抗原检测

抗原检测
1.本技术要求于2019年6月14日提交的美国临时专利申请第62/861,896号的优先权，所述美国临时专利申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
2.本文所引用的所有专利、专利申请和出版物均特此以全文引用的方式并入本文中。这些出版物的公开内容特此以全文引用的方式并入本技术中，以便更全面地描述自本文所描述和要求保护的发明的日期起本领域技术人员已知的现有技术的状态。
3.本专利公开含有受版权保护的材料。版权所有人不反对任何人对本专利文件或专利公开内容进行复制再现，因为其出现在美国专利与商标局的专利文档和记录中，但在其它方面保留任何和所有版权。
4.政府利益
5.本发明是根据美国国立卫生研究院(national institutes of health)授予的r01ai113725、r01 ai122932和r01 hd090927在政府支持下进行的。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
6.本发明涉及用于检测和鉴定与感染相关的靶抗原的方法。


背景技术：

7.检测人类生物样品中的病原体蛋白的常规方法无法检测对于准确的感染诊断而言至关重要的次纳摩尔水平。因此，需要用于感染诊断的改进方法。本公开所解决的问题包含提供此类改进方法。


技术实现要素：

8.本发明的一方面涉及一种用于检测和鉴定疾病特异性生物标志物的方法。在一个实施例中，所述方法包括使酶消化的生物样品与抗体修饰的固体载体(amss)在某些条件下接触，所述某些条件在所述amss的靶标存在于所接触的生物样品中的情况下促进所述amss与所述靶标结合，其中抗体与疾病特异性生物标志物特异性结合；感测浓度包括约0.1pm到约6μm的范围的所述疾病特异性生物标志物；使所述样品经受基于质谱法的分析技术；检测质谱图中的m/z峰；基于质谱图中的所述m/z峰将获得生物样品的受试者鉴定为患有所述疾病。本发明的一方面涉及一种检测和鉴定受试者的疾病的方法。在一个实施例中，所述方法包括根据本文所描述的技术鉴定所述疾病特异性生物标志物；鉴定疾病特异性生物标志物谱与从来自所述受试者的所述样品获得的谱之间的相似性和差异性；基于质谱图中的所述m/z峰鉴定已经感染疾病或病症或有风险患有活动性疾病或病症的受试者；以及用治疗有效量的药物治疗所述受试者。在一个实施例中，所述疾病是由包括细菌、真菌或病毒的感染性病原体引起的。在另外的实施例中，所述细菌性疾病包括结核病、非结核分枝杆菌(ntm)疾病或肠道微生物扰动。在另一个实施例中，所述病毒性疾病包括人免疫缺陷病毒(hiv)疾病或埃博拉病毒(ebola)疾病。在实施例中，所述疾病特异性生物标志物包括疾病特异性抗
isprm-ms)。
13.在实施例中，通过maldi-tof ms鉴定的m/z峰[m+h]
+
包括：1594处的m/z峰指示与由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)复合群亚种以及堪萨斯分支杆菌(m.kansasii)感染、海鱼分枝杆菌(m.marinum)感染和溃疡分支杆菌(m.ulcerans)感染中的一种或多种感染引起的共感染相关的疾病特异性靶抗原tdaatlaqeagnfer(seq id no:1)；1901(esat-6)处的m/z峰指示与由结核分枝杆菌复合群物种引起的感染相关的疾病特异性靶抗原wdatatelnnalqnlar(seq id no:3)；2004处的m/z峰指示与由结核分枝杆菌复合群亚种引起的感染相关的疾病特异性靶抗原tqidqvestagslqgqwr(seq id no:2)；2032处的m/z峰指示与由堪萨斯分支杆菌引起的感染相关的疾病特异性靶抗原；或其组合。
[0014]
在另一个实施例中，通过maldi-tof ms鉴定的m/z峰[m+h]
+
包括：1463da处的m/z峰指示hiv-1感染的疾病特异性肽etineeaaewdr(seq id no:5)；1448da处的m/z峰指示hiv-1感染的疾病特异性肽dtineeaaewdr(seq id no:6)；1294da处的m/z峰指示hiv-1感染的疾病特异性肽myspvsildir(seq id no:9)；1296da处的m/z峰指示hiv-1感染的疾病特异性肽mysptsildir(seq id no:7)；或其组合。
[0015]
在另一个实施例中，通过maldi-tof ms鉴定的m/z峰[m+h]
+
包括：1322da处的m/z峰指示hiv-2感染的疾病特异性肽mynptnildik(seq id no:10)；958da处的m/z峰指示表明hiv-2感染的疾病特异性肽aeqtdpavk(seq id no:11)；或其组合。
[0016]
本发明的一方面涉及一种用于检测和鉴定疾病或病症的生物标志物的试剂盒，所述试剂盒包括抗体修饰的固体载体中的一种或多种以及使用说明书，其中抗体与疾病或病症肽或其片段特异性结合。
附图说明
[0017]
图1是用于检测来自人类血清或血浆中的cfp10的胰蛋白酶消化的肽序列的示例性磁性ns maldi-ms平台的示意性图示。
[0018]
图2是磁性纳米颗粒(np)的sem图像。
[0019]
图3呈现了血清中cfp-10(肽1593)定量的滴定曲线。微波辅助胰蛋白酶消化后掺入cfp-10的健康血清的maldi-tof ms谱。肽1593被抗1593抗体修饰的np捕获。血清中的检测极限为0.26nm。内部同位素肽(mw：1604)，参考：1nm，相对于100ul血清，在胰蛋白酶消化后添加。
[0020]
图4呈现了微波辅助胰蛋白酶消化后掺入cfp-10的健康血清的maldi-tof ms谱。肽2004被抗体2004修饰的np捕获。血清中的检测极限为0.4nm。内部同位素肽(mw：2014)，参考：1nm，相对于100ul血清，在胰蛋白酶消化后添加。
[0021]
图5a-5d展示了在万维网上的unipept.ugent.be处获得的在cfp-10和esat-6的胰蛋白酶消化后所选的肽序列的起源。
[0022]
图6a-6c示出了用于对血清中的cfp-10肽进行mrm-ms检测的工作流。(图6a)ms分析前的样品加工。(图6b)lc-mrm ms系统的方案和流量设置。用于将肽从分析柱洗脱的缓冲液是红色的。用于样品装载的缓冲液是橙色的。这是从赛默飞世尔科技公司(thermo scientific)ultimate 3000rslcnano系统的仪器手册中引用的，但稍作修改。(图6c)从靶向肽(红色)和其带有导致其产物片段发生10da的质量偏移的稳定同位素标记的内部标准
品(绿色)产生的mrm-ms信号。
[0023]
图7a-7c示出了来自阳性临床样品的代表性ms信号。(图7a)呈现了针对靶向cfp-10肽(上图)和其内部标准品(下图)所选的每个mrm跃迁的强度，并且其m/z被标记在每个质心峰上。(图7b)从skyline输出的靶向cfp-10肽的提取离子色谱图。(图7c)通过对靶向cfp-10肽进行稳定同位素标记产生的内标肽的提取离子色谱图。所有监测到的碎片以不同的颜色呈现，并且其m/z和电荷列出于框图例中。
[0024]
图8a-8c呈现了对mrm跃迁的选择。(图8a)靶向cfp-10肽的其m/z在300-1,500的范围内的所有理论b和y离子以及由srm collider提供的其人类蛋白质组干扰的概述。在最终测定中所选的所有离子都用绿色圆圈标记，并且由于图10中所展示的标准设置而未被选择的一些离子用红色圆圈标记。(图8b)靶向肽的ms/ms谱在数据库搜索后鉴定并用于在skyline中建立谱库。(图8c)来自靶向肽的y13(左图，红点)和y9(右图，红点)碎片离子的保留时间和质荷比和其干扰(蓝点)。
[0025]
图9呈现了用于病原体选择、方法开发和方法验证的方案1。
[0026]
图10呈现了框1，一种如何通过基于机器的方式选择mrm跃迁的方案。
[0027]
图11呈现了iprm-ms平台的示意性图示。对来自hiv的血清进行胰蛋白酶消化，将其中掺入稳定同位素标记的内部标准品，针对两种靶肽进行抗体富集，并通过lc-sprm-ms进行分析。通过靶肽和同位素标记的内标肽的ms强度比确定靶肽的多重定量。
[0028]
图12示出了来自不同的hiv-1和hiv-2菌株的gap蛋白的序列比对。通过clustal omega(1.2.4)多序列比对(http://www.uniprot.org/align/)对来自uniprotkb数据库的hiv-1和hiv-2的序列进行比对。从具有对应的序列区的靶肽中选择来自hiv-1的4种肽和来自hiv-2的2种肽作为用于基于其特异性分别对hiv-1和hiv-2进行检测和定量的靶肽。来自hiv-1的4种肽的组合允许检测超过95％的hiv-1菌株，而2种肽的组合可以覆盖超过98％的hiv-2菌株。经过比对的序列中的红色文本(r和k)指示胰蛋白酶切割位点。
[0029]
图13示出了在同一谱中对hiv抗原肽(p24肽)和mtb抗原肽(cfp-10肽)两者的定量。这允许使用相同的质谱法定量谱来诊断和监测来自单个生物同物的hiv-tb共感染患者的病理状态。
[0030]
图14示出了仪器方法。
[0031]
图15示出了重组p24胰蛋白酶消化产物的maldi-tof ms谱。
[0032]
图16示出了hiv和siv病毒的系统发生树。图像指示了hiv和siv病毒的主要分组。hiv-1m(“主要”)分组含有导致大多数人类感染的hiv-1亚型，其中这个分组中的亚型占所报告的hiv/aids病例的》90％，尽管这些亚型的流行和其循环重组表格(crf)因地理区域而异(参见图17)。
[0033]
图17示出了hiv-1的全球和区域分子流行病学，1990-2015:系统回顾、全球调查和趋势分析(a systematic review,global survey,and trend analysis)(hemelaar,j.等人,《柳叶刀传染病(the lancet infectious diseases)》,2018,19(2),第143-155页)。hiv-1m亚型a、b和c似乎是造成全球大多数(72.9％)hiv-1感染的原因，其中hiv-1亚型c占所有病例的几乎一半(46.6％)。hiv-1m的循环重组形式(crf；亚型a衍生物)和独特的重组形式(urf)是造成大多数其余全球hiv-1感染(总数的22.8％)的原因。每种病毒的大致分布和流行如下：hiv-1m亚型a(常见于东非、东欧和中亚)、亚型b(发现于北美和南美、欧洲、中
东、北非、日本和澳大利亚的主要形式)、亚型c(在南非、东非和印度占主导地位)、亚型d(主要发现于东非和中非)、亚型f(在中非、南美和东欧检测到)、亚型g(在非洲和中欧检测到)、亚型h(限于中非)和亚型j(主要在北非、中非和西非以及加勒比地区检测到)。对于其它三个亚型，亚型k(限于刚果民主共和国(drc)和喀麦隆)和亚型l(限于drc)可能是新的亚型。非分组m病毒感染少见且受地域限制：所有已知的hiv-1n病例均受到限制(截至2015年《20个病例)，而hiv-1o病例主要在中西部非洲检测到(喀麦隆的hiv-1病例《2％)。大多数(》80％)hiv-2病例是在西非检测到的，只有亚型a和b被认为是大流行的。(总结改编自s,pattou c、walker n、schwardlander b、esparza j；用于hiv分离和表征who-unaids网络(who-unaids network for hiv isolation and characterization).(2002)2000年hiv-1遗传亚型的估计的全球分布和区域传播(estimated global distribution and regional spread of hiv-1genetic subtypes in the year 2000).《获得性免疫缺陷综合征杂志(j acquir immune defic syndr.)》29(2):184-90)。
[0034]
图18示出了用于同时检测和定量hiv和tb的lc-isprm-ms平台。图a：将来自无hiv-1和tb的人类受试者的血清中掺入重组p24和cfp-10蛋白，然后进行胰蛋白酶消化，将其中掺入稳定同位素标记的内部标准品，针对两种靶肽进行抗体富集，并通过lc-sprm-ms进行分析。通过靶肽和同位素标记的内标肽的ms强度比确定靶肽的多重定量。图b：由于质谱仪所提供了对靶肽的多个确认，包含保留时间、质荷比(m/z)和ms/ms谱，p24和cfp-10特异性肽可以同时富集并以高特异性从掺入的血清样品中灵敏地检测。
[0035]
图19示出了用于hiv-1感染的诊断和治疗监测的p24抗原的定量检测。a.使用来自成人和婴儿的血清进行hiv-1诊断。水平实线指示每组的中位数和95％置信区间。红色虚线指示hiv-1诊断的p24截止值(0.1pmol/l)。b.血清转化组中的p24抗原的定量监测。c.来自p1041队列的接受抗逆转录病毒疗法的患者中的p24的纵向监测。
