网织红细胞模拟粒子、血小板模拟粒子制备方法及质控物与流程
本申请是申请日为2017年01月19日、申请号为201780081863.8、发明名称为“网织红细胞模拟粒子、血小板模拟粒子制备方法及质控物”的分案申请。
本申请涉及血液质控物领域，特别是涉及一种网织红细胞模拟粒子制备方法、血小板模拟粒子制备方法，以及包含所制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子的质控物。
背景技术：
网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，是反映骨髓红系造血功能以及判断贫血和相关疾病疗效的重要指标，对血液病的诊断和治疗反应观察均有重要意义。网织红细胞相关参数是中、高端血细胞分析仪提供的一项重要信息。血液质控物是一种含有单一或多组分血细胞或血细胞模拟物的液体，具备如同血液一样的可检测特性，用于日常监控血液分析仪的准确性和精确性。网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子就是血液质控物中分别模拟网织红细胞和血小板的血细胞模拟物。
网织红细胞模拟粒子存在多种制备方法，方法一：通过渗透压的变化使红细胞的胞膜膨胀，产生小孔，然后将核酸注入胞内，模拟网织红细胞的形态；该制备方法对工艺要求高，工艺操作难度大，量产效率较低，并且，细胞经过了涨缩，其膜强度降低。方法二：通过富集提纯贫血动物，如：猪，的血液中网织红细胞，固定剂处理实现粒子稳定性，该制备方法网织红细胞提纯难度大，动物血原材料成本较高，且粒子体积参数无法有效模拟人网织红细胞分布。方法三：通过氧化外源核酸，形成醛基与人红细胞膜表面交联，实现粒子荧光信号模拟，该方法的工艺步骤过多，反应条件复杂不可控，降低了工艺实用性及可控性。
血小板模拟粒子也存在多种制备方法。方法一：以人源血小板为原材料，通过使用聚乙二醇(缩写peg)增强血小板稳定性，该制备方法血小板易活化进而引发聚集效应，导致质控品失效，同时人源血小板商业来源价格昂贵。方法二：采用低成本的山羊红细胞为原材料制备血小板模拟粒子，该方法可以减少人源血小板的聚集效应，但是，该方法需要对山羊红细胞进行皱缩处理，以调整其体积大小来制备血小板模拟粒子，无法有效模拟人血小板体积分布，并且，皱缩的羊红细胞在等渗的保存液中存在形变恢复的趋势。方法三：采用不同红细胞体积特征的山羊血混合，模拟人血小板体积分布，但其加工工艺过于复杂，同时因固定后的血小板粒子会对溶血剂有抗溶作用，当含有血小板和白细胞的质控物用于检测时，该方法制备的血小板模拟粒子，会导致白细胞计数假性升高，影响质控的准确性。方法四：通过弱固定动物血红细胞，满足溶血剂作用下可溶解需求，然后通过不同渗透压环境下调至体积大小，混合不同体积大小的红细胞，实现近似人血小板体积分布，但工艺实用性及可控性仍然是较大挑战。
因此，亟需一种简单、经济，而又适用于工业化生产的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子的制备方法，以满足血液质控物的生产和使用需求。
技术实现要素：
本申请的目的是提供一种新的网织红细胞模拟粒子、血小板模拟粒子的制备方法，以及含有所制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子的质控物。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种网织红细胞模拟粒子的制备方法，包括采用n-羟基琥珀酰亚胺活化的具有羧基的蛋白荧光染料，对哺乳动物红细胞进行染色，并对哺乳动物红细胞进行固定处理，制成网织红细胞模拟粒子；其中，固定处理可以在染色前或染色后进行，哺乳动物红细胞的体积大小为60-120fl，哺乳动物红细胞优选为人源红细胞、兔红细胞、牛红细胞、猪红细胞、马红细胞或豚鼠红细胞。
需要说明的是，本申请的关键在于采用n-羟基琥珀酰亚胺活化的蛋白荧光染料对体积大小为60-120fl的哺乳动物红细胞进行染色；其中，限定哺乳动物红细胞的体积大小为60-120fl，使得制备出的模拟粒子能够有效的模拟网织红细胞的荧光和体积性质。并且，本申请采用n-羟基琥珀酰亚胺活化的蛋白荧光染料染色获得的模拟粒子，具有和网织红细胞类似的膜性质，能够满足溶血和非溶血的检测通道的质控需求。n-羟基琥珀酰亚胺活化的蛋白荧光染料是指对蛋白荧光染料的羧基进行n-羟基琥珀酰亚胺化，这样可以使蛋白荧光染料稳定的结合在哺乳动物红细胞膜表面，保障了模拟粒子中蛋白荧光染料连接的稳定性。还需要说明的是，一般而言，体积大小为60-120fl的哺乳动物红细胞主要包括人源红细胞、兔红细胞、牛红细胞、猪红细胞、马红细胞和豚鼠红细胞等，这些都可以用于制备本申请的网织红细胞模拟粒子；可以理解，本申请的网织红细胞模拟粒子，只要其原材料红细胞的体积大小满足60-120fl都可以用于本申请，不只限于人源红细胞、兔红细胞、牛红细胞、猪红细胞、马红细胞和豚鼠红细胞。还需要说明的是，本申请中，固定处理为弱固定处理，即在固定细胞的同时又能保持一定的细胞活性，使之能够长期稳定，同时能够在溶血剂的作用下溶解。
可以理解，本申请的制备方法可以简单而有效的获得网织红细胞模拟粒子，在本申请制备的网织红细胞模拟粒子基础上，还可以进一步的对其进行球形化处理，以满足不同的使用需求。当然，球形化处理的具体步骤可以整合到本申请的制备方法中，在此不做具体限定。
优选的，本申请的制备方法中，采用n-羟基琥珀酰亚胺活化的具有羧基的蛋白荧光染料，对哺乳动物红细胞进行染色，包括以下步骤，
提取哺乳动物红细胞；
提供经n-羟基琥珀酰亚胺活化的蛋白荧光染料，蛋白荧光染料中具有可供活化的羧基，羧基被n-羟基琥珀酰亚胺活化；
将n-羟基琥珀酰亚胺活化的蛋白荧光染料与哺乳动物红细胞孵育，对哺乳动物红细胞进行染色，获得染色的红细胞。
优选的，本申请的制备方法还包括对经过染色和固定的细胞进行洗涤。
可以理解，洗涤的目的是去除多余或者结合不稳定的蛋白荧光染料和固定剂，以免对后续步骤或者对融合质控物的其它组分造成影响，洗涤采用常规的缓冲液，如含柠檬酸和柠檬酸钠的混合溶液，或者柠檬酸、柠檬酸钠和氯化钠的混合溶液，在此不做具体限定。
优选的，n-羟基琥珀酰亚胺活化的具有羧基的蛋白荧光染料为通式一所示结构，
通式一
通式一中，r为蛋白荧光染料，n为1-4的整数，n值取决于蛋白荧光染料的羧基个数。
优选的，蛋白荧光染料为通式二、通式三、通式四和通式五所示结构的至少一种，
通式二
通式三
通式四
通式五
通式二至通式五中，m为0、1、2或3，r1、r2各自独立地选自磺酸基、卤素原子或者氢原子；
r3和r4各自独立地选自烷基或含羧基的烷基，并且，r3和r4中至少有一个为含羧基的烷基；
r5、r6各自独立地选自磺酸基、卤素原子、烷基或者氢原子。
需要说明的是，通式二至通式五中，各自的r1、r2、r3、r4、r5或r6的基团选择互不影响。
优选的，蛋白荧光染料为荧光染料a-h中的至少一种，
荧光染料a的结构式为
荧光染料b的结构式为
荧光染料c的结构式为
荧光染料d的结构式为
荧光染料e的结构式为
荧光染料f的结构式为
荧光染料g的结构式为
荧光染料h的结构式为
优选的，固定处理采用的固定剂为重金属盐、甲醛、丙酮醛、戊二醛和多聚甲醛中的至少一种；
优选的，甲醛、丙酮醛、戊二醛或多聚甲醛的反应浓度为体积比0.005％-1％。
优选的，重金属盐为重铬酸盐，更优选为重铬酸钾或重铬酸。
优选的，本申请的制备方法，还包括对哺乳动物红细胞进行球形化处理。
本申请的另一面公开了一种本申请的制备方法制备的网织红细胞模拟粒子。
