雾化气压力为30psi，鞘气温度为300℃，鞘气流速为11l/min。毛细管电压为3500v，喷雾电压为2000v，片段电压为120v，扫描范围为m/z 100-1000，数据采集模式为auto ms/ms，碰撞能量为10v、20v、30v。
40.spe-nmr分析条件：经hplc分离的色谱峰首先被捕获至prospekt 2固相萃取系统的spe c18小管柱上，通过管柱后端的补充泵加水稀释，降低流动相中的有机溶剂比例，然后用氮气干燥。重复萃取3次，获得足够核磁共振仪分析的样品量后，用160μl氘代甲醇溶解样品，并洗脱至bruker 600mhz超低温核磁共振仪的流通池中(60μl)，通过cryofit毛细管探头和cryoprobe超低温探头进行分析，实验温度300k，采集1hnm光谱，化学位移值以3.299ppm的氘代甲醇为参考。
41.上述提取罐全粉提取时样品不易分散会导致提取不完全，此外，可能还会产生高压冲破提取罐内部装置，造成色谱柱损坏和系统污染。上述方法利用硅藻土微孔结构有效解决了样品分散问题，将样品均匀分布于硅藻土中，通过增大反应接触面积，降低整体系统压力，大大提高了分离效率，同时，硅藻土强大的杂质去除能力也可以提高提取效率。此外，上述方法还利用阀切换单独装置提取罐，既能提高换罐效率，又有效防止样品反冲，从而保护色谱柱和hplc-spe-nmr-ms联用系统。
42.需要说明的是，本技术所述的“预柱套”，即样品放在预柱芯中，两端用有机微孔滤膜密封，然后再放进预柱套中，此处得预柱套相当于图1中的样品罐，当在专利里图1b所示的状态时，样品罐是连接于进样器与柱温箱之间，当液相系统工作时流动相会经过样品罐，完成提取，可以理解成“预柱套”是hplc设备的一个部件。
43.常规高效液相中流动相的作用是携带待测组分向前移动，使得样品成分在柱填料与流动相之间进行质量交换而达到分离洗脱的目的，本专利流动相除了洗脱人参黄酮苷单
体作用外，还可作为一种提取人参黄酮苷的提取溶剂。图1中所示泵的作用是为流动相的流动提供动力；进样器用来进样；柱温箱用来控制色谱柱的温度。泵、进样器、柱温箱以及uv(检测装置)是hplc设备的组成部分。
44.需要说明的是，本技术所述的“spe”是固相萃取，一种样品前处理方法，用于样品分离、净化和富集；“nmr”是核磁共振，检测物质的h谱和c谱，可以更加直观的得到物质的分子结构和分子间的相互关系；“ms”是质谱，检测物质的离子质荷比(质量-电荷比)的分析方法。nmr和ms都是用来鉴定化合物的。本专利提供了一种提取-高效液相-ms检测以及高效液相-nmr检测，即样品的提取——检测——鉴定是同时完成的，通过提取-高效液相-ms可以获得样品成分的质荷比或者离子峰大小，通过提取-高效液相-nmr可以获得样品成分的详细的分子结构信息，两个步骤可以同时完成。经过ms分析后的物质既可以收集或可以直接作为废液处理掉，nmr仪器本身配有一个样品收集器，物质经过nmr鉴定后，可以自动收集物质作为后续分析。
45.使用高效液相色谱仪进行分析时，常用两种洗脱方式，一种为等度洗脱，另一种为梯度洗脱。等度洗脱指流动相的组成在分离的全过程中皆保持不变。梯度洗脱是指流动相的组成随分析时间的延长呈现线性变化，即线性梯度洗脱。因此，等度洗脱的流动相通过液相色谱中的比例阀配件以恒定的比例进入液相系统；而梯度洗脱流动相通过液相色谱的比例阀装置后根据设置的梯度洗脱条件时刻在变化，因此等度洗脱可以更准确的控制流动相比例。根据本发明实施例的方法中，提取溶剂为35％甲醇水溶液，是通过二元泵直接将配置好35％甲醇水溶液作为单一流动相连接到液相系统中；也可以使用二元泵或四元泵，通过其比例阀分别抽取甲醇和水两种流动相，混合成35％甲醇用于等度洗脱。但本技术的发明人发现，二元泵单流动相提取相比于二元泵或四元泵混合流动相提取，可以更准确的控制流动相比例。