[0036]
图20示出了患者血清样品中的p24和cfp-10的同时测量。a.来自患有或未患有hiv、tb或hiv/tb感染的患者的血清中的p24(下部单元格，蓝色)和cfp-10(上部单元格，红色)水平的热图，其中每列描绘了来自单独的受试者的结果，按cfp-10浓度从高到低排列。颜色强度反映了抗原水平的三重均值并且对应于匹配梯度条中的浓度。b-f.接受抗tb治疗的hiv-1/tb共感染患者中的血清p24和cfp-10浓度的纵向监测。
[0037]
图21示出了胰蛋白酶消化的p24片段的maldi-tof ms信号。a：重组p24胰蛋白酶消化产物的质谱图。b：p24胰蛋白酶消化产物的理论[m+h]
+
值。
[0038]
图22示出了来自重组p24的靶肽的lc-ms/ms谱。选择靶肽的对应于2+电荷状态的p24前体离子(m/z为648.34和731.82)进行ms/ms碎裂。b和y离子系列指示以下的序列：(a)etineeaaewdr，m/z为731.82时，[m+h]
2+
；(b)dtineeaaewdr，m/z为724.82时，[m+h]
2+
；
[0039]
图23示出了hiv-1和hiv-2序列比对。来自hiv-1和hiv-2uniprotkb数据库条目的p24蛋白质区域的序列比对，其中突出显示的文本指示胰蛋白酶切割位点(红色，r和k残基)以及序列同一性区域(深蓝色)和氨基酸保守区域(浅蓝色)。
[0040]
图24示出了p24特异性肽etineeaaewdr和其变体dtineeaaewdr在两种肽中掺入血清(各自6pm)并经受抗体富集后同时富集针对etineeaaewer产生的抗体。在产生类似强度的etineeaaewdr(a)与dtineeaaewdr(b)的两种肽之间发现了0.3分钟的时间偏移。(c)etineeaaewdr、(d)dtineeaaewdr和其相应(e)(f)同位素标记的内标肽(i.s)的(c)、(d)、
(e)和(f)ms/ms谱。
[0041]
图25示出了接受抗tb治疗的hiv-1/tb共感染患者中的血清p24和cfp-10浓度的纵向监测。
[0042]
图26示出了使用固定化tpck胰蛋白酶代替测序级胰蛋白酶的值的图表。
[0043]
图27示出了使用来自不同制造商的多种磁性纳米颗粒得到的色谱图。
[0044]
图28示出了去除非特异性结合之前和之后的两个色谱图。
[0045]
图29示出了使用不同的磁珠平台和不同浓度的病原体靶肽得到的色谱图。
[0046]
图30示出了使用两种不同的磁珠平台和由thermo tsq altis四极杆质谱仪产生的不同浓度的病原体靶肽得到的色谱图。
具体实施方式
[0047]
本文所提供的方法和组合物至少部分地基于发明人开发的用于检测和鉴定生物样品(如血清或血浆)中的疾病特异性生物标志物(例如，病原体抗原)的基于质谱法的方法。如本文所描述的，所述样品中特定疾病相关靶抗原的存在提供感染信息。在一些实施例中，所述信息与结核病(tb)诊断相关。在一些实施例中，所述信息与监测tb疗法相关。在一些实施例中，所述信息与hiv诊断相关。在一些实施例中，所述信息与监测hiv治疗相关。
[0048]
本文提供一个或多个实施例的具体实施方式。然而，应当理解，本发明可以用各种形式来体现。因此，本文所公开的具体细节不应被解释为限制性的，而是作为权利要求书的基础并且作为教导本领域技术人员以任何适当的方式来采用本发明的代表性基础。
[0049]
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述了优选的方法和材料。本文所提及的所有出版物都是出于描述和公开可以与本发明结合使用的出版物中报告的化学品、细胞系、载体、动物、仪器、统计分析和方法的目的而通过引用并入本文中。本文中的任何内容均不应被视为承认本发明因现有发明而无权先于此公开内容。
[0050]
除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。在权利要求书和/或说明书中，当结合术语“包括(comprising)”使用时，词语“一个”或“一种”的使用可以指“一个/一种(one)”，但是还与“一个或多个/一种或多种(one or more)”、“至少一个/至少一种(at least one)”、以及“一个或多于一个/一种或多于一种(one or more than one)”一致。
[0051]
无论本文何处使用了“例如”、“如”、“包含”等短语，除非另有明确说明，否则应理解为短语“和但不限于”跟随其后。类似地，“实例”、“示例性”等应理解为非限制性的。
[0052]
术语“基本上”允许与对预期目的不产生负面影响的描述符的偏离。即使“基本上”一词没有明确地列举出来，描述性术语也应理解为由术语“基本上”修饰。
[0053]
术语“包括(comprising)”和“包含(including)”和“具有(having)”和“涉及(involving)”(和类似地“包括(comprises)”、“包含(includes)”、“具有(has)”和“涉及(involves)”)等可互换使用且具有相同含义。具体地，所述术语中的每个术语被定义成与“包括”的通用美国专利法定义一致，并且因此应被解释为意指“至少以下”的开放术语，并且还应被解释为不排除另外的特征、限制、方面等。因此，例如，“涉及步骤a、b和c的过程”意
指包含至少步骤a、b和c的过程。无论在何处使用术语“一个”或“一种”，应理解为“一个或多个/一种或多种”，除非此种解释在上下文中是无意义的。
[0054]
如本文所用，本文中使用术语“约”意指大约、大致、左右或在其区域中。当结合数值范围使用术语“约”时，所述术语通过扩展所阐述的数值以上和以下的界限来修改所述范围。通常，本文中使用术语“约”按向上或向下(更高或更低)例如20％的变化来修饰所述值以上和以下的数值。
[0055]
检测和鉴定的方法
[0056]
本文所描述的各方面涉及使用本文所描述的ms方法检测和鉴定疾病特异性生物标志物的方法。本文所描述的各方面还涉及使用本文所描述的ms方法检测和鉴定受试者的疾病的方法。术语“疾病特异性生物标志物”可以是指指示疾病的存在的任何标志物。在一些实施例中，所述疾病特异性生物标志物包括疾病特异性抗原、疾病特异性蛋白、疾病特异性肽或其片段。在一些实施例中，所述疾病特异性生物标志物的长度可以是5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个或30个氨基酸。例如，如本文所描述的，疾病特异性生物标志物可以基于在通过(例如)maldi-tof ms分析时标志物的信号强度和标志物检测和/或辨别hiv-1亚型和hiv-2的能力的组合来选择。在不希望受到理论束缚的情况下，疾病特异性生物标志物(例如，疾病特异性肽)含有不同的物种或菌株(如细菌物种或病毒菌株)之间的显著序列保守区，所述显著序列保守区将在本文所描述的测定中进行分析，以便肽通过肽特异性方法结合和沉淀，从而使肽从在样品消化期间产生的肽背景中进行富集。在不希望受到理论束缚的情况下，肽的长度和所述肽的组合物可能会影响所述肽的m/z值，并且因此影响所述肽在ms分析期间的可检测性。例如，根据本文所描述的方法检测到了肽vhpvhagpippgqmr，但是与选择利用的两个肽(例如，(e/d)tineeaaewdr或mysptsildi(r/k))相比，vhpvhagpippgqmr肽在各种hiv-1亚型之中和之内的出现更加多变。在不希望受到理论束缚的情况下，使用vhpvhagpippgqmr肽作为靶生物标志物将会由于变异性而使检测可以检测大多数hiv-1亚型的抗体更加困难。例如，hiv示出了其基因组上的高突变，并且突变可以在所靶向的肽序列区中鉴定出。此处，为了覆盖所有hiv-1菌株，可以使用具有氨基酸变异的多个肽序列来实现这种最高覆盖率。除非患者感染了多种hiv-1菌株，否则可能无法观察这些峰的组合。
[0057]
如本文所描述的这种疾病特异性生物标志物可以指示感染或疾病。所述疾病特异性生物标志物也可以用于检测感染性病原体(如细菌性病原体、真菌性病原体和/或病毒性病原体)。在实施例中，所述疾病包括细菌性疾病或病毒性疾病。病原性细菌的可以引起哺乳动物(如人)的疾病/感染的非限制性实例包含：链球菌属(streptococcus)(例如，肺炎链球菌(s.pneumoniae)、血液链球菌(s.sanguinis)、牛链球菌(s.bovis))、假单胞菌属(pseudomonas)(例如，铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)、栖稻假单胞菌(p.oryzihabitans))、沙门氏菌(salmonella)(例如，肠道沙门菌(s.enterica)、邦戈沙门菌(s.bongori))、志贺氏菌属(shigella)(例如，痢疾志贺菌(s.dysenteriae)、福氏志贺菌(s.flexneri))、支原体(mycoplasma)(例如，肺炎支原体(m.pneumoniae)、生殖支原体(m.genitalium))、分支杆菌属(mycobacterium)(例如，结核分支杆菌、麻风分枝杆菌(m.leprae)、堪萨斯分支杆菌、海鱼分枝杆菌、溃疡分支杆菌)。病原性真菌的可以引起哺乳动物(如人)的疾病/感染的非限制性实例包含：肺囊虫属(pneumocystis)(例如，卡氏肺囊虫(p.carinii)、耶氏肺囊虫
(p.jirovecii))。例如，结核分枝杆菌可以引起结核病。例如，非结核分枝杆菌(ntm)感染可以引起ntm肺病。可以引起疾病/感染的病原性病毒的非限制性实例包含正粘病毒科病毒(orthomyxoviridae family virus)(例如，甲型流感病毒和乙型流感病毒(influenza a and b))、副粘病毒科病毒(paramyxoviridae family virus)(例如，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)和副流感病毒1-4(parainfluenza virus 1-4))、丝状病毒科病毒(filoviridae family virus)(例如，本迪布焦病毒(bundibugyo virus)、雷斯顿病毒(reston virus)、苏丹病毒(sudan virus)、塔伊森林病毒(forest virus)、扎伊尔埃博拉病毒(zaire ebolavirus)(埃博拉病毒)、马尔堡病毒(marburg virus)(马尔堡(marburg)出血热))、布尼亚病毒科病毒(bunyaviridae family virus)(例如，汉坦病毒(hantaviruses)、裂谷热(rift valley fever)和克里米亚-刚果(crimean-congo)出血热)、腺病毒科病毒(arenaviridae family virus)(例如，拉沙热病毒(lassa fever virus))、逆转录病毒科病毒(例如，hiv、fiv)和黄病毒科病毒(flaviviridae family virus)(例如，登革热(dengue)和黄热病(yellow fever))。
[0058]
例如，与上述病原体相关的疾病包括结核病、埃博拉病毒疾病(evd)、非结核分枝杆菌(ntm)肺病、人免疫缺陷病毒(hiv)感染(如aids和卡波济氏肉瘤(kaposi's sarcoma)或肠道微生物扰动。在实施例中，所述疾病不仅仅是非结核分枝杆菌(ntm)肺病。在实施例中，检测和鉴定疾病特异性生物标志物的方法包括：使所述样品经受基于质谱法的分析技术；以及检测质谱图中的m/z峰。在实施例中，所述方法包括基于所述质谱图中的所述m/z峰将获得生物样品的受试者鉴定为患有疾病。在一个实施例中，所述疾病特异性生物标志物的分子量的范围为约500da到约5000da。例如，所述分子量包括小于500da、约500、约600da、约700da、约800da、约900da、约1000da、约1500da、约2000da、约2500da、约3000da、约3500da、约4000da、约4500da、约5000da和大于5000da。
[0059]
