本发明属于快速检测
技术领域：
，尤其是涉及一种毛发中苯丙胺类毒品的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：吸毒、贩毒是一个全球范围的严重问题，毒品检验对打击毒品违法犯罪行为以及禁毒戒毒工作十分重要。目前，血液、唾液、尿液等体液样品是毒品检测中最常规的样品类型。但由于吸食毒品后，代谢物在体液中存在的周期较短(唾液中一般为24小时，尿液一般为48小时，血液一般为24小时)，在一些常规排查工作中受检人往往通过停吸等方法进行规避，给排查工作带来困扰。现有的毒品检测方法主要是胶体金法和hplc-ms测定法。其中，胶体金法测定的精确度不高、可重复性不佳；而hplc测定法周期比较长、通量小、针对仪器和操作人员的技术壁垒比较高。现有的检测样本的局限性会导致漏检，给检测工作带来困扰，无法明确受检人的吸毒史。2016年增加了认定吸毒成瘾的办法有检测毛发中毒品为依据。毒品吸食或注射吸收良好，可大量穿透血脑屏障，迅速产生作用。毒品进入人体后在血脂酶的作用下代谢，进入肝脏后进一步代谢，有相当量的毒品及代谢物进入毛发中，多与黑色素等结合存在于毛发髓腔内。在涉及毒品滥用认定时，常因毒品体内代谢快，吸毒72小时后尿液中不能检出毒品，因此毛发作为一个法定的检材，在吸毒检验方面具有不可比拟的优势。毛发检验采样容易，样品易于保存，且检测窗口期长(最长可达3-6个月)，可反映吸毒的时间范围、吸毒的程度。中国专利cn103207242b披露一种快速鉴定毛发中单乙酰吗啡和吗啡的方法，包括以下顺序步骤：步骤1：将待检测毛发和萃取液、内标吗啡-d3、撞珠一同置于粉碎仪器内进行微粉碎处理；步骤2：将微粉碎处理后得到的混合物进行离心分离；步骤3：取离心分离后混合物的上层清液，对上层清液进行液相色谱-串联质谱分析。中国专利cn103592400a披露一种毛发中的阿片类物质的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)清洗毛发，以液氮研磨，得到毛发粉末；(2)加入符合毛发处理液并进行超声处理，离心得到预处理上清液；所述复合毛发处理液是0.02-0.5mol/l的磷酸盐缓冲溶液，含0.5％-10％的牛血清蛋白、0.1％-5％的吐温20，且ph值为2.0-5.0；(3)固相萃取柱经平衡后，注入所述毛发预处理上清液，依次用水、0.05-0.5mol/l醋酸溶液、甲醇和乙酸乙酯洗涤杂质；用体积比为90:10-98:2的乙酸乙酯：氨水混合溶液洗脱阿片类物质，得到固相萃取洗脱液。现有的毒品检测方法主要是胶体金法和hplc-ms测定法。其中，胶体金法测定的精确度不高、可重复性不佳；而hplc测定法周期比较长、通量小、针对仪器和操作人员的技术壁垒比较高。现有的检测样本的局限性会导致漏检，给检测工作带来困扰，无法明确受检人的吸毒史。技术实现要素：本发明的目的在于为了解决毒品检测方法精确度不高、可重复性不佳，因检测样本的局限性会导致漏检，给检测工作带来困扰的缺陷，而提供一种快速、精确、高通量，样本前处理工作量小，实验快速精确，实验结果重复性好，可用于毛发中毒品快速检测的毛发中苯丙胺类毒品的检测试剂盒。本发明另一个目的是为了提供一种毛发中苯丙胺类毒品的检测方法。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种毛发中苯丙胺类毒品的检测试剂盒，所述试剂盒包括：苯丙胺抗原，包被有分子马达-苯丙胺抗原生物传感器的酶标板、苯丙胺抗体、分子马达启动液、苯丙胺标准品、溶解液、显色剂、清洗液、终止液、处理液ag与处理液bg。作为本发明的进一步方案，所述包被有分子马达-苯丙胺抗原生物传感器的酶标板为用包被缓冲液将分子马达-苯丙胺抗原生物传感器进行1.0×104倍稀释，每孔加入100μl，包被；甩掉液体，用清洗液洗涤，拍干；在每孔中加入200μl封闭液，封闭，甩掉孔内所有液体，干燥后用铝箔袋密封保存。