46.需要说明的是，本技术所述的“分析色谱柱”和“半制备色谱柱”两款色谱柱在柱内径与柱填料方面相差很多决定了它们的作用不一样。分析色谱柱的柱内径在1-5mm，柱填料小于等于5μm，半制备色谱柱柱内径在1-10mm或者更大，柱填料为大于等于5μm。分析型色谱柱以分析为目的，精密度高，可用作含量检测分析，样品承载量小；半制备色谱柱以分离纯化为目的，追求样品承载量，检测精密度低，检测只能做鉴别用。本技术的发明人发现，分析色谱柱可达到与半制备色谱柱相当的分离制备效果，本专利所建立的快速提取-制备-分析人参黄酮苷单体化合物的方法可推广到常规分析色谱柱上应用，而不局限于半制备色谱柱。
47.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
48.1.药材来源：市售人参叶，产地吉林。
49.2.实验仪器
50.agilent1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；agilent 1290uhplc(美国安捷伦科技有限公司)；esi-q-tof-ms(德国bruker公司)；lc-spe-nmr核磁共振仪(600mhz,德国bruker公司)；菲罗门security guard空预柱芯(4.00mm
×
3.00mm)(美国菲罗门公司)；agilent zorbax sb c18色谱柱(4.6mm
×
150mm，5μm)；agilent zorbax sb c18半制备柱(9.4mm
×
250mm，5μm)；xpe205型十万分之一电子天平(美国梅特勒-托利多仪器有限
公司)；tube mill 100控制型试管研磨机(德国ika集团)；milli-q超纯水制备系统(德国默克密理博公司)。
51.3.实验试剂
52.甲醇(色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，乙酸铵(色谱纯，阿拉丁上海有限公司)，氘代甲醇(美国sigma公司)，硅藻土(化学纯，成都科龙化工试剂厂)，超纯水(德国默克密理博公司milli-q超纯水系统)，其余试剂均为分析纯。对照品：尿苷(批号6213，纯度99.8％，上海诗丹德有限公司)，鸟苷(批号111977
–
201501，纯度93.6％，中国食品药品检定研究院)，腺苷(批号110879
–
201703，纯度99.7％，中国食品药品检定研究院)，人参黄酮苷(实验室自制，经uv、nmr和ms鉴定确认其结构，按归一化法测定纯度》95％)。
53.4.混合对照品溶液的制备
54.取尿苷、鸟苷、腺苷和人参黄酮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含尿苷、鸟苷、腺苷和人参黄酮苷分别为52.70、54.40、25.95和166.75μg的对照品储备液。然后分别取对照品储备液适量，加甲醇制成每1ml含尿苷、鸟苷、腺苷和人参黄酮苷分别为3.95、4.08、1.95和38.25μg的混合对照品溶液，临用前过0.22μm有机滤膜，取续滤液，即得。
55.5.样品罐制备
56.精密称取0.5g人参叶粉末(过3号筛)和0.5g硅藻土粉末至研钵中，充分研磨，混合均匀，即得人参叶-硅藻土(1:1)混合样品。精密称取13mg人参叶-硅藻土混合样品，填充进菲罗门security guard空预柱芯(4.00mm
×
3.00mm)中，然后两端用有机微孔滤膜密封，安装于匹配的预柱套中，即得。
57.实施例1目标化合物出峰确定和提取溶剂(即流动相)考察