本申请的另一面公开了一种血小板模拟粒子的制备方法，包括采用n-羟基琥珀酰亚胺活化的具有羧基的蛋白荧光染料，对哺乳动物红细胞进行染色，并对哺乳动物红细胞进行固定处理，制成血小板模拟粒子；固定处理可以在染色前或染色后进行，哺乳动物红细胞的体积大小为2-25fl，哺乳动物红细胞优选为山羊源红细胞或绵羊红细胞。
需要说明的是，本申请的关键在于采用n-羟基琥珀酰亚胺活化的蛋白荧光染料对体积大小为2-25fl的哺乳动物红细胞进行染色；其中，限定哺乳动物红细胞的体积大小为2-25fl，使得制备出的模拟粒子能够有效的模拟血小板的荧光和体积性质。并且，本申请采用n-羟基琥珀酰亚胺活化的蛋白荧光染料染色获得的模拟粒子，具有和血小板类似的膜性质，能够满足溶血和非溶血的检测通道的质控需求。本申请的血小板模拟粒子制备方法和网织红细胞模拟粒子制备方法，两者的相同点在于，采用相同的n-羟基琥珀酰亚胺活化的蛋白荧光染料进行染色，而两者的关键区别在于，采用不同体积大小的哺乳动物红细胞原材料。经本申请的研究证实，采用本申请的制备方法，体积大小为60-120fl的哺乳动物红细胞能够模拟出网织红细胞，体积大小为2-25fl的哺乳动物红细胞能够模拟出血小板。还需要说明的是，一般来说，体积大小为2-25fl的哺乳动物红细胞主要包括山羊源红细胞或绵羊红细胞，两者都可以用于制备本申请的血小板模拟粒子；可以理解，本申请的血小板模拟粒子，只要其原材料红细胞的体积大小满足2-25fl都可以用于本申请，不只限于山羊源红细胞或绵羊红细胞。
可以理解，本申请的制备方法可以简单而有效的获得血小板模拟粒子，在本申请制备的血小板模拟粒子基础上，还可以进一步的对其进行球形化处理，以满足不同的使用需求。当然，球形化处理的具体步骤可以整合到本申请的制备方法中，在此不做具体限定。
本申请的再一面公开了本申请的制备方法制备的血小板模拟粒子，并且，血小板模拟粒子中含有网织血小板模拟粒子。
本申请的再一面公开了一种血液分析仪用的质控物或校准物，其中含有本申请的网织红细胞模拟粒子和/或本申请的血小板模拟粒子。
优选的，质控物或校准物中还含有白细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子和有核红细胞模拟粒子中的至少一种。
需要说明的是，本申请的质控物或校准物中，可以根据不同的使用需求调整织红细胞模拟粒子、血小板模拟粒子、白细胞或白细胞模拟粒子、红细胞或红细胞模拟粒子等组份的浓度，以配制出低值、中值、高值质控物或校准物，在此不做具体限定。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的网织红细胞模拟粒子、血小板模拟粒子制备方法，采用n-羟基琥珀酰亚胺活化的蛋白荧光染料对不同体积大小的哺乳动物红细胞进行染色，从而分别获得网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子。本申请制备的模拟粒子，其散点图荧光与体积方向接近新鲜血网织红细胞、网织血小板和血小板的散点图分布，既具备良好的稳定性，同时不干扰白细胞和有核红细胞通道的计数与分类。本申请的制备方法简单，便于加工，为网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子提供了一种新的制备方法和途径。
含有本申请的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子的质控物，还可以与白细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子和红细胞模拟粒子混合，制备融合质控物，实现了单支产品完成血液分析仪质控所需的全部检测参数监控与评价的目的，对质控物进行超过3个月的连续稳定性测试结果显示，本申请的质控物或校准物稳定性水平已达到国际一流产品水平。
附图说明
图1是本申请实施例中模拟粒子的制备流程图；
图2是本申请实施例中荧光染料a制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在迈瑞bc-6系列血细胞分析仪ret通道检测得到的散点图，横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图3是本申请实施例中包括有荧光染料a制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在添加白细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子和保存液后制备的融合质控物的低中高三个水平的散点图，其中ret通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度，diff通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示荧光强度，baso通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示前向散射光强度，nrbc通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图4是本申请实施例中制备的融合质控物低中高三个水平在2-8℃放置三个月后的散点图，其中ret通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度，diff通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示荧光强度，baso通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示前向散射光强度，nrbc通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图5是本申请实施例中荧光染料b制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在迈瑞bc-6系列血细胞分析仪ret通道检测得到的散点图，横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图6是本申请实施例中包括有荧光染料b制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在添加白细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子和保存液后制备的融合质控物中值的散点图，其中ret通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度，diff通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示荧光强度，baso通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示前向散射光强度，nrbc通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图7是本申请实施例中荧光染料c制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在迈瑞bc-6系列血细胞分析仪ret通道检测得到的散点图，横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图8是本申请实施例中包括有荧光染料c制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