本发明的各方面涉及使酶消化的样品与抗体修饰的固体载体(amss)接触。例如，酶消化的样品包括胰蛋白酶消化的样品。在一些实施例中，所述接触可以在疾病特异性抗体存在于所接触的生物样品中的情况下促进所述amss与所述疾病特异性抗体的结合的条件下发生。术语抗体修饰的固体载体(amss)是指可以是多孔的或无孔的任何固体载体。在一些实施例中，所述amss可以是抗体可以结合的任何固相底物。在另外的实施例中，所述amss的表面可以被修改成产生例如pct公开第wo/2018/151930号中所描述的纹理化表面，以限定如孔、脊、谷或其它类似的形态等特征，所述pct公开特此以全文引用的方式并入。在另外的实施例中，无孔载体可以是透明的，如玻璃，或可替代地塑料、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、聚丙烯等。在其它实施例中，多孔载体可以是硝化纤维素、多孔玻璃或琼脂糖(如塞法戴克斯(sephadex))。所述amss的非限制性实例包含：珠(如塑料的、玻璃的、二氧化硅的、磁性的、琼脂糖的等)、纳米颗粒(如纳米盘)、微颗粒(如微盘或磁珠)、薄膜、杆。在一些实施例中，所述纳米颗粒的大小为约10nm到约1000nm。例如，所述纳米盘为约800nm。在一些实施例中，所述纳米盘可以为约50nm、约100nm、约200nm、约300nm、约400nm、约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm或约1000nm。例如，所述amss包括磁珠。在一些实施例中，所述磁珠的大小为约1微米到约100微米。例如，所述磁珠为约1微米到约2.8微米。例如，所述磁珠可以为约0.5μm、约1μm、约1.25μm、约1.50μm、约1.75μm、约2μm、约2.25μm、约2.5μm、约2.75μm、约3μm、约3.25μm、约3.50μm、约3.75μm、约4μm、约4.25μm、约4.5μm、约4.75μm、约5μm、约5.25
1是产物离子谱的产生。术语“产物离子”是指是母离子的碎裂的产物的离子。例如，所述串联质谱法(ms2)技术包括选择反应监测(srm)、平行反应监测(prm)、计划平行反应监测(sprm)、多反应监测(mrm)、计划多反应监测(smrm)、免疫沉淀计划平行反应监测(isprm)或纳升电喷雾串联质谱法(nanoes-ms/ms)。另外地，所述ms2技术可以包括数据非依赖性采集(dia)或数据依赖性采集(dda)。例如，msn可以是ms2、ms3、ms4、ms5或靶离子的顺序产生。例如，为了对两个样品之间的标志物进行相对定量，将会应用如tmt等标记标签，并且使用ms3来产生定量结果。
[0064]
在实施例中，串联质谱法(ms2)包括用于诱导碎裂的技术，所述用于诱导碎裂的技术包括碰撞诱导解离(cid)、电子捕获解离(ecd)、电子转移解离(etd)、负电子转移解离(netd)、电子分离解离(edd)、电荷转移解离(ctd)、光解离、红外多光子解离(irmpd)、黑体红外辐射解离(bird)或表面诱导解离(sid)。
[0065]
除了电离技术之外，所述质谱法技术利用至少一个质量分析器，所述至少一个质量分析器包括四极杆质量分析器、飞行时间(tof)质量分析器、磁式扇形质量分析器、静电扇形质量分析器、四极杆离子阱质量分析器、轨道阱质量分析器或离子回旋共振质量分析器。
[0066]
在另外的实施例中，本发明涉及应用于与amss结合的疾病特异性生物标志物的基于质谱法的分析技术。在另一个实施例中，本发明涉及应用于经洗脱的疾病特异性生物标志物的基于质谱法的分析技术。
[0067]
在一些实施例中，所述方法使用基于maldi-tof-ms的方法，但是在其它实施例中，可以由本领域技术人员来应用其它质谱法技术。在maldi(基质辅助激光解吸电离)tof(飞行时间)质谱法中，样品/基质混合物被放置在已知为maldi板的金属板上的限定位置(本文中的“点”或“样品点”)上。激光束被引导到所述点上的位置持续非常短暂的瞬间，从而引起所述样品的分子或其它组分的解吸和电离。所述样品组分“飞行”到离子检测器。所述仪器以质谱图的形式测量所述样品中的所述组分(分子)的质荷比(m/z)和相对强度。术语质荷比(m/z)是指物种的质量与物种的电荷状态的比率。本文所描述的，应当理解，m/z峰是指[m+h]
+
离子。本领域技术人员应当理解，氢离子可以被另一个离子置换。例如，所述离子可以是阳离子或阴离子。阳离子的非限制性实例包含纳(na
+
)、钾(k
+
)和铯(cs
+
)。本领域技术人员还应当理解，分析物的标称质量或精确质量将不会改变，但是m/z将会基于所使用的抗衡离子而改变。例如，[m+h]
+
峰的m/z将不同于与[m+na]
+
峰的m/z，而m的质量保持不变。m/z峰也可以是指多重带电物种。如本文所描述的，样品中特定疾病相关靶抗原的存在提供感染信息，例如用于进行结核病(tb)诊断和用于监测tb疗法。
[0068]
在一些实施例中，所述方法使用与分离技术组合的基于质谱法的分析技术。在一些实施例中，所述与分离技术组合的基于质谱法的分析技术包括基于lc-ms的方法或气相色谱法-质谱法(gc-ms)。例如，所述基于质谱法的分析技术包括与质谱法技术耦合的液体-固体相互作用(正和/或反相相互作用)的柱色谱法。当与靶向ms方法多反应监测(mrm)、选择反应监测(srm)和平行反应监测(prm)模式一起使用时，液相色谱法(lc)耦合的质谱法(ms)是用于生物标志物分析的准确分析方法。在lc-ms中，靶蛋白鉴定会通过用特性lc柱洗脱时间和荷质比检测靶肽来增强。可以对多种生物标志物源性肽进行分析以提供提高的检测特异性，并且还可以在ms碰撞池中将这些肽的前体离子碎裂以允许直接确定所述这些肽
的氨基酸序列。在一些实施例中，所述方法使用基于lc-mrm-ms的方法。在一些实施例中，所述方法使用基于lc-isprm-ms的方法。在一些实施例中，所述基于lc-ms的方法包括液相色谱法-质谱法(lc-ms)、液相色谱法与串联质谱法(lc-ms-ms或lc-ms2)、液相色谱法-计划平行反应监测-质谱法(lc-sprm-ms)或免疫沉淀耦合的液相色谱法-计划平行反应监测-质谱法(lc-isprm-ms)。在一些实施例中，所述方法使用免疫沉淀(ip)与纳升电喷雾串联ms(nanoes-ms/ms)。
[0069]
因此，另一方面，本文中提供了一种检测和鉴定样品中病原体相关肽的方法。在一些实施例中，基于maldi-tof-ms的检测方法，其中使用抗体修饰的氧化铁纳米颗粒在酶消化的人类血清或血浆样品中检测和鉴定了特定分枝杆菌属相关肽。与磁性dynabead的常规用途不同，在所述常规用途中，所富集和结合的靶肽会在富集之后洗脱出，本发明方法包含：如果样品中存在靶肽，在捕获靶肽后将抗体修饰的np直接点样到maldi板上。以这种方式，过程简化并且检测极限降低。通过将从分枝杆菌属蛋白消化得到的不同肽组合，由结核分枝杆菌引起的感染可以与由堪萨斯分支杆菌和其它分枝杆菌引起的感染区分开来。如本文所描述的，所述方法提供了一种用于将受试者诊断为患有特定分枝杆菌属感染或两种或更多种分枝杆菌物种的共感染的新工具。
[0070]
在一些情况下，所述方法包括：胰蛋白酶消化的生物样品与抗体修饰的磁性纳米颗粒(np)在某些条件下接触，所述某些条件在所述抗体修饰的磁性np的靶标存在于所接触的生物样品中的情况下促进所述抗体修饰的磁性np与所述靶标结合，其中抗体与疾病特异性靶抗原特异性结合；将所接触的抗体修饰的磁性np点样到maldi板；对所点样的np进行maldi-tof-ms分析，由此获得分子的质谱图；以及检测质谱图中的m/z[m+h]
+
峰，其中1594处的m/z峰指示与由结核分枝杆菌复合群亚种以及堪萨斯分支杆菌感染、海鱼分枝杆菌感染和溃疡分支杆菌感染中的一种或多种感染引起的共感染相关的疾病特异性靶抗原，其中1901或2004处的m/z峰指示与由结核分枝杆菌复合群亚种引起的感染相关的疾病特异性靶抗原，并且其中2032处的m/z峰指示与由堪萨斯分支杆菌引起的感染相关的疾病特异性靶抗原。这种质量靶标也可以从是引起人类感染的另一种ntm物种的戈氏分支杆菌(m.gordonae)中观察到。
[0071]
所述磁性纳米颗粒可以是fe3o4、mnfe2o4、cofe2o4、nife2o4或znfe2o4。在一些情况下，所述抗体修饰的磁性纳米颗粒通过以下步骤来制备：通过使(3-缩水甘油丙氧基)三甲氧基硅烷(glymo)与磁性颗粒的单分散制剂接触来对磁性纳米颗粒进行表面官能化；以及将与所述疾病特异性靶抗原特异性结合的抗体与glymo接触的磁性纳米颗粒缀合。
[0072]
在一些情况下，其中，在将抗体缀合之前，所述glymo接触的磁性纳米颗粒与选自tris-nacl缓冲液(ph》8.0)、(2-氨基乙基)乙醇或nh2(ch2ch2o)nch3的封闭溶液接触；其中n是1到100的数字。
[0073]
在一些实施例中，分枝杆菌属特异性肽是在如10-kda培养滤液蛋白(cfp-10)等分枝杆菌蛋白的胰蛋白酶消化之后检测到的肽，所述cfp-10是早期分泌抗原。在一些情况下，所述疾病特异性靶抗原的分子量的范围为约500道尔顿(da)到约5000道尔顿(da)。具体地，所述疾病相关抗原包含在胰蛋白酶消化之后检测到的cfp-10的两个区段：肽1594(tdaatlaqeagnfer，mw：1593.75；seq id no:1)和肽2004(tqidqvestagslqgqwr，mw：2003.98；seq id no:2)。肽2004仅发现于结核分枝杆菌复合群亚种(结核分支杆菌、非洲分
支杆菌(m.africanum)、牛分枝杆菌(m.bovis)、坎纳分枝杆菌(m.canettii)、山羊分枝杆菌(m.caprae)、orysis分支杆菌(m.orysis)、海豹分枝杆菌(m.pinnipedii))中；而肽1594发现于结核分枝杆菌复合群亚种(结核分枝杆菌)以及堪萨斯分支杆菌、海鱼分枝杆菌、溃疡分支杆菌和/或胃分枝杆菌(m.gastrii)中。因此，通过检测胰蛋白酶消化的患者血清或血浆样品中特定肽的存在或不存在，可以将由结核分枝杆菌复合群亚种引起的感染与由堪萨斯分支杆菌、海鱼分枝杆菌、溃疡分支杆菌和/或胃分枝杆菌引起的感染区分开来。参见表1。
[0074]
表1：基于在血清消化后对肽序列进行的检测对感染进行诊断
[0075][0076]
1594处的m/z[m+h]
+
指示与由结核分枝杆菌复合群亚种以及堪萨斯分支杆菌感染、海鱼分枝杆菌感染和溃疡分支杆菌感染中的一种或多种感染引起的共感染相关的疾病特异性靶抗原。1901或2004处的m/z[m+h]
+
峰指示与由结核分枝杆菌复合群亚种引起的感染相关的疾病特异性靶抗原。2032处的m/z[m+h]
+
峰指示与由堪萨斯分支杆菌和/或胃分枝杆菌引起的感染相关的疾病特异性靶抗原。
[0077]
表12：用于五种埃博拉病毒物种鉴定的vp40肽靶标
[0078][0079]
表12示出了1171.7处的m/z[m+h]
+
峰指示疾病特异性肽序列lgpgipdhplr*，其指示感染埃博拉病毒(ebov)、本迪布焦病毒(bdbv)、塔伊森林病毒(tafv)和/或雷斯顿病毒(restv)。1202.7处的m/z[m+h]
+
峰指示疾病特异性肽序列lgqgipdhplr，其指示感染苏丹病毒(sudv)。1063.7处的m/z[m+h]
+
峰指示疾病特异性肽序列lrpillpnk，其指示感染埃博拉病毒(ebov)。1006.7处的m/z[m+h]
+
峰指示疾病特异性肽序列lrpillpgk*，其指示感染本迪布焦病毒(bdbv)和/或雷斯顿病毒(restv)。1034.7处的m/z[m+h]
+
峰指示疾病特异性肽lrpillpgr，其指示感染塔伊森林病毒(tafv)。992.7处的m/z[m+h]
+
峰指示疾病特异性肽序列lrpvllpgk，其指示感染苏丹病毒(sudv)。
[0080]
在一些实施例中，hiv-1/2特异性肽是在胰蛋白酶消化之后检测到的肽。例如，
hiv-1特异性肽包含etineeaaewdr(1462.64处的m/z峰)；dtineeaaewdr(1447.62处的m/z峰)；myspvsildir(1293.54处的m/z峰)；和mysptsildir(1295.54处的m/z峰)，它们共同覆盖95％的hiv-1染色剂。hiv-2特异性肽包含mynptnildik(1321.68处的m/z峰)、mynpptnildik(seq id no:12)(1321.68处的m/z峰)和aeqtdpavk(958.04处的m/z峰)，它们共同覆盖98％的hiv-2菌株。参见图12。例如，在hiv-2的情况下，多种菌株被覆盖。在不希望受到理论束缚的情况下，此处由于天然突变而靶向多于一个序列。
[0081]
在一些情况下，所述胰蛋白酶消化的生物样品包括一种或多种内部参考标准品。在实施例中，所述内部参考标准品包括同位素标记的样品。在一个实施例中，所述样品是合成肽，所述合成肽的序列与所述疾病特异性生物标志物的序列相同，但所述合成肽用稳定重同位素标记以使其m/z比偏移固定量。例如，同位素标记的合成肽以已知量掺入到样品中，使得其信号可以与生物标志物靶信号进行比较，以允许对样品中存在的生物标志物的未知量进行绝对定量。
[0082]
在一些情况下，所述方法进一步包括生成参考质谱图，其中对应于一种或多种所关注微生物抗原的峰可靠地存在于所述参考质谱图中。
[0083]