58.本专利前期研究表明，36％～50％甲醇可有效洗脱人参叶中人参黄酮苷，与其他成分(如核苷、皂苷等)区分开来。人参黄酮苷出峰时间较核苷成分晚，同时在350nm波长下有最大吸收，因此可通过混合对照品对人参黄酮苷进行定位，确定样品中目标化合物的出峰时间，以及各化合物的分离程度。取混合对照品和制备好的样品罐(1:1)，按以下色谱条件进行分析：agilent 1260四元泵，agilent zorbax sb c18色谱柱(4.6mm
×
150mm，5μm)，流动相a为100％水，流动相b为100％甲醇，采用40％甲醇等度洗脱；流速为0.6ml/min，检测波长为210nm和350nm，柱温为30℃，进样10μl。结果如图2a和2b所示(a：混合对照品(40％甲醇)；b：人参叶提取(40％甲醇))，由结果可知，人参黄酮苷对照品保留时间在8.24min左右，样品中人参黄酮苷含量很高，保留时间相对较宽(8.277min)，但与对照品基本保持一致。人参黄酮苷与其他化合物峰分离度较好，但峰形过宽可能会包埋杂峰，继而又考察了35％甲醇等度洗脱的分离效果，结果如图2c所示(c：人参叶提取(35％甲醇))，由结果可知，流动相极性调小后制备时间延长到24min，此时人参黄酮苷保留时间为20.007min。虽然制备时间延长了，但通过比较35％甲醇洗脱得到的350nm和210nm的色谱图，发现210nm下能明显看到人参黄酮苷色谱峰前后包埋的杂峰(18.829min和22.153min)，更有利于其分离纯化，故最终选择35％甲醇作为提取溶剂(即流动相)。
59.根据上述考察结果，初步确定目标化合物收集时间为19.3min～21.8min，具体可根据出峰情况稍作调整，以保证收集到高纯度的目标化合物。此外，虽然目标化合物在350nm下有较大吸收，但210nm下能更清楚识别到杂质峰，因此后续实验在210nm视图下收集目标化物，避免收集杂质部分，提高其纯度。
60.实施例2提取时间考察
61.取制备好的样品罐(1:1)，按以下条件进行提取制备：agilent 1260四元泵，agilent zorbax sb c18色谱柱(4.6mm
×
150mm，5μm)，流动相a为100％水，流动相b为100％甲醇，35％甲醇等度洗脱，流速为0.6ml/min，检测波长为210nm，柱温为30℃，提取溶剂为35％甲醇，进样0μl启动提取过程，分别在提取3min、5min和目标成分完全收集后切换阀，断开提取罐，考察不同时间段切换阀对样品提取率的影响，结果如图3所示(a：目标化合物出峰后切换阀；b：3min切换阀；c：5min切换阀；1和2：分别代表第一次提取和第二次提取)。由结果可知，3min和5min切换阀时目标化合物不能一次提取完全，要进行二次提取，重复提取消耗更多时间；目标化合物出峰后再切换阀可一次提取完全。此外，不同时间切换阀对后期杂质峰的洗脱快慢影响也不大，因此最终选择待目标成分完全出峰后再切换阀，断开提取罐。
62.图3结果还显示，相同提取条件下，目标化合物保留时间有差异，同时前后的杂质峰不稳定，时有时无，这可能是因为四元泵只有一个泵头，其通过四元比例阀泵前混合流动相，混合精度较差，不能精确控制流动相比例造成的。二元泵具有2个泵头，分别控制两种流动相的流量，且在泵后混合，其泵头精度较四元泵高，因此能更精确控制流动相比例，故接下来考察提取泵对样品分离制备的影响。
63.实施例3提取泵和重复性考察
64.取制备好的样品罐(1:1)，按以下条件进行提取制备：agilent zorbax sb c18色谱柱(4.6mm
×