在添加白细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子和保存液后制备的融合质控物中值的散点图，其中ret通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度，diff通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示荧光强度，baso通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示前向散射光强度，nrbc通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图9是本申请实施例中荧光染料d制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在迈瑞bc-6系列血细胞分析仪ret通道检测得到的散点图，横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图10是本申请实施例中包括有荧光染料d制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在添加白细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子和保存液后制备的融合质控物中值的散点图，其中ret通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度，diff通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示荧光强度，baso通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示前向散射光强度，nrbc通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图11是本申请实施例中荧光染料e制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在迈瑞bc-6系列血细胞分析仪ret通道检测得到的散点图，横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图12是本申请实施例中包括有荧光染料e制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在添加白细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子和保存液后制备的融合质控物中值的散点图，其中ret通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度，diff通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示荧光强度，baso通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示前向散射光强度，nrbc通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图13是本申请实施例中荧光染料f制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在迈瑞bc-6系列血细胞分析仪ret通道检测得到的散点图，横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图14是本申请实施例中包括有荧光染料f制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在添加白细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子和保存液后制备的融合质控物中值的散点图，其中ret通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度，diff通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示荧光强度，baso通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示前向散射光强度，nrbc通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图15是本申请实施例中荧光染料g制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在迈瑞bc-6系列血细胞分析仪ret通道检测得到的散点图，横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图16是本申请实施例中包括有荧光染料g制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在添加白细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子和保存液后制备的融合质控物中值的散点图，其中ret通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度，diff通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示荧光强度，baso通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示前向散射光强度，nrbc通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图17是本申请实施例中荧光染料h制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在迈瑞bc-6系列血细胞分析仪ret通道检测得到的散点图，横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图18是本申请实施例中包括有荧光染料h制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子在添加白细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子和保存液后制备的融合质控物中值的散点图，其中ret通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度，diff通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示荧光强度，baso通道横坐标表示侧向散射光强度，纵坐标表示前向散射光强度，nrbc通道横坐标表示荧光强度，纵坐标表示前向散射光强度；
图2-图18中：1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板、4为红细胞、5为淋巴细胞、6为单核细胞、7为中性粒细胞、8为嗜酸性粒细胞、9为嗜碱性粒细胞、10为有核红细胞。
具体实施方式
本申请中的蛋白荧光染料，是指在生物技术领域中，使蛋白质染色的荧光染料。