作为本发明的进一步方案，所述分子马达-苯丙胺抗原生物传感器的构建方法包括以下具体步骤：a)hrp标记：取chromatophores离心，将沉淀物重悬于tricine-naoh，氯化镁，kcl，ph6-7的缓冲液中，加入hrp，室温避光孵育；然后置于pbs缓冲液中透析，每天换液多次；b)分子马达-苯丙胺抗原生物传感器构建：1)取β亚基抗体，加入碳酸盐缓冲液、生物素biotin，室温摇床，然后加入streptavidin室温反应；置于pbs缓冲液中透析，中间换液多次；2)取甲基苯丙胺，加入碳酸盐缓冲液、生物素biotin，室温摇床，透析多次，每次3.5-5.5h；3)取hrp标记的chromatophores，加入步骤(1)得到的溶液，再加入pbs，室温摇床；离心，重复多次；弃去上清，用pbs缓冲液稀释，加入步骤(2)得到的溶液，室温摇床；离心，重复多次，弃去上清，加入pbs缓冲液，加入甘油，冷冻保存；即得到分子马达-苯丙胺抗原生物传感器。在本发明中，将hrp(辣根过氧化物酶)标记到chromatophores膜外表面，atp合成引起的质子转运导致ph变化，从而影响hrp酶活性。而当chromatophores的β亚基上连接不同负载时，可以不同程度影响其atp合成活性。在此基础上构建“β亚基抗体-生物素-亲和素-生物素-苯丙胺抗原”分子马达生物传感器来捕获样品中的苯丙胺。chromatophores制备：参考专利zl200410098929.9方法制备；β亚基抗体制备：参考专利zl200410098929.9方法制备。作为本发明的进一步方案，所述的苯丙胺抗原为苯丙胺与载体蛋白bsa偶联制得；苯丙胺抗体为多抗，通过苯丙胺与ova偶联作为免疫原免疫新西兰大白兔制得。作为本发明的进一步方案，所述的清洗液为0.05％-0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液；所述的显色剂有过氧化氢或过氧化脲、邻苯二胺或四甲基联苯胺与稳定剂k按体积比5：1混合而成。作为本发明的进一步方案，所述的苯丙胺标准品用磷酸盐缓冲液配置成浓度分别为0ng/ml、0.5ng/ml、1.5ng/ml、4.5ng/ml、13.5ng/ml、40.5ng/ml的溶液。作为本发明的进一步方案，所述的终止液为1.8-2.5mol/l的盐酸溶液，所述处理液ag为0.005-0.02mnaoh、处理液bg为0.005-0.05mhcl。作为本发明的进一步方案，所述的溶解液为含酶稳定剂ah和酶保护剂ken的磷酸盐缓冲液。作为本发明的进一步方案，所述的启动液为分子马达启动液。一种毛发中苯丙胺类毒品的检测方法，使用上述的试剂盒对毛发进行检测。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的检测方法具有简单、精确、快速的优点，样本前处理工作量小，实验快速精确，实验结果重复性好，可用于毛发中毒品快速检测；本发明将毒品抗原与分子马达构建传感器，大大提高了试剂盒灵敏度；在生物传感器上偶联hrp，通过反应过程中对hrp酶活的影响来建立信号体系；将毛发作为检材，大大提高了检测的窗口期，同时还可判断吸毒史；前处理操作简单，一种处理方法可同时提取毛发中多种毒品，大大缩短了样本前处理时间与成本；本发明的试剂盒对于毛发中苯丙胺类药物检测阈值为0.2ng/mg，极大的满足了禁毒工作的需求；试剂盒保存条件为2～8℃，经过近12个月的测定，发现试剂盒从生产之起到第12个月，各项指标均符合要求。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，atp购自sigma公司；稳定剂k、含酶稳定剂ah和酶保护剂均购自美国internationaldiagosticasystem公司；chromatophores制备：参考专利zl200410098929.9方法制备；β亚基抗体制备：参考专利zl200410098929.9方法制备；其余试剂与所用仪器均可从市场购得。其中，分子马达-苯丙胺抗原生物传感器构建方法为：(a)chromatophores制备：参考专利zl200410098929.9方法制备。(b)β亚基抗体制备：参考专利zl200410098929.9方法制备。(c)hrp标记：取100μlchromatophores在4℃离心(13000r/min)30min，弃去上清，将沉淀重悬于1ml50mmtricine-naoh，5mm氯化镁，10mmkcl，ph6.5的缓冲液中，加入10mghrp，室温避光孵育3h。然后置于pbs(0.01m，ph7.4)中透析2天，每天换液3次。