150mm，5μm)，其中四元泵的洗脱条件为：流动相a为100％水，流动相b为100％甲醇，35％甲醇等度洗脱；二元泵的洗脱条件为：流动相a为35％甲醇(提前配制好35％甲醇)，即采用单个流动相进行等度洗脱。目标成分完全收集后切换阀断开提取罐，流速为0.6ml/min，检测波长为210nm，柱温为30℃，提取溶剂为35％甲醇，进样0μl启动提取过程；二元泵提取重复3个样品罐，结果如图4(a：四元泵；b：二元泵)～图5所示。结果表明，二元泵提取时化合物出峰数目较四元泵提取时多，且稳定可靠。重复性结果显示，目标化合物保留时间和峰面积的rsd％均小于1％，表明建立的方法重复性良好。因此，根据结果最终选择单个流动相进行等度洗脱，同时确定目标化合物收集时间为13.3min～15.4min。
65.此外，根据结果可知，二元泵提取时目标化合物保留时间较四元泵提取时提前了3min，16min内即可直接从样品中获得目标化合物，在普通液相上实现了快速提取、制备和分析，因此，为保证化合物出峰稳定，节约制备和分析时间，提高整体效率，实际应用时应优先选择二元泵进行提取或分析，其次再考虑四元泵，其中，当进行等度洗脱时，应优先考虑采用单流动相。
66.实施例4色谱柱考察
67.取制备好的样品罐(1:1)，按以下条件进行提取制备：agilent zorbax sb c18分析柱(4.6mm
×
150mm，5μm)和agilent zorbax sb c18半制备柱(9.4mm
×
250mm，5μm)，agilent1260二元泵，提取溶剂即流动相为35％甲醇溶液(单流动相)，二元泵等度洗脱；分析柱流速0.6ml/min，半制备柱流速2ml/min；检测波长210nm，柱温30℃，进样0μl启动提取过程，待目标成分完全收集后切换阀断开提取罐，比较常规分析色谱柱和半制备色谱柱的制备效果，结果如图6所示(a：常规分析色谱柱；b：半制备色谱柱)。由结果可知，常规分析色谱柱可达到与半制备色谱柱相当的分离制备效果，证明本专利所建立的快速提取-制备-分
析单体化合物的方法可推广到常规分析色谱柱上应用，而不局限于半制备色谱柱。
68.实施例5人参黄酮苷提取率计算
69.对照品溶液制备：取人参黄酮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含人参黄酮苷1.178mg的对照品储备液。然后取对照品储备液适量，用35％甲醇稀释并制成每1ml含人参黄酮苷117.8μg对照品稀释液。将对照品稀释液过0.22μm有机滤膜，取续滤液进行hplc分析，并对人参黄酮苷进行相对定量。
70.混合样品制备：精密称取0.5g人参叶粉末(过3号筛)和0.5g硅藻土粉末至研钵中，充分研磨，混合均匀，即得人参叶-硅藻土(1:1)混合样品粉末。
71.供试品溶液制备1(常规方法)：称取上述混合样品粉末约0.3g，精密称定，加10ml纯水，称定重量，超声提取30min后，取出放冷至室温，补足失重，5000rpm离心10min，精密量取1ml上清液至5ml容量瓶中，用35％甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得。临用前过0.22μm有机滤膜，取续滤液进行hplc分析。
72.供试品溶液制备2(在线提取)：取“实施例3”项下二元泵重复性考察所得的人参黄酮苷溶液之一，精密量取1ml至5ml容量瓶中，用35％甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得。临用前过0.22μm有机滤膜，取续滤液进行hplc分析。
73.色谱条件：色谱柱为agilent poroshell sb aq色谱柱(4.6mm
×
50mm，2.7μm)，以水(a)-乙腈(b)作为流动相，梯度洗脱(0～5min，17％
→
20％b；5～8min，20％
→
100％b；8～12min，100％b)，流速0.8ml/min，柱温为室温，检测波长350nm，进样10μl。
74.人参黄酮苷提取率计算：
[0075][0076][0077]