本申请在对红细胞进行蛋白荧光染料染色的研究中发现，对具有羧基的蛋白荧光染料使用n-羟基琥珀酰亚胺活化羧基后，与红细胞一起孵育，不仅红细胞的细胞膜不会被破坏，而且还会与细胞膜形成稳定的结合，使得原本没有荧光的红细胞会在激光的照射下产生荧光，使红细胞可以作为原料用于制备一些具有在检测中需要产生荧光的血液质控物；并且，不同体积大小的哺乳动物红细胞，可以分别制备出网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子。其中适用于本申请的蛋白荧光染料，其n-羟基琥珀酰亚胺化后的通式，如通式一所示；优选的，蛋白荧光染料为通式二、通式三、通式四和通式五所示结构的至少一种；更优选的为本申请所记载的荧光染料a-h中的至少一种。
与采用塑料粒子或脂质体交联染料来模拟细胞的方法相比，本申请采用红细胞为原料，制备的模拟粒子具有与网织红细胞模拟粒子、网织血小板类似的膜性质，能够满足溶血和非溶血的检测通道的质控需求；本申请制备的模拟粒子既具备良好的稳定性，同时不影响其它细胞粒子的计数与分类。并且，本申请的制备方法如图1所示，只需要对红细胞进行染色、固定以及调节计数保存即可，工艺相对简单，便于加工。
下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
除非特别说明，实施例中使用到的仪器、设备和溶液均为常规选择。实施例中，血细胞分析仪为迈瑞bc-6系列血细胞分析仪。
实施例一
本例对荧光染料a进行n-羟基琥珀酰亚胺活化，并溶解于有机溶剂中，制备成为荧光染料a母液。本例中活化的染料具体合成步骤为：在二氯甲烷中加入染料a、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，常温搅拌反应1小时即可制得，活化后的染料a。在其他实施例中，根据染料不同，也可以使用其他有机溶剂，例如甲醇。反应条件可以根据本领域常规技术手段做调整。
本例的保存液为市售常规使用的保存液，以下实施例与本例相同。
网织红细胞模拟粒子制备方法如下：
1、取人源红细胞，全血过滤，收集滤后红细胞(缩写rbc)；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤rbc两次；其中，洗涤液ⅰ为含磷酸氢二钠2.0g/l、磷酸二氢钠0.2g/l和氯化钠9.0g/l的溶液；
3、洗涤液ⅰ悬浮细胞沉淀，加入荧光染料a母液，使荧光染料终浓度为100mg/l，荧光染料加入细胞沉淀表层静置3分钟，使荧光染料与细胞充分接触，然后混匀，反应结束后，离心去上清，加入4倍体积的洗涤液ⅱ，离心去上清；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠35g/l和柠檬酸0.2g/l的溶液；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入37-40％甲醛固定剂，使其终浓度为0.1％，室温处理2小时；固定结束后，洗涤液ⅱ调节rbc至适当浓度，离心去上清，重复洗涤两次；
5、除去上清，保存液悬浮至rbc计数至适当浓度，获得网织红细胞模拟粒子；将模拟粒子于2～8℃冷藏，每24小时更换一次上清保存液，更换3次后，制备得到的网织红细胞模拟粒子可于保存液中长期保存。
血小板模拟粒子制备方法如下：
1、取山羊血原材料，全血过滤，收集滤后羊源红细胞(缩写rbc)；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤羊源rbc两次；其中，洗涤液ⅰ为含磷酸氢二钠1.44g/l、磷酸二氢钾0.27g/l、氯化钠8g/l和氯化钾0.2g/l溶液；
3、洗涤液ⅰ悬浮细胞沉淀，加入荧光染料a母液，使荧光染料终浓度为50mg/l，加入后迅速混匀；室温标记1小时，期间混匀3-4次，使荧光染料与细胞充分接触，反应结束后加入等体积洗涤液ⅱ稀释，离心去上清，洗涤液ⅱ重复洗涤1次；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠35g/l、柠檬酸0.2g/l的溶液；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入37-40％甲醛固定剂，使其终浓度为0.5％，室温处理2小时；
5、固定结束后，使用牛血清白蛋白(缩写bsa)终浓度为0.05％的洗涤液ⅱ等体积稀释，离心去上清，重复洗涤2次；
6、保存液悬浮至plt计数至适当浓度，2～8℃冷藏，含网织血小板的血小板模拟粒子制备完成。
融合质控物调配：
添加白细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子至本例制备的网织红细胞模拟粒子和含网织血小板的血小板模拟粒子中，按比例混合，形成质控物，各组分浓度如下：
低值：白细胞模拟粒子2.8×109/l，红细胞模拟粒子2.8×1012/l，血小板模拟粒子75×109/l，网织红细胞模拟粒子0.02×1012/l，有核红细胞模拟粒子0.11×109/l。
中值：白细胞模拟粒子8.5×109/l，红细胞模拟粒子4.5×1012/l，血小板模拟粒子225×109/l，网织红细胞模拟粒子0.11×1012/l，有核红细胞模拟粒子0.35×109/l。
高值：白细胞模拟粒子20×109/l，红细胞模拟粒子5.2×1012/l，血小板模拟粒子490×109/l，网织红细胞模拟粒子0.26×1012/l，有核红细胞模拟粒子0.8×109/l。
用以荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪分别对本例制备的网织红细胞模拟粒子、血小板模拟粒子和质控物进行检测。网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子的散点图如图2所示，其中左图为网织红细胞模拟粒子的散点图，右图为血小板模拟粒子的散点图，图中，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板；融合质控物低、中、高值的散点图如图3所示，图中，第一行为融合质控物低值散点图、第二行为中值散点图、第三行为高值散点图，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板、4为红细胞、5为淋巴细胞、6为单核细胞、7为中性粒细胞、8为嗜酸性粒细胞、9为嗜碱性粒细胞、10为有核红细胞。图2的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子具有新鲜血网织红细胞和血小板的散点图分布，在血小板模拟粒子的散点图中，其血小板2的右上方部分即网织血小板3；图3的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子，不干扰白细胞、有核红细胞等其它粒子通道的计数与分类，能够用于制备血液质控物或校准物。
实施例二
对荧光染料b进行n-羟基琥珀酰亚胺活化，并溶解于有机溶剂中，制备成为荧光染料b母液。
网织红细胞模拟粒子制备：
1、取人源红细胞，全血过滤，收集滤后rbc；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤rbc两次，洗涤液ⅰ为含磷酸氢二钾1.41g/l、磷酸二氢钾0.27g/l和氯化钾11.8g/l的溶液；