在一些实施例中，用于检测血清/血浆生物标志物的方法是免疫沉淀(ip)与纳升电喷雾串联ms(nanoes-ms/ms)的整合。这种方法用于检测由结核分枝杆菌(mtb)分泌的毒力因子，即上文所描述的10kda培养滤液蛋白(cfp-10)的循环水平。在可以进行此类靶向ms分析之前，患者血清/血浆样品需要进行消化以将靶肽从其相应的生物标志物中释放。这种过程会由于存在于血清中的蛋白质的高丰度、多样性和动态范围而变得复杂。为了解决这个问题，使用了样品变形和蛋白质色谱法方案来降低这些样品中的脱靶蛋白质的丰度，在这之后，对蛋白质耗竭的样品进行胰蛋白酶消化，并在没有缓冲液交换步骤的情况下使其经受ip。这个过程降低了高效且可重现地产生用于进行生物标志物鉴定和定量的靶肽所需的胰蛋白酶量。相较于标准方法，这个过程具有若干优点，原因在于：1)避免样品稀释并且可以按照需要按比例调整以考虑样品中的靶生物标志物的观察到的浓度；2)即使酶与底物质量比较低(即，1:500-1:1,000)，也允许高效释放痕量的靶肽；以及3)不需要耗时的二硫键还原和烷基化，因为许多病原体衍生的生物标志物不含这些特征。这个工作流允许对靶生物标志物向下检测至sub-pm检测下限，并且允许从所关注的一种或多种生物标志物中多重富集和检测靶肽。
[0084]
在一些实施例中，用于检测血清/血浆生物标志物的方法是lc-prm-ms。
[0085]
如本文所用，术语“样品”意指非生物样品和生物样品，并且涵盖临床样本(作为标准临床程序的一部分收集的诊断样品)。非生物样品包含体外制备的那些非生物样品，其在溶液中包括不同浓度的所关注靶分子。生物样品包含但不限于全血、淋巴液、血清、血浆、尿液、唾液、痰、呼吸提取物(意指捕获在溶液中的呼出空气)、骨髓、抽吸物(鼻抽吸物、肺抽吸物、支气管抽吸物、气管抽吸物)、眼液、羊水、粪便、其它体液和分泌物、细胞和组织样本和其稀释物。可以使用任何适合的生物样品(“生物样品(biosample)”)。例如，生物样品可以是从受试者获得的样本，或者可以源自此名受试者。受试者可以提供多种生物样品，包含来自例如活检或组织的固体生物样品。在一些情况下，样品可以是被放置于组织培养中或适于组织培养的组织区段或细胞。生物样品还可以是如尿液、血液、血浆、血清、唾液、泪液、脑脊液、精液、胆汁、淋巴液或粘液等生物流体或吸收到纸或聚合物底物上的此种样品。如果
需要的话，生物样品可以被进一步分级为含有特定细胞类型的级分。在一些实施例中，样品可以是来自受试者的样品的组合(例如，组织和流体样品的组合)。在一些情况下，血清或血浆是使用本领域已知的技术从受试者获得的。例如，样品是液体活检样品。
[0086]“受试者”或“个人”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指期望诊断、预后或疗法的任何受试者，例如哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包含人类、家畜、农场动物和动物园动物、运动动物或如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等宠物动物。因此，除了可用于人类诊断和预后应用(例如，诊断人类患者的疾病)之外，本发明的所述方法和装置还可以可用于对包含伴侣动物的哺乳动物的兽医治疗。
[0087]
另一方面，本文中提供了一种包括可以用于确定受试者是否患有分枝杆菌属感染并鉴定分枝杆菌的材料和试剂的制品，如试剂盒。制品可以包含例如抗体修饰的固体载体(如磁性纳米颗粒)、抗体、maldi-tof基质和采样材料(例如，拭子、洗脱缓冲液)中的一种或多种。所述制品还可以包含用于实践用于检测和鉴定与由如本文所提供的一种或多种分枝杆菌或病毒引起的感染相关的靶抗原的方法的说明书。
[0088]
在一些情况下，所述试剂盒包括抗体修饰的磁性纳米颗粒(np)，其中抗体与分枝杆菌属或病毒肽特异性结合。所述分枝杆菌属或病毒肽可以具有包括tdaatlaqeagnfer(seq id no:1)、tqidqvestagslqgqwr(seq id no:2)、wdatatelnnalqnlar(seq id no:3)或tqidqvestaaslqaqwr(seq id no:4)的序列。
[0089]
本文所描述的所述试剂盒还可以任选地包含用于基于如本文所描述的患者的样品中特定分枝杆菌抗原的存在或不存在治疗所述患者的说明书。
[0090]
术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”、“测定”和“分析”可以在本文中可互换使用以指代任何形式的测量并且包含确定要素是否存在或不存在。这些术语可以包含定量和/或定性确定两者。评估可以是相对的或绝对的。“评估
……
的存在”包含确定存在的某物的量以及确定其是否存在或不存在。
[0091]
在又其它实施例中，说明书本身不存在于试剂盒中，而是提供了用于例如通过互联网从远程源处获得说明书的装置。此实施例的实例是包含网址的试剂盒，可以在所述网址中查看说明书和/或可以从所述网址下载说明书。相反，可以提供用于如通过提供网址从远程源获得受试者编程的装置。仍进一步地，所述试剂盒可以是其中说明书和软件两者都是如在互联网或万维网中从远程源处获得或下载的试剂盒。可以使用一些形式的访问安全性或识别协议来限制对有权使用本发明的那些网站的访问。与说明书一样，用于获得说明书和/或编程的装置通常记录在适合的记录介质上。
[0092]
实例
[0093]
下面提供了实例，以促进更全面地理解本发明。以下实例展示了制备和实践本发明的示例性模式。然而，本发明的范围并不限于仅出于说明目的的这些实例中所公开的具体实施例，因为可以使用替代性方法获得类似的结果。
[0094]
实例1：鉴定与分枝杆菌属感染相关的靶抗原
[0095]
从cfp-10中选择胰蛋白酶消化的肽区段
[0096]
10-kda培养滤液蛋白(cfp-10)是来自分枝杆菌的系列早期分泌抗原。从cfp-10中选择由胰蛋白酶消化产生的两个cfp-10区段(肽1594：tdaatlaqeagnfer，mw：1593.75；以及肽2004：tqidqvestagslqgqwr，mw：2003.98)作为靶标。肽2004仅发现于结核分枝杆菌复合
群亚种(结核分支杆菌、非洲分支杆菌、牛分枝杆菌、坎纳分枝杆菌、山羊分枝杆菌、orysis分支杆菌、海豹分枝杆菌等)中；而肽1594可以发现于从堪萨斯分支杆菌、海鱼分枝杆菌、溃疡分支杆菌等分泌的cfp-10以及结核分枝杆菌复合群中。因此，通过检测患者血清/血浆中两个肽的存在或不存在，可以将结核分枝杆菌的感染与堪萨斯分支杆菌或海鱼分枝杆菌的感染区分开来，并且因此为医师医学地治疗患者提供合理的信息。
[0097]
单分散氧化铁fe3o4np的合成
[0098]
使用含fecl
3 7h2o的乙二醇通过溶剂热法合成单分散氧化铁纳米颗粒(fe3o4)。在使用ndfeb磁体分离之后，用乙醇洗涤np。
[0099]
在将经过洗涤的np在真空中干燥过夜之后，将氧化铁np用经过稀释的hcl酸超声波洗涤，随后进行另外两次乙醇洗涤，随后在真空下干燥过夜。
[0100]
超顺磁纳米颗粒与抗1593抗体的生物缀合
[0101]
将10mg氧化铁np分散于800ul pbs缓冲液(ph：8.3，通过使用1.0m naoh来调整)，随后以7μg/mg的抗体/氧化铁比率添加在抗1593抗体中。将混合物在室温下温育3小时。将抗体修饰的np通过dynamag2分离。将np分散在1ml tris-nacl缓冲液(tris：0.2m；nacl 0.1m；ph：8.0)中，所述缓冲液用于封闭np表面上过量的环氧基。将混合物在hula混合器上温育另外30分钟(min.)。将抗体修饰的np通过dynamag2分离，并使用去离子(di)水洗涤三次。将最终抗体修饰的np分散于500μl di水中，并储存在-4℃下供进一步使用。
[0102]
超顺磁纳米颗粒与抗2004抗体的生物缀合
[0103]
将10mg氧化铁np分散于800ul pbs缓冲液(ph：8.3，通过使用1.0m naoh来调整)，随后以7μg/mg的抗体/氧化铁比率添加在抗2004抗体中。将混合物在室温下温育3小时。将抗体修饰的np通过dynamag2分离。将np分散在1ml tris-nacl缓冲液(tris：0.2m；nacl 0.1m；ph：8.0)中，所述缓冲液用于封闭np表面上过量的环氧基。将混合物在hula混合器上温育另外30分钟。将抗体修饰的np通过dynamag2分离，并使用去离子水洗涤三次。将最终抗体修饰的np分散于500μl di水中，并储存在-4℃下供进一步使用。
[0104]
患者的血清/血浆的胰蛋白酶消化
[0105]
向100μl血清/血浆添加400μl nh4hco3(100mm)，随后添加10ul胰蛋白酶(1μg/μl)。将混合物以20％微波功率在水浴中消解5分钟，换水后重复微波消解总共6次。将混合物在hula混合器中在37℃下温育过夜，并且然后以10,000rcf离心5分钟。将最澄清的上清液转移到新的ep管。
[0106]
从cfp-10捕获肽1594
[0107]
将同位素肽1603(50nm，2μl，总共100fmol)添加到胰蛋白酶消化的血浆/血清样品中。然后，将样品涡旋约10秒以混合样品。将五微升的抗体修饰的np添加到混合物。然后，将混合物用hula混合器在室温下温育3小时。将混合物离心少于10秒，以保留液体至管的底部。使用磁体(或dynamag 2)将上清液与抗体修饰的np分离。将np在洗涤缓冲液(50mm tris hcl，150mm nacl，0.2％triton x-100，ph：7.4-7.5，大约80μl/管)中洗涤3次。在去除上清液之前，将管离心小于10秒，以保持液体下至管底部。使用100μl di水洗涤np。洗涤np，直至在溶液中看不见任何气泡为止。将经过洗涤的np的管离心，并将np用磁体分离。将经过洗涤的np分散于约4μl di水中，并且然后点样到ms 96孔maldi板上(每点样2μl)。向每个点样上点样α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)(ch3cn/h2o中的6mg/ml＝0.1％tfa中的6/4(v/v)；每点样
0.7μl)。
[0108]
从cfp-10捕获肽1594
[0109]
重复实例5中的程序，其中使用同位素肽2014置换同位素肽1604。
[0110]
实例2：对衍生自血清/血浆中的人类病原体的蛋白水解肽进行免疫沉淀和靶向ms检测
[0111]
ms分析已经示出了有希望改进对包含结核病、阿尔茨海默氏症(alzheimer's)和多种癌症等在内的若干种人类疾病的理解和诊断。与作为用于进行临床生物标志物分析的常见方法的酶联免疫测定(elisa)相比，ms为对靶生物标志物进行特定检测提供了更大的可能性。elisa依赖于两种测定抗体识别所关注生物标志物上两种不同表位的能力。elisa特异性是通过这些表位对靶蛋白的限制以及通过两个区必须在同一蛋白质上被识别才能产生阳性信号这一事实来确定的。
[0112]
lc-ms分析可以证明对生物标志物靶标的特异性更大，因为其会通过用特性lc柱洗脱时间和荷质比检测靶肽来鉴定靶蛋白。可以对多种生物标志物源性肽进行分析以提供提高的检测特异性，并且还可以在ms碰撞池中将这些肽的前体离子碎裂以允许直接确定所述这些肽的氨基酸序列。siscapa(稳定同位素标准和用抗肽抗体捕获)方法允许在对所选mrm跃迁进行ms分析之前使用靶肽抗体对所关注蛋白水解肽进行免疫沉淀(ip)。
[0113]
在开发针对病原体源性肽的特定ip-ms工作流中需要考虑至少五个因素。这五个因素是：1)抗体对靶肽的亲和力和特异性；2)诊断性病原体衍生的蛋白质和其特征肽的选择标准；3)循环中的所关注蛋白质丰度和其在测定中的检测极限；4)将靶肽与干扰因素高效分离的能力；以及5)所选肽的ms信号质量。大多数基于ip的测定关注前四个因素。
[0114]
siscapa采用能够自动操作的仅添加胰蛋白酶消化方法，采用使用3-((3-胆酰氨基丙基)二甲基铵)-1-丙烷磺酸盐(chaps)缓冲液进行的洗涤步骤以减少非特异性结合事件，并且优化用于每个靶向肽的母子离子。即使做出了这些努力，低丰度肽物种与高丰度肽物种相比常常欠采样，并且无法容易地由ms检测器鉴定。仍然需要更多的努力来改进ms测定工作流以克服这种偏差。
[0115]
为了解决这个问题，新的方案是从存在于血清或血浆样品中的病原体衍生的蛋白质产生靶肽并将所述靶肽与所述病原体衍生的蛋白质分离。这种方法采用适合于与宽范围的样品体积一起使用的基于热和洗涤剂的变性步骤，并且所述基于热和洗涤剂的变性步骤允许后续的仅添加胰蛋白酶消化程序以用于生成靶肽。
[0116]