其中，a
样
是样品峰面积，a
对
是对照品峰面积，c
对
是对照品浓度，n是稀释倍数，v是提取溶液体积，m是人参叶的重量。
[0078]
通过计算，得到供试品溶液1和供试品溶液2的人参黄酮苷含量分别为1.08％(纯度50％)和1.01％(纯度95％)，提取率为93.5％，说明本专利建立的方法可快速从少量样品粉末中制备得到高提取率、高纯度的人参黄酮苷单体。
[0079]
实施例6hplc-dad-spe-nmr-ms制备和鉴定人参黄酮苷
[0080]
系统：如图1搭建提取-制备-分析-鉴定系统，提取溶剂为35％甲醇溶液(含5mm乙酸铵)，利用阀切换先通过样品罐提取，然后进入色谱柱分析，流速0.6ml/min，提取温度30℃。为保证充分提取，目标化合物出峰结束后再切换阀，断开提取罐。
[0081]
色谱条件：色谱柱为agilent zorbax sb c18色谱柱(4.6mm
×
150mm，5μm)，流动相为35％甲醇溶液，等度洗脱，流速0.6ml/min；检测波长210nm和350nm，同时开启全波长扫描；柱温30℃，进样0μl启动提取过程。分析物经hplc分离检测后，用分流器分成两部分：95％进入固相萃取-系统进行柱后峰捕获，5％进入质谱仪进行数据采集分析。
[0082]
质谱条件：esi离子源，负离子模式，干燥气温度350℃，干燥气流速10l/min，雾化
气压力30psi，鞘气温度300℃，鞘气流速11l/min。毛细管电压3500v，喷雾电压2000v，片段电压120v，扫描范围m/z 100-1000，数据采集模式auto ms/ms，碰撞能量10v、20v、30v。
[0083]
spe-nmr分析条件：经hplc分离的色谱峰首先被捕获至prospekt 2固相萃取系统的spe c18小管柱上，通过管柱后端的补充泵加水稀释，降低流动相中的有机溶剂比例，然后用氮气干燥。重复萃取3次，获得足够核磁共振仪分析的样品量后，用160μl氘代甲醇溶解样品，并洗脱至bruker 600mhz超低温核磁共振仪的流通池中(60μl)，通过cryofit毛细管探头和cryoprobe超低温探头进行分析，实验温度300k，采集1hnm光谱，化学位移值以3.299ppm的氘代甲醇为参考。
[0084]
人参黄酮苷制备和结果鉴定：如图1搭建hplc-dad-spe-nmr-ms系统，将制备好的空白罐和样品罐(1:1)装入相应提取罐中，并按上述条件进行提取、制备和鉴定，最终鉴定结果如下：分析的化合物在268nm和350nm下有最大紫外吸收；q-tof-ms结果：609.1498[m-h]-，429.0821[m-h-glc]-，284.0342agl；1h nmr(600mhz，cd3od)结果：8.09(2h,dd,j＝8.59hz)、6.90(2h,dd,j＝8.56hz)、6.40(h,d,j＝2.00hz)、6.21(h,d,j＝2.01hz)、5.35(h,d,j＝7.80hz)、4.75(h,d,j＝7.46hz)。综上所述，通过uv、ms和1h nmr鉴定数据并结合参考文献，确定目标化合物为人参黄酮苷。
[0085]
将在时间段13.3min～15.4min内收集到的目标化合物人参黄酮苷溶液分别减压浓缩至干，称定重量，平均重量约为1.5mg。综上，通过本专利建立的在线提取-制备-分析方法，可在16min内直接从6.5mg样品粉末中得到1.5mg人参黄酮苷单体(即0.23mg/mg)，与传统制备方法比较，大大提高了单体得率。
[0086]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0087]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。