3、加入重铬酸钾溶液悬浮细胞沉淀，重铬酸钾的终浓度为0.1g/l，并加入50％戊二醛固定剂，使其终浓度为0.005％，室温固定2小时，固定结束后，洗涤液ⅰ离心洗涤rbc两次；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入荧光染料b母液，使荧光染料终浓度为50mg/l，加入后迅速混匀；室温标记2小时，期间混匀3-4次，使荧光染料与细胞充分接触，反应结束后加入4倍体积的洗涤液ⅱ，离心去上清，洗涤液ⅱ重复洗涤1次；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠17g/l、柠檬酸0.1g/l和氯化钠5g/l的溶液；
5、除去上清，保存液悬浮至rbc计数至适当浓度，获得网织红细胞模拟粒子。将模拟粒子于2～8℃冷藏，每24小时更换一次上清保存液，更换3次后，制备得到的网织红细胞模拟粒子可于保存液中长期保存。
血小板模拟粒子制备：
1、取山羊血原材料，全血过滤，收集滤后羊源rbc；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤2次；洗涤液ⅰ为含磷酸氢二钠2.0g/l、磷酸二氢钠0.2g/l和氯化钠9.0g/l的溶液；
3、洗涤液ⅰ悬浮细胞沉淀，加入荧光染料b母液，使荧光染料终浓度为5mg/l，加入后迅速混匀；室温标记15分钟，期间混匀3-4次，使荧光染料与细胞充分接触，反应结束后加入等体积洗涤液ⅱ稀释，离心去上清，重复洗涤2次；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠17g/l、柠檬酸0.1g/l和氯化钠5g/l的溶液；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入50％戊二醛固定剂，使其终浓度为0.005％，以及37-40％甲醛固定剂，使其终浓度为0.1％，室温处理过夜；
5、固定结束后，使用bsa终浓度为0.025％的洗涤液ⅱ等体积稀释，离心去上清，重复洗涤2次；
6、保存液悬浮至plt计数至适当浓度，2～8℃冷藏，含网织血小板的血小板模拟粒子制备完成。
融合质控物调配：
添加白细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子至本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子中，按比例混合，形成融合质控物，使得：
中值：白细胞模拟粒子8.5×109/l，红细胞模拟粒子4.5×1012/l，血小板模拟粒子225×109/l，网织红细胞模拟粒子0.11×1012/l，有核红细胞模拟粒子0.35×109/l。
用以荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪分别对本例制备的网织红细胞模拟粒子、血小板模拟粒子和质控物进行检测。网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子的散点图如图5所示，其中左图为网织红细胞模拟粒子的散点图，右图为血小板模拟粒子的散点图，图中，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板；融合质控物中值散点图如图6所示，图中，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板、4为红细胞、5为淋巴细胞、6为单核细胞、7为中性粒细胞、8为嗜酸性粒细胞、9为嗜碱性粒细胞、10为有核红细胞。图5的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子具有新鲜血网织红细胞和血小板的散点图分布，在血小板模拟粒子的散点图中，其血小板2的右上方部分即网织血小板3；图6的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子，不干扰白细胞、有核红细胞等其它粒子通道的计数与分类，能够用于制备血液质控物或校准物。
实施例三
对荧光染料c进行n-羟基琥珀酰亚胺活化，并溶解于有机溶剂中，制备成为荧光染料c母液。
网织红细胞模拟粒子制备：
1、取人源红细胞，全血过滤，收集滤后rbc；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤rbc两次；洗涤液ⅰ为含磷酸氢二钠1.44g/l、磷酸二氢钾0.27g/l、氯化钠8g/l和氯化钾0.2g/l的溶液；
3、洗涤液ⅰ悬浮细胞沉淀，加入荧光染料c母液，使荧光染料终浓度为10mg/l，加入后迅速混匀；室温标记20分钟，期间混匀3-4次，使荧光染料与细胞充分接触，反应结束后加入4倍体积的洗涤液ⅱ，离心去上清，重复洗涤1次；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠17g/l、柠檬酸0.1g/l和氯化钠5g/l的溶液；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入50％戊二醛，使其终浓度为0.05％，室温处理2小时；固定结束后，使用bsa终浓度为1％的洗涤液ⅱ调节rbc计数至适当浓度，离心去上清，重复洗涤2次；
5、保存液悬浮至rbc计数至适当浓度，获得本例的网织红细胞模拟粒子。
血小板模拟粒子制备：
1、取山羊血原材料，全血过滤，收集滤后羊源rbc；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤2次；洗涤液ⅰ为含磷酸氢二钠2.0g/l、磷酸二氢钠0.2g/l和氯化钠9.0g/l的溶液；
3、洗涤液ⅰ悬浮细胞沉淀，加入一定量荧光染料c母液，使荧光染料终浓度为5mg/l，加入后迅速混匀。室温标记15分钟，期间混匀3-4次，使荧光染料与细胞充分接触，反应结束后加入等体积洗涤液ⅱ稀释，离心去上清，重复洗涤1次；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠17g/l、柠檬酸0.1g/l和氯化钠5g/l的溶液；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入37-40％甲醛固定剂，使其终浓度为0.25％，室温处理4h；
5、固定结束后，使用bsa终浓度为0.05％的洗涤液ⅱ等体积稀释，离心去上清，重复洗涤2次；
6、保存液悬浮至plt计数至适当浓度，2～8℃冷藏，含网织血小板的血小板模拟粒子制备完成。
融合质控物调配：
添加白细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子至本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子中，按比例混合，形成融合质控物，使得：
中值：白细胞模拟粒子8.5×109/l，红细胞模拟粒子4.5×1012/l，血小板模拟粒子225×109/l，网织红细胞模拟粒子0.11×1012/l，有核红细胞模拟粒子0.35×109/l。
用以荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪分别对本例制备的网织红细胞模拟粒子、血小板模拟粒子和质控物进行检测。网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子的散点图如图7所示，其中左图为网织红细胞模拟粒子的散点图，右图为血小板模拟粒子的散点图，图中，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板；融合质控物中值散点图如图8所示，图中，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板、4为红细胞、5为淋巴细胞、6为单核细胞、7为中性粒细胞、8为嗜酸性粒细胞、9为嗜碱性粒细胞、10为有核红细胞。图7的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子具有新鲜血网织红细胞和血小板的散点图分布，在血小板模拟粒子的散点图中，其血小板2的右边部分即网织血小板3；图8的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子，不干扰白细胞、有核红细胞等其它粒子通道的计数与分类，能够用于制备血液质控物或校准物。