这种变性过程涉及用含有磷酸盐缓冲盐水(pbs)、triton x-100和十二烷基硫酸钠(sds)的溶液进行简单的添加和混合步骤以实现限定的最终浓度，随后进行5分钟的加热步骤。这个程序先前已经用于在elisa之前解离蛋白质复合物，包含作为对病原体的正常免疫应答的一部分产生的抗原-抗体复合物。这种流线型过程还使样品蛋白质高效变性以增强其在后续的胰蛋白酶消化步骤期间的高效切割。值得注意的是，这个程序不使用大多数蛋白质组样品加工工作流中采用并且可能会在释放靶肽以进行ms分析所需的后续消化步骤期间干扰胰蛋白酶活性的还原和烷基化试剂。如果靶蛋白不含一个或多个二硫键，正如许多病原体衍生的生物标志物的情况一样，排除这个步骤可以提高测定灵敏度。存在于变性缓冲液中的洗涤剂还可以抑制抗体捕获步骤期间的非特异性结合。
[0117]
用于将亲和分子(例如，生物标志物肽特异性抗体)缀合到富集基质的过程是基于
靶生物标志物的亲和捕获的方法的另一个重要考虑因素。这个过程可以确定亲和分子在基质上的朝向，并且因此确定其与其生物标志物靶标相互作用的能力。这个过程还可以确定可以直接和间接地影响生物标志物检测的这种相互作用的稳定性。在结合步骤期间亲和分子的任何显著丢失都会直接降低靶生物标志物的检测灵敏度，因为所述亲和分子不会被捕获在亲和基质上用于后续分析。然而，在洗脱阶段释放亲和分子可能会降低生物标志物检测，因为所述亲和分子与lc柱的结合可能会显著降低所述柱对所关注生物标志物肽的结合能力。
[0118]
蛋白质g用于siscapa工作流中的抗体捕获，因为通过与蛋白质g相互作用捕获的抗体被定位成使得其抗原识别位点可用于抗原结合。然而，这是亲和力相互作用，不是共价相互作用，并且抗体可以在生物标志物结合和洗脱步骤期间解离。这点在生物标志物洗脱期间是特别关注，其中破坏抗原-抗体复合物的条件也可能破坏抗体-蛋白质g复合物，尽管未在siscpa工作流中描述潜在可能。环氧官能团也已经用于将生物标志物特异性抗体与ip基质结合。这是共价结合，并且因此在抗原结合或洗脱程序期间的抗体丢失应该会非常少，但是抗体不会以限定的朝向与亲和基质结合，这可能会减少可用于抗原结合的抗原识别位点的数量。
[0119]
选择蛋白质g磁珠作为方案的固体表面，因为与用于将抗体缀合到环氧官能化基质的程序相比，这种方法需要更少的抗体并且更加快速。然而，为了防止通过结合靶肽洗脱期间释放的抗体而损失lc柱结合能力，使用stagetips来结合存在于洗脱液中的抗体并捕获存在于这个样品中的任何大颗粒(例如，捕获珠污染)。不是siscapa工作流的一部分的这个清理步骤显著提高了抗体相关ms信号的质量，如lc谱中脱靶峰的数量减少和强度降低所反映的。在lc分析之前快速去除颗粒污染物的能力尤其重要，因为此类颗粒会迅速阻塞lc柱，从而导致压力升高，因此迅速破坏所述lc柱。
[0120]
ms信号质量依赖于靶肽的序列和用于ms数据采集的参数设置，由于ms检测器的固定性质，所述参数设置会影响ms扫描速度、质量分辨率和灵敏度。基质辅助激光解吸电离-飞行时间ms(maldi-tof ms)允许进行快速分析，因为不是首先在lc柱上分离样品。maldi-tof ms对会破坏lc柱的微小颗粒残留不敏感，但不如lc-ms敏感，并且会因污染肽而经受特异性降低。
[0121]
基于lc的靶向ms工作流在ms分析的上游提供了另外的肽分离，这提高了测定特异性。更重要的是，靶向肽离子的最佳mrm跃迁和标准化数据处理和解释算法提供了对所分析的血清样品中的其来源蛋白质的确认。开发了生物标志物特异性方案来优化对这些跃迁的检测以提高检测特异性。
[0122]
通过改变变性缓冲液、添加清理步骤、选择最佳mrm跃迁和更好地解释ms信号，这个工作流在临床样品中示出了提高的灵敏度和特异性
[0123]
使用蛋白质变性缓冲液进行样品预处理
[0124]
将血清样品用变性缓冲液稀释10倍，因为这被确定为用于后续的胰蛋白酶消化和ip的最佳稀释度。标准测定使用与900μl变性缓冲液在1.5ml离心管中混合的100μl血清，然后将所述离心管在100℃加热块中密封并温育5分钟。注意！当将样品从加热块中移出时，建议测定操作者穿戴隔热手套。加工用于样品分析的血清的总体积可以按比例调整，以符合反映到所关注生物标志物的血清浓度范围的测定要求。按比例调整的样品体积应当以1ml
总等分试样在1.5ml离心管中进行加工以确保一致的热传递，如果按比例调整的样品体积在更大的管中进行处理，则热传递会有所不同。例如，在使用200μl血清对mtb抗原cfp10进行血清检测的测定中，针对每个样品制备了两个等分试样。存在于图6a-6c中的示意图描绘了这个工作流的概述。
[0125]
在这个5分钟变性步骤后，将样品转移到25℃branson 2800超声水浴(2.84l)并以40khz超声处理5分钟，然后转移到适合的离心管架以稳定管以用于后续的样品加工步骤。
[0126]
在超声/冷却步骤后，对管进行脉冲离心(scilogex d1008，1,340g和25℃下5秒)以将捕集在所述管的帽中的任何液体旋下，并将20μl 1m三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液(ph 10)添加到1ml变性血清样品以将其ph值调整至约8.5。然后，将这个样品涡旋以充分混合其内容物并再次脉冲离心。
[0127]
蛋白质消化
[0128]
在ph调整后，将变性血清样品与10μg/ml序列级胰蛋白酶混合，放置于上，并以20rpm在37℃下温育16小时。
[0129]
在消化过夜后，通过添加10μl 10％三氟乙酸(tfa)将样品的ph调整至约7，进行涡旋以使可能会在添加tfa后形成的沉淀物的溶液澄清，并且然后如上进行脉冲离心以将存在于管盖中的任何液体旋下。
[0130]
肽特异性抗体与蛋白质g磁珠的结合
[0131]
磁珠和抗体的最佳量在不同的肽靶标间有所不同。对于针对cfp-10肽tdaatlaqeagnfer生成的抗体，将这些参数确定为3mg蛋白质g缀合磁珠和50μgcfp-10肽特异性抗体。磁珠需要用200μl pbs洗涤一次，以去除任何缓冲液残留。将珠和抗体在设置成20rpm的上在400μl结合缓冲液中在25℃下温育1小时。在结合后，将珠用200μl结合缓冲液洗涤2次，以去除未结合的抗体。
[0132]
将抗体缀合珠悬浮于400μl结合缓冲液中，并在储存4℃下持续《2周以便维持抗体活性。
[0133]
靶肽的免疫沉淀(ip)
[0134]
为了从血清中捕获cfp-10肽tdaatlaqeagnfer，将100μl胰蛋白酶消化的血清与0.15mg抗体缀合磁珠在25℃下在设置成20rpm的上混合。在对掺入有设置量的cfp-10蛋白的血清样品进行分析时，通过评估靶肽的ms信号强度，凭经验确定珠/抗体的这种量。在测试临床样品之前，必须通过这种方法确定分析另一种肽所需的珠/抗体的最佳量。
[0135]
珠由两个等分试样组合而成并悬浮于200μl pbs缓冲液中。将珠转移到新的离心管中并用200μl pbs缓冲液洗涤2次，并且然后用100μl lc级水洗涤1次。
[0136]
通过将珠与100μl 1％甲酸在设置成20rpm的上在25℃下温育30分钟来洗脱捕获到的肽。
[0137]
温育后，将含有含捕获珠的洗脱缓冲液的微量离心管转移到稀土磁体，并在25℃下温育20分钟，以允许在转移洗脱液之前完全捕获磁体上的抗原耗竭的珠。
[0138]
通过stagetips清理ip洗脱液
[0139]
将装填c8盘的stagetips通过添加50μl含0.1％tfa的乙腈、然后添加50μl含0.1％tfa的水进行调节。通过将放置于装有适配器的离心管中的吸头在2,000g和25℃下离心3分
钟来去除添加的缓冲液。注意！由于含有stagetips的试管高度发生改变，因此转子盖无法在这个离心步骤期间附接。离心管也必须以有序方式放置到转子中，使得所述离心管将不会接触离心机的内壁。
[0140]
在上文所描述的调节过程后，将stagetips中装载ip洗脱液，并使用与步骤12中相同的条件进行离心。
[0141]
然后，将stagetips中装载50μl含0.1％tfa的乙腈，并按照步骤12进行离心，以允许完全回收靶肽。
[0142]
将stagetip从这些管中去除，并将stagetip洗脱液在真空下蒸发并且然后在1％甲酸中重构。
[0143]
在将重构样品在25℃和21,000g下离心15分钟以去除可能从stagetip过滤器逸出的任何残留颗粒后，将上清液转移到ms样品小瓶中。注意！通过留下1μl溶液来防止接触管底部并拾取任何不可见颗粒。
[0144]
靶向肽的mrm分析
[0145]
为了建立针对靶向肽的lc和ms方法，最好制备所述肽溶液的各种浓度的内部标准品，并基于这些溶液的ms信号获得优化的有机溶剂梯度和碰撞能量。此处使用的有机溶剂梯度和ms参数列出于lc-mrm方法的文档中。
[0146]
在将样品装载到lc柱上后，使用最佳ms方法设置收集ms谱。
[0147]
使用skyline进行ms数据分析
[0148]
mrm数据可以由许多可用的软件工具来处理。基于这些工具的设计，所述这些工具可能需要靶向肽的ms/ms谱作为参考，以便建立用于进行峰识别和评价的谱库。此处推荐skyline作为mrm数据处理的工具，因为其与多个ms仪器兼容。skyline需要靶向cfp-10肽的ms/ms谱来建立库。在此方面，通过lc-ms/ms分析mtb培养滤液的胰蛋白酶消化物，并通过peaks studio针对mtb蛋白质序列数据库搜索ms/ms谱。在搜索后将一个ms/ms谱鉴定为靶cfp-10肽，并将其输入到skyline中。skyline利用所述谱来构建谱库。
[0149]
数据解释的算法开发
[0150]
使用thermo xcalibur软件，可以以过渡方式审查mrm信号(图7a)。然而，所述软件需要进一步评价ms信号质量，以便适当地解释结果。当检查离子色谱法中的峰时，有许多峰是由一些跃迁形成的(图7b)。重要的任务是定义属于靶cfp-10肽(轻肽)的独特峰。由于内标(is)肽(重肽)在ip之前掺入样品中(图6a-6c)，因此可以在所有样品间在明确的保留时间内观察重肽的峰。
[0151]
通过将重is肽的保留时间设置为参考，可以将许多干扰峰直接从ms谱中滤掉。然而，由仪器或化学噪声引起的一些假阳性峰无法通过保留时间滤掉，因为这种噪声跨整个lc梯度随机分布。
[0152]
因此，为了评价靶ms信号的有效性，重要的是评价似乎源自靶肽和其匹配is肽的每个片段的相对强度以及计算轻(血清)肽片段与重(is)肽片段之间的相似性。类似的轻肽信号和重肽信号为靶生物标志物信号的阳性检测提供了更大的置信度。skyline程序返回点积(rdotp)来反映这种相似性，其中等于1的rdtop值表示相同的信号。
[0153]
调整rdotp截止值会使接受者操作特征(roc)曲线的曲线下面积(auc)产生对应的改变，这表示将阳性信号和假阳性信号区分开来的能力。然而，这个分析的准确度在很大程
度上取决于参考方法的准确度，这在结核病诊断中并非众所周知。为了将可能的mtb感染患者与未患有tb的受试者辨别开来，需要更多参数来解释ms信号。从靶肽中观察到的片段的数量和所述片段的强度是有用的指示符。
[0154]
必须将ms谱中的背景噪声的基线从目标峰中减去，以确定这些峰是表示伪影还是表示真实信号。skyline在导出峰面积之前执行这个任务，因此大于零的值可以解释为所述碎片离子的阳性信号。
[0155]
当观察到靶肽的多个片段时，理论上每个片段都可以用作靶向肽离子的替代信号。在将人类蛋白质组设置为背景后，在来自人类蛋白质组的干扰片段较少的片段可能是有效cfp-10肽信号的更具体的指示符的假设下，每个片段都可以通过srm collider进行评价。将离子类型限制为b/y离子并限制在表示mrm-ms仪器最佳分辨率区域的200-1,500m/z范围内。这个分析指示，靶肽中有24个片段适合于进行mrm检测。然而，在实践中，由于不完全碎裂，只能在ms谱中观察到这些离子中的一些离子。
[0156]
如图8a-8c中所示出的，y9是cfp-10肽tdaatlaqeagnfer所产生的最强碎片离子，并且这个离子峰的强度比y13的强度高100倍。一些碎片(例如，y14和y3)未通过峰拾取和评分算法在ms/ms谱上发现。在通过srm collider进行评价后，y9的干扰比y13的干扰多(图8c)。然而，y9的干扰中的大多数干扰的保留时间相距甚远，这意味着其疏水性差异很大并且其可以容易地通过这个分析中使用的纳流lc分离。此外，与干扰肽序列匹配的实例(表3-图表b)中仅有五个实例没有存在于其余七个肽中的氨甲酰基甲基化的半胱氨酸。
[0157]
这个实例指示了经过修改的工作流的优点，因为其省略了标准的还原/烷基化步骤，从而去除了y9的60％的干扰(12个实例中的7个实例)。y9离子是靶cfp-10肽所产生的最强碎片并对所述肽具有高度特异性，并且因此表示最佳诊断碎片。通过使用相同的方法选择另外的产物离子，可以进一步提高cfp-10靶肽的检测特异性。
[0158]
已经开发了一种如何评价mrm跃迁并解释其ms信号的算法，如框1中所示出的。所述算法是基于观察到的mrm跃迁的强度和唯一性以及它们的rdotp值。这种方法指示了用于评价靶肽(例如，cfp-10靶肽)的ms信号是否可以基于根据这种方法得出的其评分而被称为真阳性的明确的基本原理。
