一种能同时检测维生素B6、B9的修饰电极制备方法及检测方法与流程

一种能同时检测维生素b6、b9的修饰电极制备方法及检测方法
技术领域
1.本发明属于维生素检测技术领域，具体涉及一种能同时检测维生素b6、b9的修饰电极制备方法。


背景技术：

2.随着社会的进步，人们越来越关注自身健康。作为具有机体重要生理功能的维生素，其合理应用、治疗与诊断性监测也越来越被重视。其中维生素b6又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，维生素b6为人体内某些辅酶的组成成分，参与多种代谢反应，尤其是和氨基酸代谢有密切关系。维生素b6功能有抗体的合成、消化系统中胃酸的制造、脂肪与蛋白质利用(尤其在减肥时应补充)、维持钠/钾平衡(稳定神经系统)。缺乏维生素b6的通症，一般缺乏时会有食欲不振、食物利用率低、失重、呕吐、下痢等毛病。严重缺乏会有粉刺、贫血、关节炎、小孩痉挛、忧郁、头痛、掉发、易发炎、学习障碍、衰弱等。而维生素b6过量可引起嗜眠，长期服用会成癖。
3.维生素b9也叫叶酸，是一种水溶性维生素，有促进骨髓中幼细胞成熟的作用，人类如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，对孕妇尤其重要。叶酸可维持生长和肠道功能，孕妇经常补充叶酸可防止新生儿早产以及婴儿腭裂等先天性畸形。同时叶酸还有抗肿瘤、抗癌作用，对婴幼儿的神经细胞与脑细胞发育也有促进作用。叶酸的缺乏会引起胎儿神经管畸形，引起高同型半胱氨酸血症从而增加心血管病的危险性；而过量则会诱发病人惊厥发作，影响锌的吸收而导致锌缺乏，导致神经系统受损害。
4.所以维生素b6、b9的定量检测具有重大临床意义。现有的检测维生素b6、b9的方法各有不同，主要有重量法、滴定法、荧光分析法、高效液相色谱法和电化学方法等。重量法和滴定法操作复杂，对低含量组分的测量误差大，如果对终点判断不敏锐会引起较大误差，而且不能对维生素b6、b9进行同时检测；光谱分析法和色谱法的前处理过程过于繁琐耗时，使用较多的有机溶剂，且对血液样品的需要量较多；电化学方法灵敏、快速，对样品需要量少，且不需要进行前处理，特别适合生物样品中维生素的检测。
5.现有的检测维生素的电化学分析技术，主要实现方式为传统的线性扫描伏安法、常规脉冲伏安法、差分脉冲伏安法、方波伏安法、溶出伏安法等，这些方法虽然能够用来检测维生素，但灵敏度较低，特别是在同时检测血液样品中维生素b6、b9时，往往检出限较高，并且两种物质的峰分不开，达不到血液样品中维生素b6、b9的浓度水平。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种能同时检测维生素b6、b9的修饰电极制备方法，克服了现有技术的不足，利用该修饰电极不仅可以同时检测维生素b6、b9，而且具有较高灵敏度，且两种维生素的出峰互不干扰，具有良好的重现性，能大大降低检出限。
7.为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：
8.一种能同时检测维生素b6、b9的修饰电极制备方法，包括以下步骤：
9.(1)基体电极的预处理：选取玻碳电极、金电极或者铜电极作为基体电极，对基体电极表面进行抛光清洁处理后，备用；
10.(3)制备修饰电极：在步骤(1)制备的基体电极的表面滴涂或者电镀修饰溶液，用红外灯烘干制得所述修饰电极；
11.其中，修饰溶液由硫酸、石墨烯、碳纳米管、维生素b12、醋酸、柠檬酸、金纳米粒子、硝酸银、硫酸钠、醋酸钠、氯化钾、氨基黑10b中的一种或几种组成，各组分的浓度范围是0.0002～3mol/l。
12.进一步，所述基体电极的抛光清洁处理具体包括：先将基体电极在不同型号的金相砂纸上进行打磨，使基体电极表面光滑如镜面；然后再将打磨过的基体电极依次在粒径1.0μm，0.3μm以及0.05μm的氧化铝抛光粉上进行镜面抛光；最后将打磨光亮的基体电极分别置于乙醇、去离子水中各超声2分钟，以除去基体电极表面残留的有机物和吸附的氧化铝粉末，将基体电极用氮气吹干备用。
13.进一步，所述步骤(2)中电镀的方法选自循环伏安法或者电位阶跃法中的一种。
14.进一步，所述步骤(2)中滴涂在基体电极表面的修饰溶液为5～800微升。
15.本发明还保护了一种能同时检测维生素b6、b9的修饰电极的检测方法，包括以下步骤：
16.取待测血液样品与维生素b6、b9释放剂反应，使待测血液样品中结合态的维生素b6、b9转变为游离态的维生素b6、b9；
