一种基于荧光共振能量转移的产单线态氧微球的制作方法

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种基于荧光共振能量转移的产单线态氧微球。

背景技术：

在特定波长(通常对应于光敏剂的最大吸收波长)的光照射下，处于基态的光敏剂能够吸收光子的能量到达激发单重态。处于激发单重态的光敏剂，一部分通过非辐射跃迁的方式回到基态；一部分通过辐射跃迁的方式回到基态，此过程发射出荧光，可用于荧光成像；还有一部分通过系间穿越的方式到达激发三重态。此时部分处于激发三重态的光敏剂一方面可以通过与作用组织处的基底物质之间的电子或者质子转移，产生具有高活性的自由基；另一方面，如图1所示还可以通过能量传递的方式，将组织周围的氧气转变成高氧化性的单线态氧(singletoxygen,¹o2)。自由基和¹o2等含氧并且性质活泼的物质被统称为活性氧(reactiveoxygen,ros)。光动力反应中产生的ros(主要以¹o2为主)，可以对生物蛋白、dna等大分子造成氧化损伤，破坏肿瘤细胞器，引起细胞功能紊乱，血管闭塞等，从而直接或者间接的引起肿瘤细胞的死亡或者凋亡，达到肿瘤治疗的目的。

当给体发射的荧光光谱与受体分子的吸收光谱重叠，并且两个分子在几个原子直径范围以内时，就会发生一种非辐射性的能量转移，这种现象就叫fret。它的原理是，当给体分子吸收一定频率的光子后，被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，会产生出振荡偶极子，并与受体的偶极子产生共振。由于给体与受体之间的远程偶极-偶极相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移(即能量共振转移)，对于特定的给体-受体对，给体丢失的能量就是受体得到的能量。

技术实现要素：

本发明的目的在于构建基于荧光共振能量转移的高效产生单线态氧微球，利用荧光共振能量转移的原理，将光敏剂负载在聚合物或者二氧化硅类微球基底上，微球内保护有荧光物质，如量子点、有机荧光染料和上转换荧光纳米材料等。通过荧光物质的发光激发光敏剂，产生单线态氧，不仅将光敏剂的激发光区从可见光区调节至近红外光区，两者之间的距离较近，更是提高了光敏剂的激发效率。

为了实现上述技术目的，本发明的技术方案内容具体如下：

一种基于荧光共振能量转移的产单线态氧微球，包括荧光物质和光敏剂，所述的荧光物质包覆于聚合物或二氧化硅微球内，所述的光敏剂在溶胀、共价键结合或静电引力的作用下负载于聚合物或二氧化硅微球上，所述的荧光物质与光敏剂的距离小于10nm，荧光物质的荧光与光敏剂的吸收光谱有重叠从而产生单线态氧。

所述的聚合物包括聚苯乙烯、聚乳酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸、聚马来酸酐十六醇酯中之一种或多种，所述的二氧化硅为介孔二氧化硅或中空二氧化硅。

所述的荧光物质包括量子点、有机荧光染料和上转换发光材料及上转换发光材料为发光核心构建的核壳结构上转换荧光纳米材料。

所述的量子点包括cdse、cdte、cds、cdsete、cdse@zns、cdte@zns、cdse@cds@zns、cdsete@zns、cdsete@cds@zns中之一种或多种；所述的有机荧光染料包括fitc、罗丹明b、cy3、cy5中之一种或多种；所述的上转换发光材料包括nayf4:yb³⁺,er³⁺、nayf4:yb³⁺,tm³⁺、nayf4:yb³⁺,ho³⁺中之一种或多种。

所述的光敏剂包括卟啉、卟吩、红紫素、玫瑰红、亚甲基蓝、金属酞菁、稠环醌类化合物、5-氨基乙酰丙酸、竹红毒素类、氟硼二吡咯类中之一种或多种。

所述的共价键结合包括edc/nhs催化羧基与氨基、戊二醛活化的氨基与氨基或巯基与巯基。

本发明产单线态氧微球的荧光共振能量转移是通过对荧光材料和光敏剂进行选择，使得荧光材料的荧光发射峰与光敏剂的吸收光谱有重叠，且连接之后两者之间的距离小于10nm来实现的。在荧光材料的特征激发光的激发下，荧光材料产生荧光发射，荧光材料的发射峰与受体光敏剂的吸收发光发生重叠，激发光敏剂，产生单线态氧。

本发明产单线态氧微球中能量供体的激发光可以通过筛选不同的荧光物质而调节，使得产生单线态氧的激发光范围更宽，从紫外光区到红外光区可调，扩宽了光敏剂被激发的范围，扩大了其使用条件。