(d)分子马达-苯丙胺抗原生物传感器构建：(1)取1mlβ亚基抗体(2mg/ml)，加入1ml碳酸盐缓冲液(0.01m，ph9.6)、100μl生物素biotin(2μm)，室温摇床4h，然后加入5μlstreptavidin(2μm)室温反应1h；然后置于pbs(0.01m，ph7.4)中透析16h，中间换液3次；(2)取10mg甲基苯丙胺，加入5ml碳酸盐缓冲液(0.01m，ph9.6)、200μl生物素biotin(2μm)，室温摇床4h，4℃透析3次，每次4h；(3)取2mlhrp标记的chromatophores，加入400μl步骤(1)溶液，再加入20mlpbs(0.01m，ph7.4)，室温摇床4h；在4℃离心30min(40000rpm)，重复2次；弃去上清，用pbs(0.01m，ph7.4)稀释到10ml，加入1ml步骤(2)溶液；室温摇床30min，在4℃离心30min(40000rpm)，重复2次，弃去上清，加入1mlpbs(0.01m，ph7.4)，加入50％甘油，冷冻保存。实施例1苯丙胺免疫原与包被原的合成(1)称取350mg甲基苯丙胺盐酸盐溶于1ml蒸馏水中，滴加1mol/l的naoh溶液，析出游离态的甲基苯丙胺，三氯甲烷萃取，na2so4干燥，过滤，蒸发溶剂，得到甲基苯丙胺。(2)将甲基苯丙胺溶于无水乙醇，加入200mg琥珀酸酐，冰浴中，加入约1g无水三氯化铝。混合物在冰浴下搅拌48h，然后在低于10℃的条件下滴加6mol/l的盐酸水解。直到凝结状的固体物质粘附在烧瓶壁上，分去二氯甲烷层。加适量的水，滴加碱液调至ph＝14，氯仿萃取后蒸干即得。(3)将上述产物溶于少量水中，加入13.5mgnhs，20.24mgedc，搅拌3小时即得a液。(4)取18.32mgbsa溶于2mlpbs(0.025mol/l，ph＝7.4)中，搅拌时将a液滴入其中，偶联7h。最后在0.025mol/l，ph＝7.4的pbs透析液中低温透析3天。得到包被原苯丙胺-bsa偶联物。将上述步骤(4)中18.32mgbsa换成21.23mgova，其他步骤同上，得到免疫原苯丙胺-ova偶联物。实施例2苯丙胺多抗的制备取3ml合成的免疫原苯丙胺-ova偶联物，加入等体积的弗氏佐剂，用乳化器充分乳化直至滴一滴至水中不扩散。对新西兰大白兔于第1天用弗氏完全佐剂进行足垫免疫，第2周进行第二次免疫。第4周于背部皮下多点注射进行第3次免疫。第6周用弗氏不完全佐剂进行加强免疫。第7周耳静脉采血测定效价，达到要求后心脏采血分离血清。实施例3苯丙胺多抗血清效价测定采用间接elisa法进行测定。用人工合成的包被原苯丙胺-bsa包被酶标板，将新西兰大白兔耳血清分别稀释1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000。并以同样稀释度的阴性血清为对照，按照elisa法进行效价测定。多抗血清的od450值与相同稀释度的阴性血清od450值之比大于2的最大稀释度定为苯丙胺多抗的效价，经测定苯丙胺多抗的效价为4000。实施例4棋盘滴定法确定分子马达-苯丙胺抗原生物传感器和苯丙胺多抗的工作浓度通过棋盘滴定法对ic50值、最大吸光度值的比较，确定分子马达-苯丙胺抗原生物传感器的包被浓度和苯丙胺多抗的工作浓度。最终确定分子马达-苯丙胺抗原生物传感器的包被浓度为1.0×104，苯丙胺多抗在5.0×103倍稀释时ic50值、最大吸光度值处于最佳状态。实施例5酶标板的制备用包被缓冲液将分子马达-苯丙胺抗原生物传感器进行1.0×104倍稀释，每孔加入100μl，37℃包被2h。甩掉液体，用清洗液洗涤1次，拍干。在每孔中加入200μl封闭液，37℃封闭2h，甩掉孔内所有液体，干燥后用铝箔袋密封保存。实施例6毛发中苯丙胺类检测方法及其试剂盒的组成(1)实施例5中所述的包被有分子马达-苯丙胺抗原生物传感器的酶标板1块(12条x8孔，可拆分)；(2)试剂1(启动液)：2mmatp(sigma公司)；(3)试剂2(抗体)：为实施例2中制备的苯丙胺多抗；(4)苯丙胺标准品溶液1-6：0ng/ml、0.5ng/ml、1.5ng/ml、4.5ng/ml、13.5ng/ml、40.5ng/ml；(5)清洗液浓缩液：为0.05％-0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液；(6)显色剂：由过氧化氢或过氧化脲、邻苯二胺或四甲基联苯胺与稳定剂k按5：1(体积比)混合而成；(7)终止液：为2mol/l的盐酸溶液；(8)试剂6(溶解液)：为含酶稳定剂ah和酶保护剂ken的磷酸盐缓冲液；所述的稳定剂k、含酶稳定剂ah和酶保护剂均购自美国internationaldiagosticasystem公司；(9)处理液ag：为0.01mnaoh；(10)处理液bg：为0.01mhcl。