实施例四
对荧光染料d进行n-羟基琥珀酰亚胺活化，并溶解于有机溶剂中，制备成为荧光染料d母液。
网织红细胞模拟粒子制备：
1、取人源红细胞，全血过滤，收集滤后rbc；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤rbc2次；洗涤液ⅰ为含有磷酸氢二钠1.44g/l、磷酸二氢钾0.27g/l、氯化钠8g/l和氯化钾0.2g/l的溶液；
3、洗涤液ⅰ悬浮细胞沉淀，加入荧光染料d母液，使荧光染料终浓度为40mg/l，加入后迅速混匀；2～8℃标记30分钟，期间混匀1-2次，使荧光染料与细胞充分接触，反应结束后加入4倍体积的洗涤液ⅱ，离心去上清，重复洗涤1次；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠17g/l、柠檬酸0.1g/l和氯化钠5g/l的溶液；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入50％戊二醛，使其终浓度为0.05％，室温过夜；固定结束后，使用bsa终浓度为1％的洗涤液ⅱ调节rbc计数至适当浓度，离心去上清，重复洗涤2次；
5、保存液悬浮至rbc计数至适当浓度，获得网织红细胞模拟粒子。
血小板模拟粒子制备：
1、取山羊血原材料，全血过滤，收集滤后羊源rbc；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤羊源rbc两次；洗涤液ⅰ为含磷酸氢二钠1.44g/l、磷酸二氢钾0.27g/l、氯化钠8g/l和氯化钾0.2g/l的溶液；
3、洗涤液ⅰ悬浮细胞沉淀，加入一定量荧光染料d母液，使荧光染料终浓度为20mg/l，加入后迅速混匀；室温标记1小时，期间混匀3-4次，使荧光染料与细胞充分接触，反应结束后加入等体积洗涤液ⅱ稀释，离心去上清，重复洗涤2次；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠35g/l和柠檬酸0.2g/l的溶液；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入50％戊二醛固定剂，使其终浓度为0.03％，以及37-40％甲醛固定剂，使其终浓度为0.15％，室温处理8小时；
5、固定结束后，使用bsa终浓度为0.15％的洗涤液ⅱ等体积稀释，离心去上清，重复洗涤2次；
6、保存液悬浮至plt计数至适当浓度，2～8℃冷藏，含网织血小板的血小板模拟粒子制备完成。
融合质控物调配：
添加白细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子至本例的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子中，按比例混合，形成融合质控物，使得：
中值：白细胞模拟粒子8.5×109/l，红细胞模拟粒子4.5×1012/l，血小板模拟粒子225×109/l，网织红细胞模拟粒子0.11×1012/l，有核红细胞模拟粒子0.35×109/l。
用以荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪分别对本例制备的网织红细胞模拟粒子、血小板模拟粒子和质控物进行检测。网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子的散点图如图9所示，其中左图为网织红细胞模拟粒子的散点图，右图为血小板模拟粒子的散点图，图中，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板；融合质控物中值散点图如图10所示，图中，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板、4为红细胞、5为淋巴细胞、6为单核细胞、7为中性粒细胞、8为嗜酸性粒细胞、9为嗜碱性粒细胞、10为有核红细胞。图9的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子具有新鲜血网织红细胞和血小板的散点图分布，在血小板模拟粒子的散点图中，其血小板2的右边部分即网织血小板3；图10的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子，不干扰白细胞、有核红细胞等其它粒子通道的计数与分类，能够用于制备血液质控物或校准物。
实施例五
对荧光染料e进行n-羟基琥珀酰亚胺活化，并溶解于有机溶剂中，制备成为荧光染料e母液。
网织红细胞模拟粒子制备：
1、取人源红细胞，全血过滤，收集滤后rbc；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤rbc两次；洗涤液ⅰ为含磷酸氢二钠1.44g/l、磷酸二氢钾0.27g/l、氯化钠8g/l和氯化钾0.2g/l的溶液；
3、洗涤液ⅰ悬浮细胞沉淀，加入荧光染料e母液，使荧光染料终浓度为15mg/l，加入后迅速混匀；室温标记30分钟，期间混匀3-4次，使荧光染料与细胞充分接触，反应结束后加入4倍体积的洗涤液ⅰ，离心去上清，重复洗涤1次；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入37-40％甲醛固定剂，使其终浓度为0.1％，室温处理1小时；固定结束后，使用bsa终浓度为0.5％的洗涤液ⅱ调节rbc计数至适当浓度，离心去上清，重复洗涤2次；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠17g/l、柠檬酸0.1g/l和氯化钠5g/l的溶液；
5、保存液悬浮至rbc计数至适当浓度，获得网织红细胞模拟粒子。
血小板模拟粒子的制备：
1、取山羊血原材料，全血过滤，收集滤后羊源rbc；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤2次；洗涤液ⅰ为含磷酸氢二钠2.0g/l、磷酸二氢钠0.2g/l和氯化钠9.0g/l的溶液；
3、洗涤液ⅰ悬浮细胞沉淀，加入荧光染料e母液，使荧光染料终浓度为10mg/l，加入后迅速混匀；室温标记1小时，期间混匀3-4次，使荧光染料与细胞充分接触，反应结束后加入4倍体积洗涤液ⅱ稀释，离心去上清，重复洗涤1次；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠17g/l、柠檬酸0.1g/l和氯化钠5g/l的溶液；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入37-40％甲醛固定剂，使其终浓度为0.8％，室温处理过夜；
5、固定结束后，使用bsa终浓度为0.05％的洗涤液ⅱ等体积稀释，离心去上清，重复洗涤2次；
6、保存液悬浮至plt计数至适当浓度，2～8℃冷藏，含网织血小板的血小板模拟粒子制备完成。
融合质控物调配：