17.选择上述优化的修饰电极作为工作电极，利用卷积电流伏安法同时检测待测血液样品中维生素b6、b9在工作电极上产生的氧化还原电流；两种维生素分别在特定的峰电位处出峰，且峰型很好，便于测量每种维生素所对应的峰电流，两峰互不干扰；
18.通过分别比较系列不同浓度的维生素b6、b9标准样品的电流信号值，与相对应的维生素b6、b9标准液浓度制作标准曲线，根据待测样品在相同条件下产生的电流信号值，分别通过线性方程计算出待测血样中维生素b6、b9的含量。
19.进一步，利用卷积电流法检测血样中维生素b6、b9含量时，仪器参数初始电极电势为
‑
0.4～0.2v，终止电极电势为0.8～1.4v，扫描速度为30～200mv/s，工作模式为0.5次、1.5次或2.5次微分模式，噪声滤波为低通模式；所述维生素b6、b9释放剂由溶剂和惰性支持电解质组成；所述溶剂为氢氧化钠、氢氧化钾、柠檬酸、盐酸、醋酸、磷酸、硼酸中一种或几种的水溶液，所述溶剂的浓度为0.00005～0.1mol/l，所述惰性支持电解质由醋酸钠、氯化钾、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中一种或几种，所述惰性支持电解质的浓度为0.001～5mol/l。
20.本发明与现有技术相比较，具有以下有益效果：
21.1、本发明在现有的玻碳电极、金电极或铜电极的基础上进行修饰，不仅可以同时检测维生素b6、b9，而且具有较高灵敏度，且两种维生素的出峰互不干扰，具有良好的重现性，能大大降低检出限。
22.2、本发明采用卷积电流伏安法能同时测定血样中维生素b6、b9的含量，具有灵敏度高，重现性好，峰型更加便于电流信号的测量，且操作方便快捷，检测时间较短等优点，在同一个体系能同时准确的检测血样中维生素b6、b9的含量。
23.3、本发明采用标准添加法同时测定样品中维生素b6、b9的含量，消除了由样品基体效应带来的干扰，降低了维生素b6、b9的检出限，测量结果准确可靠。
附图说明
24.图1为利用实施例1制备的修饰电极检测维生素b6和维生素b9所对应的线性方程。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例1
27.本实施例公开了一种能同时检测维生素b6、b9的修饰电极制备方法，包括以下步骤：
28.(1)基体电极的预处理：选取玻碳电极、金电极或者铜电极作为基体电极，对基体电极表面进行抛光清洁处理后，备用；
29.(2)制备修饰电极：在步骤(1)制备的基体电极的表面滴涂或者电镀修饰溶液，用红外灯烘干制得所述修饰电极；修饰溶液由0.0002mol/l的硫酸、0.001mol/l的碳纳米管和0.005mol/l的氯化钾混合制备。
30.其中，步骤(2)中电镀的方法选自循环伏安法或者电位阶跃法中的一种；步骤(2)中滴涂在基体电极表面的修饰溶液为5～800微升。
31.实施例2
32.本实施例公开了一种能同时检测维生素b6、b9的修饰电极制备方法，包括以下步骤：
33.(1)基体电极的预处理：选取玻碳电极、金电极或者铜电极作为基体电极，对基体电极表面进行抛光清洁处理后，备用；
34.(2)制备修饰电极：在步骤(1)制备的基体电极的表面滴涂或者电镀修饰溶液，用红外灯烘干制得所述修饰电极；修饰溶液由0.5mol/l的醋酸、0.03mol/l的金纳米粒子和0.2mol/l的醋酸钠混合制备。
35.其中，步骤(2)中电镀的方法选自循环伏安法或者电位阶跃法中的一种；步骤(2)中滴涂在基体电极表面的修饰溶液为5～800微升。
36.实施例3
37.本实施例公开了一种能同时检测维生素b6、b9的修饰电极制备方法，包括以下步骤：
38.(1)基体电极的预处理：选取玻碳电极、金电极或者铜电极作为基体电极，对基体电极表面进行抛光清洁处理后，备用；
39.(2)制备修饰电极：在步骤(1)制备的基体电极的表面滴涂或者电镀修饰溶液，用红外灯烘干制得所述修饰电极；修饰溶液由1mol/l的柠檬酸、3mol/l的硫酸钠和0.5mol/l的氨基黑10b混合制备。
40.其中，步骤(2)中电镀的方法选自循环伏安法或者电位阶跃法中的一种；步骤(2)中滴涂在基体电极表面的修饰溶液为5～800微升。
41.检测方法
42.一、单标准添加法同时测定血液样品中维生素b6、b9含量
43.具体实施过程：
44.1.维生素b6、b9修饰电极的预处理：选择直径2mm的市售玻璃碳电极、金电极或者铜电极作为维生素b6、b9传感器探头，先将电极在不同型号的金相砂纸上进行打磨，使电极表面光滑如镜面。然后再将打磨过的电极依次在粒径1.0μm，0.3μm以及0.05μm的氧化铝抛光粉上进行镜面抛光。最后将打磨光亮的电极分别置于乙醇、去离子水中各超声2分钟，以除去电极表面残留的有机物和吸附的氧化铝粉末，将电极用氮气吹干备用。