本发明的有益效果为：

1)本发明所采用的荧光共振能量转移利用荧光物质被激发的荧光激发光敏剂产生单线态氧，扩大了激发光敏剂的波长范围。

2)本发明采用的荧光共振能量转移原理中荧光物质与光敏剂距离很近，对利用荧光对光敏剂实现激发，光敏剂对激发光的利用效率高。

3)本发明采用的荧光物质，激发光波长范围不同，穿透深度不同，可以通过对荧光物质和光敏记得筛选，得到各种条件下适用的单线态氧产生条件，拓宽了使用领域。

4)本发明中利用上转换荧光纳米材料激发光敏剂产生单线态氧，增加了对组织的穿透深度，能更好的实现对较深组织内肿瘤细胞的杀伤，且上转换荧光纳米材料的存在，使得在杀伤肿瘤细胞的同时具有荧光成像能力，实现对整个治疗过程的监控。

5)本发明中利用上转换荧光纳米材料激发光敏剂产生单线态氧，用于均相化学发光检测，上转换荧光纳米材料的激发光波长在近红外光区，避免了原有对光敏剂直接激发带来的荧光背景，增强了体系中的信噪比，提高检测灵敏度。

附图说明

图1是本发明基于荧光共振能量转移的单线态氧产生原理图；

图2是本发明实施例2制备cdse量子点的高分辨透射电镜图；

图3是本发明实施例3包覆量子点和光敏剂的感光聚苯乙烯微球的透射电镜。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

以核壳结构空心介孔二氧化硅包覆的上转换荧光纳米材料nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,tm³⁺@hollowmsio2-nh2作为基底微球，通过对c60进行羧基修饰，利用edc/nhs催化的偶联反应将氨基化核壳结构微球连接上c60。具体步骤如下：

1、c60的修饰

将0.5g的c60溶解在150ml甲苯中，逐滴加入1,8-二氮杂双环[5,4,0]十一碳-7-烯和溴代丙二酸二乙酯，氩气保护下室温搅拌反应4个小时。纯化收集c61(cooet)2的甲苯溶液。向该溶液中加入75mg的nah，并将得到的混合物在60℃的氩气下回流1小时。停止加热之后，立即加入10ml的甲醇。将所得棕色无定形的沉淀物通过离心收集，并用甲醇，hcl和水洗涤两次。最终产品(c60ma)旋转蒸发后干燥过夜。

2、二氧化硅的核壳结构上转换荧光纳米材料nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,tm³⁺@hollowmsio2-nh2的制备

(1)上转换纳米材料nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,tm³⁺的制备步骤如下：

(a)先配置1mmol/ml的ycl3·6h2o、ybcl3·6h2o、tmcl3·6h2o和ercl3·6h2o的水溶液；

(b)按照y:yb:er＝80:18:2的摩尔比取2mmol稀土氯化物水溶液，加入三口烧瓶中，加入高温溶剂油酸12ml和十八烯30ml，惰性气体保护下升温160℃，反应2h，除去体系中的空气和水，得到稀土油酸化合物；

(c)降至室温，按照比例加入naoh和nh4f的甲醇溶液，惰性气体保护下室温搅拌反应0.5h除去空气，升温100℃除去甲醇，保温0.5h；

(d)惰性气体保护下升温300℃，反应1h，气体保护下缓慢降至室温，离心洗涤将得到的上转换纳米材料nayf4:yb³⁺,er³⁺分散在环己烷溶剂中备用；

(e)取0.8mmolycl3·6h2o、0.195mmolybcl3·6h2o和0.005mmoltmcl3·6h2o水溶液，加入油酸6ml和十八烯15ml，惰性气体保护下升温160℃，反应2h，除去体系中的空气和水，得到稀土油酸化合物；

(f)降至室温，加入nayf4:yb³⁺,er³⁺的环己烷溶液，搅拌15min后加入naoh和nh4f的甲醇溶液，惰性气体保护下室温搅拌反应0.5h除去空气，升温100℃除去甲醇与环己烷，保温0.5h；

(g)惰性气体保护下升温300℃，反应1h，气体保护下缓慢降至室温，离心洗涤将得到的上转换纳米材料nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,tm³⁺分散在环己烷溶剂中备用。

(2)nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,tm³⁺@ps的制备

称取0.125g十二烷基硫酸钠(sds)加入装有超纯水的锥形瓶中，量取分散有nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,tm³⁺的4ml苯乙烯加入锥形瓶中，超声使反应体系乳化，氮气通入条件下升温至70℃，加入引发剂过硫酸钾引发聚合反应，氮气保护下70℃继续反应6h。反应冷却后，离心收集nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,tm³⁺@ps。