[0159]
基于rocc的算法优化
[0160]
使用来自两个临床队列的ms信号的训练集和验证集进一步改进用于数据解释的算法(框1)。
[0161]
表2示出了mtb抗原的mrm跃迁列表。
[0162]
[0163]
[0164]
[0165]
[0166]
[0167]
[0168][0169]
表3：每个跃迁的干扰离子。
[0170]
[0171]
[0172]
[0173]
[0174]
[0175]
[0176][0177]
[0178]
图14呈现了lc-mrm仪器方法。
[0179]
实例3：基于lc-prm-ms的诊断方法和对hiv-1/2p24抗原具有特异性的蛋白质型肽生物标志物
[0180]
人免疫缺陷病毒(hiv)测试和咨询是控制这种病毒必不可少的第一步，但世界卫生组织(who)报告，在全世界，目前感染了hiv的人中仅有约一半清楚其状态。尽管造成这些情形的主要基本原理可能包含与hiv相关的社会经济因素，如贫困、群体关于hiv感染的知识和态度的水平较低以及患者的行为，但是对患有hiv感染的患者，尤其是还感染了结核病(tb)的那些患者的诊断和治疗监测挑战是错过或延误hiv诊断或治疗的主要贡献因素。
[0181]
目前，由于hiv感染的快速诊断测试(rdt)、ab/ag组合测定(elisa)和核酸扩增测试(nat)的可用性，hiv的诊断似乎非常简单。
[0182]
然而，rdt的低灵敏度和特异性仍然是主要关注问题，尽管其对于低资源环境而言是快速的且具有成本效益(每次测试2.0美元)。
[0183]
对于ab/ag组合测定，尽管其与rdt相比灵敏度和特异性更高且对设备和操作者的要求较低，但仍需要通过蛋白质印迹进一步验证结果并在不同的现场环境中对ab/ag组合测定进行广泛的性能评价。此外，由于抗原特异性宿主抗体和免疫球蛋白特异性、类风湿因子样抗体的存在以及靶抗原蛋白的同源物的存在，设计用于测试完整抗原蛋白的ab/ag组合测定会面临如假阳性、假阴性和其它干扰等多种问题。
[0184]
更重要的是，rdt和ab/ag组合测定两者都不适合于婴儿(《18个月)的hiv筛查(由于母体抗体的存在)或抗逆转录病毒治疗(art)监测，因为rdt主要设计用于针对hiv抗体的测试，并且大多数目前可用的ab/ag组合测定仅会给出单个结果并且没有区分阳性结果是由于hiv-1p24抗原的存在还是由于针对hiv-1或-2的抗体的存在而得出的。因此，婴儿的hiv筛查或监测art的标准护理通常是通过基于血浆hiv rna浓度的nat实现的。
[0185]
然而，nat对技术的要求很高，涉及高成本(每次测试160.07美元)、专用基础设施、设备、消耗品和技术专长等问题。此外，大多数针对hiv的市售的hiv naat测试都是单重pcr，这必然会在单个nat测试中遗漏hiv-1和hiv-2两者的检测。此外，基于最佳知识，尚无针对hiv-2的商业nat测试可用。
[0186]
为了解决这些问题，开发了一种用于对hiv-1和hiv-2抗原进行单步骤、快速和定量检测的lc-isprm-ms诊断平台，其灵敏度和特异性多重增强。
[0187]
鉴定出对hiv-1/2p24抗原具有特异性的一组新的蛋白质型肽生物标志物，并且开发了一种用于对hiv-1和hiv-2抗原进行单项测定、快速和定量检测的lc-isprm-ms诊断平台，其灵敏度和特异性多重增强。lc-isprm-ms不仅可以直接从包含从人类获得的血清、血浆或全血在内的临床样品中灵敏地且特异性地鉴定和测量病原体负荷，而且还可以提供基于肽序列对hiv-1或hiv-2感染进行的一步骤确认和鉴别，并且进一步允许评估感染了hiv-1或hiv-2的患者的治疗应答。检测方法包含但不限于质谱法、色谱法、电化学和化学传感器、电泳、免疫化学技术、纳米技术和微细加工以及试纸护理点测定。
[0188]
血清/血浆的预处理
[0189]
将血清样品(50μl)中添加450μl病毒裂解缓冲液(0.4％tritonx-100，含0.2％sds的pbs，ph＝7.4)，在100℃下加热5分钟，然后将温度冷却至室温。添加10μl 1m tris。
[0190]
用10μg(25μl)序列级胰蛋白酶(序列级修饰的；普洛麦格公司(promega)；如果出
现聚集，则可能需要更多的胰蛋白酶(40-50μg))进行微波消解(p4级微波功率，6
×
5分钟)，然后在37℃下持续1小时。
[0191]
蛋白质g-dynabeads偶联
[0192]
制备蛋白质g将重悬于小瓶中(涡旋》30秒或倾斜并旋转5分钟)。将100μl(3mg)转移到管。将管放置于磁体上以将珠与溶液分离并去除上清液。将珠用400μl含有0.2％的pbs洗涤一次，并将上清液从珠去除。
[0193]
抗体的结合：将用400μl含有0.2％的pbs稀释的单克隆hiv-1/2抗体(ab)(50μg)从上方添加到在室温下旋转温育1小时。将管放置于磁体上，并将珠用400μl含有的pbs洗涤两次。将管从磁体去除，并将珠-ab复合物重悬于400μl含有的pbs中。通过轻轻移液进行洗涤。
[0194]
免疫沉淀靶抗原
[0195]
在添加tfa至最终浓度为0.1％(5μl)后，将经过消化的血清样品中掺入1.0μl 50nmol/l稳定同位素标记的内标肽。向每个血清样品中加添加25μl hiv-1/2抗体缀合珠。对于每个样品，抗体为50/16＝3.1ug，并且珠为3/16＝0.1875mg。在室温下旋转温育1小时。将管放置于磁体上并去除上清液。将珠-ab复合物用400ul pbs洗涤2次，并用100μl lc级水洗涤一次。将管放置于磁体上并去除上清液。添加20μl洗脱缓冲液(1％甲酸)，并在hulamixer处在室温下温育15分钟。将管放置在磁体上，将含有经过洗脱的ab和ag的上清液转移到eppendorf lobind管。将16μl上清液转移到样品小瓶以进行lc-ms分析(15μl注射)。
[0196]
lc-prm-ms分析
[0197]
将洗脱液装载在c18捕集柱上，洗脱到c18分析柱上，并用0.3微升/分钟的乙腈/甲酸梯度(5
–
40％)进行分馏，并且然后在与orbitrap fusion
tm
lumos
tm
tribrid
tm
质谱仪(赛默飞世尔科技公司)耦合的nano-lc ultimate 3000高效液相色谱法(hplc)系统上使用prm模式进行分析。使用skyline软件版本4.1.0.18169(maccoss实验室软件(maccoss lab software))来针对使用重组p24和cfp-10消化物产生的库分析血清ms和ms/ms谱。
[0198]
实例4：hiv肽比对
[0199]
图15示出了产生了仅三个与这个序列的生物信息学分析所提供的那些峰相匹配的主峰(表4)的重组p24的胰蛋白酶消化物的质谱图。
[0200]
表4：skyline分析所提供的p24胰蛋白酶肽的[m+h]
+
值的列表
[0201][0202]
肽id是基于其在p24 aa序列中出现的顺序分配的。在将uniprotkb病毒数据库(2020年1月)中所有经过审查的p24 gag条目对比之后，鉴定出hiv-1m分组病毒的p24序列中的可变aa位置。
[0203]
对在uniprotkb数据库中发现的其条目已经过审查的所有hiv p24序列都进行了比对，并且鉴定出在所有这些p24条目的经过比对的序列间完全保守的两个肽区域
(gsdiagtts和qgpkepfrdyvdrf)。另外，还获得了具有匹配胰蛋白酶峰的所有三个skyline条目的比对。
[0204]
用两个完全保守的肽对uniprotkb数据库进行搜索给出了对含有这个区域的uniprotkb hiv-1条目的总数的估计(表5：约60,000个)，所述条目随后用于估计靶肽的氨基酸变体在具有对应的序列的所有hiv-1p24条目间的相对频率。
[0205]
表5：对uniprokb数据库中含有靶肽区域的hiv-1gag序列条目的估计。
[0206][0207]
对uniprotkb病毒数据库(2020年1月)中的所有经过审查的hiv-1p24条目的比对鉴定出与在所有hiv-1p24条目间完全保守的靶肽相邻的两个aa序列区域：gsdiagtts和qgpkepfrdyvdrf。执行对uniprotkb病毒数据库的肽搜索以鉴定与这些序列匹配的条目数，并且从对hiv-1p24条目的估计中排除没有hiv-1标识符的条目。
[0208]
表6描绘了所有三种靶肽根据其物种、分组、亚型和病毒分离株进行的比对，其中这些分组之间的进化关系如图16中所示。值得注意的是，估计分组m占》90％的hiv/aids病例，图17中示出了单独的hiv-1分组的贡献的细分。
[0209]
表6：uniprokb病毒数据库中发现的经过审查的hiv-1/2p24和siv p247序列中的肽1、肽2和肽3的比对。
[0210][0211][0212]
除了一个靶肽邻接另一个靶肽(肽1和肽2)的地方外，靶肽呈现出侧翼序列的五个aa。针对每个分离株示出单个条目。高亮指示每个靶肽中的高度保守(绿色)和可变(黄色)
aa。破折号指示为促进aa序列比对而引入的空格。
[0213]
表6指示肽1(etineeaaewdr)在所有hiv-1分组之间高度保守，除了分组m序列分离株中的一个分离株[hiv-1m:a(mal)]之外的所有分离株在单个残基(位置1)处都发生变异，其中两个变体位置由保守d到e取代组成。包含同一位置处的变体的另外的变体存在于单独的分组n和o分离株中，但这些较小的hiv-1分组很少见并且仅限于非常有限的地理区域。
[0214]
肽2(vhpvhagpiapgqmr)含有扩散其整个长度的多个氨基酸变异位点，并且即使在分组m亚型内也展示出显著变异。需要多种抗体来捕获这个肽的所有变体，这使其成为较差的生物标志物靶标。
[0215]
由于可变氨基酸取代去除了分离这两种肽所需的r残基，因此在hiv-2或siv中不会产生肽1和肽2。针对肽1而不是肽2产生的抗体可以能够捕获这种融合肽，但其应该会展示出显著不同的洗脱曲线并且与来自任何hiv-1分组和亚型的肽1分离株相比具有更高的质荷比。
[0216]
肽3(mysptsildir)不如肽1保守，但其大部分氨基酸变异限于两个位置(残基5和11)。除了hiv-1分组m亚型b之外，大多数hiv-1分组和亚型在肽3的第5位处具有v残基，而残基11处的保守k或r变异在不同分组m亚型之间几乎均分。
[0217]
肽1抗体是使用etineeaaewdr作为免疫原产生的，并且所述抗体也有效地检测到dtineeaaewdr肽。这似乎是一个安全选择，具体地因为仅有的其它变异更为少见并且也是保守e到d取代。这两种变体一起占存在于uniprotkb数据库中的所有hiv-1p24序列的96.8％，这意味着应该能够检测来自大多数分组和亚型的p24肽，尽管这个分析可能会因为已保藏序列可能无法准确地表示hiv-1p24序列变异的全球分布而有选择偏差。
[0218]
肽3抗体是使用mysptsildir作为免疫原产生的，并且这些抗体有效地检测到myspvsildik肽，尽管未对其与其它分组m亚型b序列变体中的任何变体的性能进行检查。由于分组m亚型b中的在这个位置处的序列变异，这些抗体对这些变体中的一些变体的亲和力可能会降低。分析指示，93.1％的uniprotkb hiv-1p24条目揭示了这个位置处的序列mysp[t/v]sildi[k/r]，因此即使针对mysptsildir产生的单克隆抗体未能灵敏地结合肽3的占这个肽的变异的另外4％的myspssildi[k/r]和myspssildi[k/r]变体，也应该具有合理的变异覆盖率。然而，对于已经通过目前的多克隆抗体识别的氨基酸变体，这两种取代都可以被认为是保守的，因为每个取代都是单个氢化碳官能团的获得或丢失(t到s，末端丢失；v到i，内部获得)。
[0219]
表7：对uniprokb数据hiv-1gag序列中的特定的肽1变体的频率的估计。
[0220][0221]
实例5：通过快速亲和力富集质谱法测定对hiv-1和结核分枝杆菌感染进行多重血清检测
[0222]
摘要
[0223]
hiv和结核分枝杆菌(mtb)的共感染显著造成这些疾病的全球发病率和死亡率。提高早期诊断率和监测患有两种感染的个体的治疗应答对于改善患者结果至关重要。存在针对每种病原体的基于pcr的测试，但所述测试具有阻碍所述测试在联合筛查方法中的应用的局限性，特别是因为美国食品和药物管理局(united states food and drug administration)批准的唯一测定仅被批准用于痰样本。这点显著限制所述测试在共感染了hiv和mtb(hiv/mtb病例)的患者中的诊断应用，所述患者经常产生mtb丰度较低的痰样本。在本文中，描述了一种直接定量hiv-1p24和mtb培养过滤蛋白10(cfp-10)的单肽水平以评价每种病原体的全身性负荷和其对治疗的应答的诊断测定的开发。来自病例对照者研究的结果发现，对患者血液样本中的p24和cfp-10靶肽进行实时多重定量对早期hiv和mtb诊断以及评估患者对抗mtb和抗逆转录病毒疗法的应答具有重要意义，从而指示这个方法可以提供可以促进mtb和hiv预防、诊断、治疗和护理服务的联系以改进患者结果的临床信息。