添加白细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子至本例的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子中，按比例混合，形成融合质控物，使得：
中值：白细胞模拟粒子8.5×109/l，红细胞模拟粒子4.5×1012/l，血小板模拟粒子225×109/l，网织红细胞模拟粒子0.11×1012/l，有核红细胞模拟粒子0.35×109/l。
用以荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪分别对本例制备的网织红细胞模拟粒子、血小板模拟粒子和质控物进行检测。网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子的散点图如图11所示，其中左图为网织红细胞模拟粒子的散点图，右图为血小板模拟粒子的散点图，图中，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板；融合质控物中值散点图如图12所示，图中，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板、4为红细胞、5为淋巴细胞、6为单核细胞、7为中性粒细胞、8为嗜酸性粒细胞、9为嗜碱性粒细胞、10为有核红细胞。图11的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子具有新鲜血网织红细胞和血小板的散点图分布，在血小板模拟粒子的散点图中，其血小板2的右边部分即网织血小板3；图12的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子，不干扰白细胞、有核红细胞等其它粒子通道的计数与分类，能够用于制备血液质控物或校准物。
实施例六
对荧光染料f进行n-羟基琥珀酰亚胺活化，并溶解于有机溶剂中，制备成为荧光染料f母液。
网织红细胞模拟粒子的制备：
1、取人源红细胞，全血过滤，收集滤后rbc；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤rbc两次；洗涤液ⅰ为含磷酸氢二钠1.44g/l、磷酸二氢钾0.27g/l、氯化钠8g/l和氯化钾0.2g/l的溶液；
3、洗涤液ⅰ悬浮细胞沉淀，加入荧光染料f母液，使荧光染料终浓度为55mg/l，缓慢加入细胞表层静置，5分钟后混匀，2～8℃标记30分钟，使荧光染料与细胞充分接触，反应结束后加入4倍体积的洗涤液ⅱ，离心去上清，重复洗涤1次；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠17g/l、柠檬酸0.1g/l和氯化钠5g/l的溶液；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入50％戊二醛，使其终浓度为0.05％，室温处理3小时。固定结束后，使用bsa终浓度为0.6％的洗涤液ⅱ调节rbc计数至适当浓度，离心去上清，重复洗涤2次；
5、保存液悬浮至rbc计数至适当浓度，获得网织红细胞模拟粒子。
血小板模拟粒子的制备：
1、取山羊血原材料，全血过滤，收集滤后羊源rbc；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤2次；洗涤液ⅰ为含磷酸氢二钠2.0g/l、磷酸二氢钠0.2g/l和氯化钠9.0g/l的溶液；
3、洗涤液ⅰ悬浮细胞沉淀，加入荧光染料f母液，使荧光染料终浓度为15mg/l，缓慢加入细胞表层静置，8分钟后混匀，室温标记15分钟，期间混匀3-4次，使荧光染料与细胞充分接触，反应结束后加入4倍体积洗涤液ⅱ稀释，离心去上清，重复洗涤1次；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠17g/l、柠檬酸0.1g/l和氯化钠5g/l的溶液；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入戊二醛固定剂，使其终浓度为0.015％，室温处理过夜。
5、固定结束后，使用bsa终浓度为0.025％的洗涤液ⅱ等体积稀释，离心去上清，重复洗涤2次；
6、保存液悬浮至plt计数至适当浓度，2～8℃冷藏，含网织血小板的血小板模拟粒子制备完成。
融合质控物调配：
添加白细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子至本例的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子中，按比例混合，形成融合质控物，使得：
中值：白细胞模拟粒子8.5×109/l，红细胞模拟粒子4.5×1012/l，血小板模拟粒子225×109/l，网织红细胞模拟粒子0.11×1012/l，有核红细胞模拟粒子0.35×109/l。
用以荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪分别对本例制备的网织红细胞模拟粒子、血小板模拟粒子和质控物进行检测。网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子的散点图如图13所示，其中左图为网织红细胞模拟粒子的散点图，右图为血小板模拟粒子的散点图，图中，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板；融合质控物中值散点图如图14所示，图中，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板、4为红细胞、5为淋巴细胞、6为单核细胞、7为中性粒细胞、8为嗜酸性粒细胞、9为嗜碱性粒细胞、10为有核红细胞。图13的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子具有新鲜血网织红细胞和血小板的散点图分布，在血小板模拟粒子的散点图中，其血小板2的右边部分即网织血小板3；图14的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子，不干扰白细胞、有核红细胞等其它粒子通道的计数与分类，能够用于制备血液质控物或校准物。
实施例七
对荧光染料g进行n-羟基琥珀酰亚胺活化，并溶解于有机溶剂中，制备成为荧光染料g母液。
网织红细胞模拟粒子的制备：
1、取人源红细胞，全血过滤，收集滤后rbc；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤rbc两次；洗涤液ⅰ为含磷酸氢二钠1.44g/l、磷酸二氢钾0.27g/l、氯化钠8g/l和氯化钾0.2g/l的溶液；
3、洗涤液ⅰ悬浮细胞沉淀，加入荧光染料g母液，使荧光染料终浓度为85mg/l，加入后迅速混匀；2～8℃标记45分钟，期间混匀1-2次，使荧光染料与细胞充分接触，反应结束后加入4倍体积的洗涤液ⅱ，离心去上清，重复洗涤1次；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠17g/l、柠檬酸0.1g/l和氯化钠5g/l的溶液；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入50％戊二醛，使其终浓度为0.1％，室温处理1小时；固定结束后，使用bsa终浓度为1％的洗涤液ⅱ调节rbc计数至适当浓度，离心去上清，重复洗涤2次；
5、保存液悬浮至rbc计数至适当浓度，获得网织红细胞模拟粒子。
血小板模拟粒子的制备：