45.2.维生素b6、b9修饰电极的制备：将处理好的电极作为工作电极，铂丝电极为辅助电极，银/氯化银电极为参比电极，于实施例1制备的修饰溶液中，采用电位阶跃法使维生素b6、b9传感器探头进行修饰。仪器参数设置：初始电极电势为
‑
0.6～0.4v(相对于参比电极)，终止电极电势为0.8～2v(相对于参比电极)，扫描速度为20～200mv/s，搅拌条件下循环扫描6～15圈，然后用去离子水清洗，氮气吹干备用。
46.3.维生素b6、b9释放剂的配制：取适量(100～1000ml)的上述单一溶剂或混合溶剂于容量瓶中，按比例称取上述单一或复合支持电解质，加入容量瓶中，盖上瓶塞，轻摇，待支持电解质溶解后，用相同溶剂添加至容量瓶刻度线，溶液中支持电解质的浓度在0.001～5mol/l。
47.4.血液样品中维生素b6、b9的释放：用微量移液器定量移取血液样品(10～20μl)于5.0ml试管中，再定量加入0.1～2.0ml维生素b6、b9特异释放剂，盖上试管塞，轻轻摇匀，放置5分钟，待血样中结合的维生素b6、b9释放出来，变成游离态的小分子，便可上机测定。
48.5.血液样品中维生素b6、b9的同时测定：
49.首先，将盛有待测样品溶液的试管固定在维生素检测仪的工作台上，将上述优选的维生素b6、b9修饰电极作为工作电极，铂丝电极为辅助电极，银/氯化银电极为参比电极，一同插入待测样品溶液中检测。维生素检测仪工作模式可以选择设定为0.5次、1.5次或2.5次微分模式，噪声滤波为低通模式。测试参数为：仪器参数初始电极电势为
‑
0.4～0.2v，终止电极电势为0.8～1.4v，扫描速度为30～200mv/s，分别记录检测样品溶液中得到维生素b6和维生素b9的卷积电流记为h。
50.然后用微量移液器定量移取维生素b6、b9的标准溶液vs ml，加入样品溶液中，搅拌均匀，同样条件下检测，分别得到维生素b6和维生素b9的卷积电流记为h。
51.6.血液样品中维生素b6、b9浓度的计算：
52.血液样品中维生素b2和维生素c的浓度都按(1)式计算：
[0053][0054]
式中c
a
为血液样品中维生素b6、b9的浓度，h是检测样品溶液维生素b6和维生素b9得到的卷积电流值，h是加入标准溶液后检测得到的卷积电流值，vx是稀释剂的体积，vs是加入的标准溶液的体积，cs是标准溶液的浓度，k是样品的稀释倍数。对于加入的维生素b6、
b9标准溶液的体积和浓度应满足如下要求：
[0055]
vs<100vx，cs>100ca
[0056]
二、多标准添加法测定血液样品中维生素b6、b9含量
[0057]
具体实施过程：
[0058]
1.维生素b6、b9修饰电极的预处理：同实施例1。
[0059]
2.维生素b6、b9修饰电极的制备：同实施例1。
[0060]
3.维生素b6、b9释放剂的配制：同实施例1。
[0061]
4.血液样品中维生素b6、b9的释放：同实施例1。
[0062]
5.血液样品中维生素b6、b9的测定：
[0063]
首先，将盛有待测样品溶液的试管固定在维生素检测仪的工作台上，将修饰好的维生素b6、b9传感器作为工作电极，铂丝电极为辅助电极，银/氯化银电极为参比电极，一同插入待测样品溶液中检测。维生素检测仪工作模式可以选择设定为0.5次、1.5次或2.5次微分模式，噪声滤波为低通模式。测试参数为：测试参数为：仪器参数初始电极电势为
‑
0.4～0.2v，终止电极电势为0.8～1.4v，扫描速度为30～200mv/s，分别记录检测样品溶液中得到维生素b6和维生素b9的卷积电流记为h0。
[0064]
然后依次用微量移液器定量移取维生素b6、b9的标准溶液v1ml、v2ml、v3ml、
…
、vnml，分别加入样品溶液中，同样条件下依次检测，得到的卷积电流分别记为h1、h2、h3、
…
、hn，对应加入的维生素b6、b9的浓度分别为c1、c2、c3、
…
、cn(可以利用每次加入的标准溶液的体积换算得到)。附图1所示为利用实施例1制备的修饰电极检测维生素b6和维生素b9所对应的线性方程。
[0065]
6.血液样品中维生素b6、b9浓度的计算：
[0066]
分别利用卷积电流和浓度进行最小二线性拟合(未加入标准时的样品溶液的维生素b6、b9的浓度c0＝0)，得到如下线性关系：
[0067]
h＝kc+b
ꢀꢀ
(2)
[0068]
因此可以得到血液样品中维生素b6、b9的浓度为
[0069]
c
a
＝
‑
b
ꢀꢀ
(3)
[0070]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。