[0224]
介绍
[0225]
hiv流行病对全球tb控制工作提出了重大挑战，因为艾滋病毒携带者(plhiv)发展为tb的风险提高了20到30倍，这是这一群体发病和死亡的主要原因[1]。plhiv占2016年间估计的1040万新增tb病例中的1.2，并且占170万tb死亡中的0.4[1]。提高plhiv中的tb测试率和tb患者中的hiv测试率是通过提高早期治疗率来降低hiv/tb共感染患病率以改进患者结果的关键步骤。世界卫生组织(who)的2013年全球结核病报告建议在与hiv筛查和治疗相关的初级保健探访期间进行tb定期筛查[2]。这需要解决以下这一发现：plhiv中近60％的tb病例没有得到诊断或治疗，从而导致过多的发病和死亡[1]。类似地，用于遏制tb的遏制tb伙伴关系全球计划的目标是：到2015年，患有tb的所有患者都应针对hiv进行测试[3]。然而，2016年，新增和复发的全球tb病例中仅有57％具有文件记录的hiv测试。[1]。
[0226]
造成这种诊断差距的主要原因可能包含与hiv/tb相关的社会经济因素，包含贫困、关于hiv/tb感染的知识不足且态度不好以及患者不良行为[4]。然而，患有hiv相关tb(hiv/tb)的患者通常会使其tb和hiv在单独的程序中接受管理，为每种疾病提供治疗，但不协调这些疗法方案。这种协调缺乏可能是错过或延迟hiv和/或tb诊断和治疗的重要因素，从而导致可预防的发病和死亡。who政策强调需要建立例如在同一时间和位置提供整合的tb服务和hiv服务的机制[5]。据信，强化plhiv中的tb病例发现以及向假定和诊断的tb病例的患者提供hiv测试和咨询是减轻处于发展为这两种疾病或受这两种疾病影响的风险中的群体中的tb/hiv负荷的关键要求[6]。
[0227]
使这种情形进一步复杂化的是plhiv中的tb诊断提出了重大挑战，因为患有tb的plhiv中经常具有“亚临床”tb病例，这些病例通常不被认为是tb，从而延误了这些病例的tb诊断和治疗。基于痰的tb诊断，包含抗酸杆菌(afb)涂片、mtb培养和mtb/rif，表现出与经常与hiv/tb病例相关的少菌(低杆状细菌浓度)样品的灵敏度降低[7、8]。因此，允许对hiv/tb感染进行灵敏度和特异性诊断的新方法将会解决改进hiv-1和tb疾病的整合管理的尚未满足的迫切需求。
[0228]
对血清或血浆中的病原体特异性蛋白质进行检测和定量提供了感染的直接证据并且还可以反映病原体负荷，并且因此可以用于诊断感染和监测其对治疗的应答。然而，针对此类生物标志物的常规免疫测定面临着混杂问题。例如，与包含抗体的循环因子的相互作用可能会显着降低免疫测定的灵敏度，而对来自相关病原体(如非结核分枝杆菌(ntm))
的同源物的脱靶识别可能会降低测定的特异性。
[0229]
测量蛋白质型生物标志物肽的测定可以避免这些问题，因为产生这些肽所需的消化步骤会破坏蛋白质-蛋白质相互作用，而释放的生物标志物肽通常可以区分高度相似的蛋白质和其同种型。先前已经报告了，通过质谱法(ms)对患者血浆或血清中的mtb源性肽进行检测可以在存在或不存在hiv共感染的情况下以高灵敏度和特异性诊断活动性肺和肺外tb病例[9、10]。在当前的研究中，开发了一种液相色谱法(lc)ms方法，其可以在单个ms谱中检测和定量衍生自mtb毒力因子培养滤液蛋白10(cfp-10)和hiv-1衣壳蛋白p24的肽以用于快速诊断和实时治疗监测hiv-1/tb共感染。在这个方法中，通过免疫沉淀分析来自胰蛋白酶消化的血浆或血清样品的靶cfp-10和p24肽，随后进行允许对hiv-1和mtb特异性肽进行快速定量的lc-isprm-ms方法中的计划平行反应监测(isprm)。这个测定方法含有可以提高生物标志物检测的灵敏度和特异性的多种特征(图18)。由这个测定提供的对mtb和hiv-1感染的同时和定量监测可以为诊断和管理患有免疫重建炎性综合征(iris)的患者提供新的可能性并且促进对iris与tb治疗失败的区分。
[0230]
因为cfp-10是由毒性mtb菌株活性分泌的，可在感染后不久检测到，会减弱mtb清除率，并且可以容易地在成人的用于活动性tb诊断的血浆和血清中检测到，因此选择其作为活动性tb的生物标志物[11]。因为p24的检测已经示出对以下具有价值，因此选择其作为hiv-1感染的生物标志物：(i)诊断早期hiv-1感染；(ii)筛查血液以鉴定来自hiv感染供体的样品；(iii)诊断新生儿的hiv感染；以及(iv)监测抗逆转录病毒疗法(art)功效，条件是p24水平是以足够的灵敏度和准确度测量的[12]。
[0231]
先前已经鉴定和验证可以鉴定和定量存在于用于tb诊断的患者血清和血浆样品中的cfp-10的肽[9、10]。用于hiv-1诊断的蛋白质型p24肽是通过将重组hiv-1p24的胰蛋白酶消化物经受基质辅助激光解吸/电离飞行时间ms和lc电喷雾电离串联ms分析来鉴定的。在这个分析中检测到的肽etineeaaewer(m/z 1462.83)和mysptsildir(m/z1295.43)展示出信噪比》125，并且在与hiv-1和hiv-2的p24蛋白质序列比对时表现出hiv-1特异性(图21-23)。总的来说，这些多肽和其变体dtineeaaewer和myspvsildir与》95％的经过分析的hiv-1菌株的p24序列匹配，但与hiv-2p24序列不匹配。针对etineeaaewer和mysptsildir产生的抗体也有效地结合dtineeaaewer和myspvsildir(图24和未示出)。
[0232]
为了评价lc-isprm-ms定量人类血清中的p24和cfp-10的能力，将来自健康受试者的合并血清中掺入重组p24和cfp-10蛋白，进行胰蛋白酶消化，并将其中掺入与靶p24和cfp-10肽的序列相匹配的稳定同位素标记的内标(is)肽，之后通过lc-isprm-ms以高灵敏度对靶肽和is肽两者进行免疫富集和定量。由于多个水平的lc-isprm-ms数据确认，以高特异性检测所有肽：靶肽和内标肽的保留时间、质荷(m/z)比、ms/ms谱(图18b)。通过绘制掺入已知量的p24和cfp-10的血清样品中的靶肽和其对应的is的ms峰强度的比率而生成的标准曲线表现出与输入蛋白质的量(图18b)的强线性相关性(r2》0.99)和可再现性(批内变异系数14-22％和批间变异系数16-23％)。在这个分析中，p24 etineeaaewer肽和cfp-10tdaatlaqeagnfer肽展示出分别为0.1pm和0.5pm的检测极限(lod)和定量极限(loq)，而p24 mysptsildir肽表现出1.0pm的lod和2.5pm的loq。
[0233]
接下来评价了这个测定诊断纳入休斯顿结核病倡议(houston tuberculosis initiative，hti)中的成人队列(31名hiv+个体和25名hiv-个体)的hiv-1感染的能力，所述
休斯顿结核病倡议是一项大型、基于群体的tb监视研究。这个测定也应用于诊断纳入国际孕产妇青少年aids临床试验(international maternal pediatric adolescent aids clinical trials，impaact)p1041试验中的婴儿组(16名hiv
+
和10名hiv-)的hiv，所述国际孕产妇青少年aids临床试验是在南非推出组合抗逆转录病毒疗法(art)期间从2004年至2008年纳入的婴儿间进行的tb预防试验(表8)。
[0234]
表8：用于诊断hiv-1的研究参与者的人口统计学和临床特性
[0235][0236]
数据；数量。(％或iqr)
[0237]
iqr四分位距；n/a不可用。
[0238]a对应列群体的百分比或四分位距。
[0239]
b cd4细胞计数仅可用于hiv-1阳性受试者。
[0240]c对照与hiv-1病例之间的差异的学生t检验、曼-惠特尼u检验或卡方检验的p值。
[0241]
通过分析12份已确认的hiv-2抗体阳性血浆样品对这个测定对诊断hiv-1感染的特异性进行了评估，所述血浆样品是从seracare生命科学公司(seracare life sciences inc.)(美国马萨诸塞州米尔福德(milford,ma,usa))购买的。lc-isprm-ms揭示了对hti成人(90.3％；95％ci：74.25-97.96％)和p1041婴儿(87.5％；61.65-98.45％)的hiv-1病例的诊断灵敏度相似并且两个群体的特异性均为100％(图19a和表10)，其将可用于诊断通常会由于在生命的第一年期间母体hiv抗体的存在而难以使用基于抗体的测定进行诊断的婴儿hiv-1病例[13、14]。在经过测试的hiv-2样品中未发现假阳性，从而证实了这个测定对诊断hiv-1感染的特异性。
[0242]
表10：lc-isprm-ms检测hiv-1的的灵敏度和特异性
[0243][0244]
通过p24测定准确诊断急性hiv-1感染取决于其灵敏检测由不同hiv-1菌株表达的p24序列变体的能力。若干因素(例如，测试方法、个体应答和病毒特性)影响病毒暴露与对血清样品中的hiv rna、hiv抗原或抗hiv抗体的最早可靠检测之间的间隔。为了评价针对早期hiv诊断的lc-isprm-ms性能，对在两名患者的hiv-1测试呈阳性之前和之后从所述两名患者获得的血清样品进行了分析，并且发现在每种情况下，lc-isprm-ms在早于p24免疫测
定的至少一个时间点检测到p24表达(图19b)。lc-isprm-ms检测到9个hiv
+
样本中的8个样本(88.9％灵敏度)对通过p24 elisa检测到的5到6个样品，这指示55.6％到66.7％灵敏度范围。lc-isprm-ms分别比innogenetics公司和珀金埃尔默公司联盟(innogenetics and perkin elmer alliance)elisa早一个样品和比库尔特公司(coulter)或艾博特公司(abbot)elisa早一个和两个样品检测到血清p24表达。值得注意的是，这项研究中分析的prb954样品跨越了早期血清转化间隔，因为在这名患者的前三个样品中未检测到病毒rna，并且lc-isprm-ms在具有可检测hiv rna的4个血清样品中的3个样品中检测到p24表达。
[0245]
定期监测接受抗逆转录病毒疗法的患者对于确保持续的病毒抑制以及在治疗失败的情况下尽可能早的检测到抗药性菌株的出现至关重要。病毒载量测定被普遍推荐用于这个目的，并且虽然血清p24定量可以应用于hiv预后和治疗监测[8]，但是尚不清楚其能否为监测hiv治疗应答提供有用的数据。因此，分析了p1041队列中的hiv-1
+
婴儿在art疗法之前和之后以及长期随访期间的连续血液样品，并且发现血清p24水平与病毒载量之间存在良好的对应关系，并且发现在经过art治疗和未经治疗的受试者中，这些因素分别并行地呈减少和增加趋势(图19c)。lc-isprm-ms还鉴定出一名经过治疗的患者的art失败(图19c#5)，所述患者证明了p24在art期间随着hiv病毒载量的升高而增加，并且在hiv疗法修改后p24水平和病毒载量均对应地下降。正在进行更大的纵向队列研究以评估抗原水平的早期改变如何对应于患者症状和治疗结果的改变。
[0246]
who建议针对共感染tb和hiv的患者进行临床服务整合，因为这种方法似乎与抗tb治疗期间的较低死亡率相关，即使是在次优患者部分启动art并完成抗tb治疗的环境中[5]。为了为lc-isprm-ms的临床效用提供原理验证的证据，使用阳性p24或cfp-10信号作为用于hiv或tb感染的诊断标准对来自患有hiv-1、tb或组合的hiv和tb感染的患者的血清进行了分析。这个病例对照者研究(表9)分析了来自1名仅感染了hiv-1的患者、4名仅感染了mtb的患者、7名共感染hiv-1和mtb的患者以及8名没有感染hiv-1或mtb的对照受试者的血清。
[0247]
表9：按tb和hiv状态分层的研究群体的特性
[0248][0249]
数据；数量(％或iqr)
[0250]
iqr四分位距；afb抗酸杆菌
[0251]a对应列群体的百分比或四分位距。
[0252]
lc-isprm-ms测定分别在11个tb病例中的9个病例(81.8％)和8个hiv-1病例中的7个病例(87.5％)的血清样品中检测到cfp-10和p24靶肽(图20a和表11)。
[0253]
表11：lc-isprm-ms对活动性tb和hiv-1的灵敏度和特异性
[0254][0255]a非tb对照是来自被判断未患有活动性tb但患上tb的风险较高的患者的受试者。
[0256]