1、取山羊血原材料，全血过滤，收集滤后羊源rbc；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤羊源rbc两次；洗涤液ⅰ为含磷酸氢二钠1.44g/l、磷酸二氢钾0.27g/l、氯化钠8g/l和氯化钾0.2g/l的溶液；
3、洗涤液ⅰ悬浮细胞沉淀，加入一定量荧光染料g母液，使荧光染料终浓度为35mg/l，加入后缓慢混匀；室温标记30分钟，期间混匀3-4次，使荧光染料与细胞充分接触，反应结束后加入4等体积洗涤液ⅱ稀释，离心去上清，重复洗涤1次；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠17g/l、柠檬酸0.1g/l和氯化钠5g/l的溶液；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入37-40％甲醛固定剂，使其终浓度为0.3％，室温处理4小时；
5、固定结束后，使用bsa终浓度为0.05％的洗涤液ⅱ等体积稀释，离心去上清，重复洗涤2次；
6、保存液悬浮至plt计数至适当浓度，2～8℃冷藏，含网织血小板的血小板模拟粒子制备完成。
融合质控物调配：
添加白细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子至本例的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子中，按比例混合，形成融合质控物，使得：
中值：白细胞模拟粒子8.5×109/l，红细胞模拟粒子4.5×1012/l，血小板模拟粒子225×109/l，网织红细胞模拟粒子0.11×1012/l，有核红细胞模拟粒子0.35×109/l。
用以荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪分别对本例制备的网织红细胞模拟粒子、血小板模拟粒子和质控物进行检测。网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子的散点图如图15所示，其中左图为网织红细胞模拟粒子的散点图，右图为血小板模拟粒子的散点图，图中，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板；融合质控物中值散点图如图16所示，图中，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板、4为红细胞、5为淋巴细胞、6为单核细胞、7为中性粒细胞、8为嗜酸性粒细胞、9为嗜碱性粒细胞、10为有核红细胞。图15的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子具有新鲜血网织红细胞和血小板的散点图分布，在血小板模拟粒子的散点图中，其血小板2的右边部分即网织血小板3；图16的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子，不干扰白细胞、有核红细胞等其它粒子通道的计数与分类，能够用于制备血液质控物或校准物。
实施例八
对荧光染料h进行n-羟基琥珀酰亚胺活化，并溶解于有机溶剂中，制备成为荧光染料h母液。
网织红细胞模拟粒子的制备：
1、取人源红细胞，全血过滤，收集滤后rbc；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤rbc两次；洗涤液ⅰ为含磷酸氢二钠1.44g/l、磷酸二氢钾0.27g/l、氯化钠8g/l和氯化钾0.2g/l的溶液；
3、洗涤液ⅰ悬浮细胞沉淀，加入一定量荧光染料h母液，使荧光染料终浓度为25mg/l，缓慢加入细胞表层静置，室温4分钟后混匀，室温标记20分钟，期间混匀1-2次，使荧光染料与细胞充分接触，反应结束后加入等倍体积的洗涤液ⅰ，离心去上清，重复洗涤2次；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入37-40％甲醛固定剂，使其终浓度为0.5％，室温处理2小时；固定结束后，使用bsa终浓度为1％的洗涤液ⅱ调节rbc计数至适当浓度，离心去上清，重复洗涤2次；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠35g/l和柠檬酸0.2g/l的溶液；
5、保存液悬浮至rbc计数至适当浓度，获得网织红细胞模拟粒子。
血小板制备
1、取山羊血原材料，全血过滤，收集滤后羊源rbc；
2、洗涤液ⅰ离心洗涤2次；洗涤液ⅰ为含磷酸氢二钠2.0g/l、磷酸二氢钠0.2g/l和氯化钠9.0g/l的溶液；
3、洗涤液ⅰ悬浮细胞沉淀，加入一定量荧光染料h母液，使荧光染料终浓度为5mg/l，缓慢加入细胞表层静置，室温10分钟后混匀，室温标记15分钟，期间混匀1-2次，使荧光染料与细胞充分接触，反应结束后加入等体积洗涤液ⅱ稀释，离心去上清，重复洗涤1次；洗涤液ⅱ为含柠檬酸钠35g/l和柠檬酸0.2g/l的溶液；
4、洗涤液ⅱ悬浮细胞沉淀，加入戊二醛固定剂，使其终浓度为0.05％，室温处理4小时；
5、固定结束后，使用bsa终浓度为0.04％的洗涤液ⅱ等体积稀释，离心去上清，重复洗涤2次；
6、保存液悬浮至plt计数至适当浓度，2～8℃冷藏，含网织血小板的血小板模拟粒子制备完成。
融合质控物调配：
添加白细胞模拟粒子、红细胞模拟粒子、有核红细胞模拟粒子至本例的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子中，按比例混合，形成融合质控物，使得：
中值：白细胞模拟粒子8.5×109/l，红细胞模拟粒子4.5×1012/l，血小板模拟粒子225×109/l，网织红细胞模拟粒子0.11×1012/l，有核红细胞模拟粒子0.35×109/l。
用以荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪分别对本例制备的网织红细胞模拟粒子、血小板模拟粒子和质控物进行检测。网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子的散点图如图17所示，其中左图为网织红细胞模拟粒子的散点图，右图为血小板模拟粒子的散点图，图中，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板；融合质控物中值散点图如图18所示，图中，1为网织红细胞、2为血小板、3为网织血小板、4为红细胞、5为淋巴细胞、6为单核细胞、7为中性粒细胞、8为嗜酸性粒细胞、9为嗜碱性粒细胞、10为有核红细胞。图17的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子具有新鲜血网织红细胞和血小板的散点图分布，在血小板模拟粒子的散点图中，其血小板2的右边部分即网织血小板3；图18的结果显示，本例制备的网织红细胞模拟粒子和血小板模拟粒子，不干扰白细胞、有核红细胞等其它粒子通道的计数与分类，能够用于制备血液质控物或校准物。
在以上试验的基础上，本申请将八个实施例的融合质控物2～8℃冷藏保存三个月，每周定期对质控物进行血液细胞分析仪检测，结果显示，本申请的质控物各通道的散点图都没有显著变化，其中，实施例1的融合质控物低中高值放置3个月后测定的散点图如图4所示，可见，本申请的质控物中各组分稳定性高，且和其他细胞的质控品混合也能保持各自的细胞模拟物性能稳定，不会相互影响。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
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