发中苯丙胺类的检测方法为：1、预先在反应板上进行排版设置，建议进行双孔平行实验；2、从微孔板上取下所需数量的微孔(将多余的重新密封保存)；3、使用200μl移液器在标准品孔中分别加入50μl对应的标准1～标准6；4、使用200μl八道移液器在样品孔中分别加入50μl处理好的样品；5、使用300μl八道移液器在每个孔中分别加入50μl试剂1(启动液)；6、使用300μl八道移液器在每个孔中分别加入50μl试剂2(抗体)；7、轻拍反应板边框，以混匀孔内液体，使反应均一；置于23～25℃环境中孵育15分钟(孵育过程中轻拍反应板边框数次，以减少双孔差异)；8、倒掉微孔中的液体，使用300μl八道移液器在所有微孔中加入250μl清洗液，轻轻敲动反应板，然后倒掉微孔内液体；9、重复8步骤3遍，总共洗板4次；10、将微孔板倒扣在吸水纸上拍干，彻底清除掉微孔中的残留液和气泡(拍干后立即进行下一步骤，切勿让微孔干燥)；11、使用300μl八道移液器在每个孔中分别加入100μl试剂4(显色剂)；12、置于23～25℃环境中孵育10分钟(孵育过程中轻拍反应板边框数次，以减少双孔差异)；13、使用300μl八道移液器在每个孔中分别加入100μl试剂5(终止液)；14、轻拍反应板边框混匀孔内液体，并置于检测仪上进行检测，5分钟内检测结果有效。实施例7试剂盒灵敏度实验根据公禁毒(2018)938号通知要求，毛发样本中甲基苯丙胺、苯丙胺、3，4-亚甲二氧基苯丙胺(mda)、3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺(mdma)的检测含量阈值为0.2纳克/毫克。实际检测含量值在阈值以上的，认定检测结果为阳性。常规elisa试剂盒对于毛发中苯丙胺类药物检测阈值为2ng/mg，远远低于公安部要求。本发明的试剂盒对于毛发中苯丙胺类药物检测阈值为0.2ng/mg，极大的满足了禁毒工作的需求。实施例8试剂盒重复性试验重复性通过变异系数cv来体现。以5份毛发为样本，按照本方明的试剂盒检测，每个样本做5个平行，并抽取3个批次的试剂盒，每批试剂盒测定同一份样本3次。结果该试剂盒批内cv<10％，批间cv<15％，满足检测要求。实施例9试剂盒特异性试剂盒的特异性可用药物的交叉反应率来表示，见表1。表1.试剂盒的交叉反应率药物名称ic50(ppb)交叉反应率(％)甲基苯丙胺0.5100苯丙胺1.241.6mda1.533.3mdma0.5100实施例10试剂盒稳定性1.加速稳定性试验：采用冷热性加速实验确定试剂盒的稳定性。将三批试剂盒分别置于4℃和37℃恒温箱中，每隔1天测试曲线及样本。该实验结果显示：该试剂盒在37℃经12天的保存试验，od值有所下降，但零标准吸光度值仍在1.0以上。ic50均在0.30～0.6ng/ml之间，样本检出率均符合要求；标准品板内变异系数在15％以下。2.实际稳定性试验：从三批试剂盒中抽出6个试剂盒，每隔一个月均做4℃的保存试验。每个时间点分别取出1个试剂盒，每个试剂盒做5条曲线、5个样品重复，测定其ic50抑制浓度(灵敏度)、检测限、标准品板内变异系数和回收率等相关技术指标。该实验结果显示：试剂盒保存条件为2～8℃，经过近12个月的测定，发现试剂盒从生产之起到第12个月，各项指标均符合要求。实施例11试剂盒与仪器对实际毛发样本检测结果对比共对比检测了100份毛发样本，本发明试剂盒的检出结果与仪器测定结果基本一致。由此可见，本发明的检测方法具有简单、精确、快速的优点，样本前处理工作量小，实验快速精确，实验结果重复性好，可用于毛发中毒品快速检测；本发明将毒品抗原与分子马达构建传感器，大大提高了试剂盒灵敏度；在生物传感器上偶联hrp，通过反应过程中对hrp酶活的影响来建立信号体系；将毛发作为检材，大大提高了检测的窗口期，同时还可判断吸毒史；前处理操作简单，一种处理方法可同时提取毛发中多种毒品，大大缩短了样本前处理时间与成本；本发明的试剂盒对于毛发中苯丙胺类药物检测阈值为0.2ng/mg，极大的满足了禁毒工作的需求；试剂盒保存条件为2～8℃，经过近12个月的测定，发现试剂盒从生产之起到第12个月，各项指标均符合要求。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12