在任何hiv-受试者中都未检测到p24信号(100％特异性)，但是在9名被判断未患有活动性tb的处于风险中的受试者中的1名受试者中检测到明显的假阳性cfp-10信号(88.9％特异性)。针对tb的这种程度的诊断灵敏度优于类似的hiv/tb群体中的针对afb涂片(31％)、分枝杆菌生长指示管(mgit)培养物(69％)和mtb/rif(66％)所报告的灵敏度值[15、16]，并超过了who建议的新的高优先级非痰诊断测试的最佳灵敏度(66％)[17]。who指南建议使用mtb/rif作为疑似患有tb的hiv
+
患者的初步诊断，但是在hiv
+
群体中流行的afb涂片呈阴性且mtb培养呈阴性的tb病例中，这种测试的灵敏度降低[18]。hiv+涂片呈阴性/培养物呈阳性的tb病例中的lc-isprm-ms灵敏度(85.7％；70.5
–
95.3)也超过了其它hiv+成人队列中所报告的灵敏度(47.3％；29.2-67.0到61.1％；35.7-82.7)[19]。然而，由于这项研究的样品大小较小，因此在得出关于lc-isprm-ms在这个群体中的性能的任何最终结论时必须慎之又慎。
[0257]
lc-isprm-ms测定还设计用于定量血清或血浆中的hiv-1和tb抗原以监测对抗tb疗法或art的应答。这种能力对于tb疗法特别有用，考虑到用于监测抗tb治疗应答的大多数测定都提供半定量结果(afb涂片和)或具有显著潜伏期(mtb培养)。在抗tb疗法和/或art期间实时监测血清中的hiv-1和mtb抗原可以反映出治疗功效，这可以区分出由于由药物毒性或iris引起的抗药性感染导致的治疗失败。为了评价lc-isprm-ms实时监测cfp-10和p24抗原水平的性能，对来自p1041队列中的hiv-1呈阳性的婴儿的系列血液样品进行了分析，所述婴儿如果被诊断为tb，则正在接受art治疗和抗tb疗法。结果示出，lc-isprm-ms可以成功地实时监测cfp-10和p24水平，并且为tb和hiv诊断以及抗tb或art治疗应答的评估提供有用的信息(图20b和图25)。例如，在完成抗tb治疗后，患者的cfp-10信号从阳性转为阴性可能反映成功的抗tb应答(图20b#1)。类似地，在art启动后，患者#2中的p24水平示出了持续下降，并且病毒载量对应地下降，这也可能表示art的阳性应答(图20b#2)。相比之下，完成抗tb疗法后高cfp-10或p24水平可能分别表示tb或hiv的治疗失败。例如，即使在患者#6和#9进行了9-14个月的抗tb疗法后，cfp-10信号仍然非常高，这可能表示两个无应答病例。实际上，发现患者#6的hiv病毒载量非常高(》1000,000个拷贝)，但是其没有接受art治疗(图20b#6)，而患者#9的hiv病毒反弹至非常高(750,000个拷贝)，即使其接受了art(图25#9)。另一方面，在若干病例中(图20b#1、4、6)，在tb诊断之前或之后不久检测到阳性cfp-10信号，这指示这种方法对于tb感染的早期检测也可能是有用的。
[0258]
有趣的是，当将血清cfp-10信号与p24水平或hiv病毒载量相关联时，lc-isprm-ms可以鉴定出tb-iris病例。例如，发现患者#3和#4的cfp-10水平在art治疗启动之后不久即
提高，即使其hiv病毒似乎由于表现出无法检测的p24抗原或hiv病毒载量而受到控制(图20b#3、4)。尽管如此，这项原理验证研究并非设计用于测量下降速率或允许与其它方法进行比较。未来需要频繁采样的前瞻性纵向研究来确定hiv-1p24和mtb cfp-10血清/血浆改变如何与患者表型和治疗结果相对应。进而，这些研究应为患有iris的患者的诊断和管理开辟新的可能性，并且促进将iris与tb治疗失败区分开来。
[0259]
在这项研究中，对来自患者血液样品的p24和cfp-10靶肽的实时和多重lc-isprm-ms定量对早期hiv和tb诊断以及评估患者对抗tb和抗逆转录病毒疗法的应答具有重要意义。这些发现表明，这种方法可以提供可以促进tb与hiv预防、诊断、治疗和护理服务的联系以改进患者结果的临床信息。尽管如此，仍需要进一步减少操作者时间和测定成本以及提高仪器便携性以满足针对最佳无创tb测定的who指南。
[0260]
材料与方法
[0261]
商业血浆和血清样品
[0262]
已经确认的hiv-2抗体阳性血浆样品(9227022、9250494、9227024、10234820、10266767、10276442、10266768、10279915、9226992、10296579、10231111和10266760)从seracare生命科学公司(美国马萨诸塞州米尔福德)购入，以及hiv-1血清转化小组prb955和prb954，其包含在hiv-1诊断之前以及对持续hiv-1感染的整个免疫应答中抽取的样品。
[0263]
临床样品
[0264]
在这项研究中作为成人病例和对照样品的来源的hti队列是一项大型、基于群体的tb监视研究，其对1995年与2004年之间德克萨斯州休斯顿/哈里斯县的所有确诊tb病例进行了主动监视。由于其任务是收集所有活动性tb病例，hti对来自各种tb疾病表现的样品进行了存档，包含具有阳性培养结果和阴性培养结果两者的hiv阴性和阳性肺和肺外tb病例。血清样品获自被告知了参与研究的风险并且提供了书面知情同意书的hti受试者。人口统计学、微生物学和诊断数据总结于(表8)中。
[0265]
这项研究中使用的婴儿样品是从impaact p1041队列收集的血清样品的一部分，所述队列是一项对于健康的、卡介苗(bcg)疫苗接种的、3到4个月大的婴儿的初级异烟肼(inh)预防进行评价的多中心、ii-iii期、随机、双盲、安慰剂对照试验。p1041纳入了804名hiv暴露、未感染的婴儿和547名hiv感染的婴儿，对这些婴儿进行了多达4年的随访。对于所有婴儿，前两年的计划访视是每季度一次，但在第3-4年，针对那些hiv暴露、未感染的婴儿减少到每6个月一次。
[0266]
血清/血浆的预处理
[0267]
在临床hiv样品中，p24抗原存在于完整的全hiv病毒内并且在病毒裂解后游离于溶液中。然而，除了血清转化后免疫复合物的形成之外，分析物的可用性还受到低病毒滴度的限制。因此，为了破坏由于母体抗体引起的免疫复合物以进一步改进胰蛋白酶消化，采用了通过将样品加热至100℃持续5分钟来使免疫复合抗体以及病毒颗粒变性的热破坏预处理步骤。在允许样品冷却至室温(25℃)后，p24抗原可用于进行检测。凭经验对一系列稀释于磷酸盐缓冲盐水中的洗涤剂进行了测试，所述一系列洗涤剂促进将血浆加热到变性条件，同时防止形成胶化样品。当血浆样品以1:3稀释于热休克缓冲液(0.4％tritonx-100，含0.2％sds的pbs，ph＝7.4)中时，所选择的由sds和np-40组成的缓冲液在允许热尖峰方面强劲。
[0268]
lc-isprm-ms分析
[0269]
将针对hiv-1和mtb cfp-10靶肽产生的100μg多克隆抗体(吉尔生化公司(gl biochem))分别如制造商的说明书中所描述的与10mgm-270epoxy(赛默飞世尔科技公司)偶联。最终珠浓度为10mg/ml抗体偶联珠，并将其储存在2℃到8℃下直至使用为止。将血清样品(100μl)用300μl热休克缓冲液稀释，并且在100℃下温育5分钟。在样品冷却至室温(25℃)之后，将样品用1100μl 100mm碳酸氢铵稀释，然后进行微波消解[15]，将其中掺入300pmol/l稳定同位素标记的内标肽(hiv-1的m/z为1472或1305并且mtb的m/z为1603.60；genscript)，所述稳定同位素标记的内标肽分别与p24和cfp-10靶肽序列相匹配(hiv-1的m/z为1462或1295并且mtb的m/z为1593.75)，并且将所述样品在室温下与30μl制备的抗1462/1295和抗1593抗体标记的珠缓和持续1小时。然后，将珠用pbs/0.05％tween-20洗涤并用1％甲酸(ph《2.0)温育以洗脱结合的肽。将洗脱液装载在c18捕集柱上，洗脱到c18分析柱上，并用0.3微升/分钟的乙腈/甲酸梯度(5
–
40％)进行分馏，并且然后在与orbitrap fusion
tm
lumos
tm
tribrid
tm
质谱仪(赛默飞世尔科技公司)耦合的nano-lc ultimate 3000高效液相色谱法(hplc)系统上使用prm模式进行分析。使用skyline软件版本4.1.0.18169(maccoss实验室软件)来针对使用重组p24和cfp-10消化物产生的库分析血清ms和ms/ms谱。标准曲线是通过将健康供体血清中掺入0-400pmol/l重组p24或cfp-10并将实验样品ms强度比通过代入这些校准曲线而转换成绝对摩尔浓度来生成的。检测极限(lod)和定量极限(loq)分别由每个空白的均值加上其噪声的标准偏差的三倍或十倍得出。
[0270]
统计分析
[0271]
使用graphpad prism软件(版本7.01)进行中位数、四分位距(iqr)、灵敏度和特异性、数据正态性、方差分析(anova)及检验后校正(邓尼特检验(dunn's test))、曼-惠特尼(mann-whitney)和卡方(chi-square)检验的计算。
[0272]
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[0287]
15.世界卫生组织(2013)政策更新：用于诊断成人和儿童肺和肺外tb的xpert mtb/rif测定(world health organization(2013)policy update:xpert mtb/rif assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary tb in adults and children).(日内瓦的who(who,geneva))。
[0288]
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[0292]
实例6：tb检测方案和tb诊断试剂盒的附加价值/改进
[0293]
使用所需的患者血浆/血清体积的一半(100ul而不是200ul)，这使需要从患者收集的体积最小化并且通过具有足够的材料用于重复测定来促进样品结果确认。
[0294]
使用固定化tpck胰蛋白酶代替测序级胰蛋白酶，这会附加多个价值(图26)，其包含：
[0295]
(i)降低样品成本(0.4美元/样品对测序级的20美元/样品)
[0296]
(ii)通过允许高通量加工的自动操作来加速过程
[0297]
将样品消解时间从过夜缩短至两小时。
[0298]
使用来自不同制造商和具有不同大小(1微米和2.8微米)的各种磁性纳米颗粒不仅示出了经过优化的方案的多功能性和适用性(图27)，而且还为高通量自动操作提供了平台并且确保了诊断试剂盒和体外方案中最有价值项之一的供应链和资源的安全。
[0299]
通过在免疫沉淀步骤中省略不需要的步骤和材料如10％tfa来简化方案。
[0300]
通过使用75％乙腈/25％pbs处理30秒的简单步骤去除非特异性结合来提高纯度(图28)。
[0301]
用至少两种不同的g蛋白质磁珠平台实现了对复杂的生物血清/血浆样品中的病原体靶肽1593的约为0.8pg/ml的显著低的检测极限(lod)(图29)。
[0302]
使用顶级超灵敏thermo tsq altis四极杆质谱仪使用纳流来验证方案，这允许检测低至靶肽1953的亚皮摩尔的浓度(图30)。
[0303]
本发明可以在多个质谱法平台上使用。非限制性实例包含thermo tso altis、waters xevotq-xs和sciex 6500+。例如，使用来自其它两家制造商waters xevo tq-xs和sciex 6500+的超灵敏四极杆质谱仪进行分析验证可以用于示出本文所描述的方案的多功
能性和适用性。
[0304]
多个制造商正在使用纳流和微流平台将每个样品的lcms分析时间从35分钟缩短到10分钟或更短。
[0305]
已经根据一个或多个优选实施例描述了本发明，并且应当理解，除了明确陈述的那些等同物、替代物、变化和修改之外，许多等同物、替代物、变化和修改是可能的并且在本发明的范围内。
[0306]
实例7：skyline数据库中的靶向肽的谱库所鉴定的谱的选择过程。
[0307]
1.基于预测离子所具有的干扰数量从最少到最多对所述离子进行排序。
[0308]
2.基于离子在ms谱中的相对丰度从最高到最低对所述离子进行排序。
[0309]
3.使用其合成版本获得肽靶标的产物离子扫描谱(ms2是可能的谱，但使用三重四极杆仪器而不是轨道阱或离子阱)。使用skyline软件通过将其与库谱进行比较并调整用于计算的离子来计算谱的相似性评分rdotp。
[0310]
4.选择丰度最高的离子，如果两个离子的丰度相同，则将保留干扰较少的离子。
[0311]
5.确定实现最高rdotp的最终跃迁组合。
[0312]
在不希望受到理论束缚的情况下，在图10中，使用基于机器学习的算法来辅助对mrm跃迁的选择。最初，这个算法用于确定阳性结果，但其也可以用于mrm跃迁选择。