(3)nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,tm³⁺@hollowmsio2-mps的制备

(ⅰ)0.1gnayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,tm³⁺@ps分散于12.5ml乙醇和40ml水中，加入ctab作为致孔剂，搅拌混匀10min；加入1.5mlnh3·h2o，继续搅拌；

(ⅱ)加入1.8mlteos，室温搅拌反应8h，之后离心洗涤后分散在乙醇中；

(ⅲ)除去质控及ctab之后，加入dmf，多次洗涤除去聚苯乙烯模板，得到nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,tm³⁺@hollowmsio2，分散在乙醇中；

(ⅴ)向nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,tm³⁺@hollowmsio2乙醇溶液中加入一定量3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌反应24h，离心洗涤得到表面氨基功能化的nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,tm³⁺@hollowmsio2-nh2。

3、c60ma与nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,tm³⁺@hollowmsio2-nh2的连接

5ml二甲基甲酰胺溶液，其中加入0.5mgc60ma，1mgedc和1mgnhs在室温下反应1小时，然后把0.5mg的氨基官能化的nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,tm³⁺@hollowmsio2-nh2加入到溶液中，并搅拌24小时。离心得到nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,tm³⁺@hollowmsio2-nh2-c60ma，并用水洗涤以除去未反应c60ma。

实施例2

以cdse@msio2为基底材料，利用静电引力将光敏剂znpc固定在cdse@msio2上。

1、cdse量子点的制备

(a)称量8mg的se粉，溶解在3ml正三辛基膦(top)中，60℃下剧烈搅拌，制备得到的se前驱体。黑色的se溶解在top溶液中，得到澄清的溶液。

(b)称取51.2mgcdo，6.5ml油酸，20ml1-十八烯加入250ml的三口烧瓶，通入n2并加热至50℃，维持20min。然后再升温至300℃，并保持5min。然后迅速将(a)中制备好的se前驱体注入三颈烧瓶内。注入se前驱体的之后，开始计时，调控反应时间得到荧光发射峰位置不同的cdse量子点，使其与c60在350-670nm较宽的吸收峰有较好的重叠(图2)。每次注射使用新的针筒注射器，防止污染。取出的样品快速注入正己烷中，实现快速冷却，从而减小半高宽，提高量子点的均一性。

(c)将制备好的量子点溶解在环己烷中。

2、cdse@msio2的合成

cdseqds@msio2合成时，取制备的cdseqds环己烷溶液，在搅拌下去除环己烷，然后加入ctab，naoh和40ml水，将混合物超声分散、磁控搅拌30min。使用注射泵将2.7mlteos/无水乙醇(0.3ml/2.4ml)缓慢注入刚才制备的溶液中，然后再搅拌24h。将得到的溶液用乙醇和盐酸的混合溶液离心洗涤3次，得到cdseqds@msio2。将制备得到的cdseqds@msio2微球分散在无水乙醇中，向反应体系中加入γ-氨丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌反应24h。离心，无水乙醇洗水洗得到表面巯基化的cdseqds@msio2-nh2微球。

3、cdse@msio2-znpc的负载

取制备得到的cdseqds@msio2100mg，加入到znpc的吡啶溶液中，浓度为1mg/ml，室温下缓慢搅拌24h，离心得到负载了锌酞菁的cdseqds@msio2。

实施例3

先制备得到羧基化的聚苯乙烯微球，将fitc利用有机溶剂通过溶胀包覆进聚苯乙烯微球，利用正电解质pdda的静电引力将光敏剂mc-540固定在聚苯乙烯微球上。具体步骤如下：

1、聚苯乙烯溶胀法包覆fitc

(1)称取0.125g十二烷基硫酸钠(sds)加入装有超纯水的三口烧瓶中，量取4ml苯乙烯加入锥形瓶中，超声使反应体系乳化，氮气通入条件下升温至70℃，加入引发剂过硫酸钾引发聚合反应，70℃反应2h后加入0.1ml甲基丙烯酸，70℃继续反应6h。反应冷却后，离心收集羧基化聚苯乙烯微球。

(2)溶胀法制备荧光微球：称取0.1gps分散于5ml0.25％sds水溶液中，一定量的fitc溶于溶胀剂溶液中，混合2种溶液，用乳化机乳化，室温下振荡反应一定时间。旋蒸除去溶胀剂，剩余的液体进行离心，弃去上清液，下层固体用水洗3次，除去sds水溶液，用乙醇洗涤数次直至离心后上清液中无荧光，沉淀加水超声分散即得到fitc@ps微球。

2、fitc@ps-mc-540

fitc@ps分散在水中，向其中加入一定体积的质量浓度为20％的pdda，室温搅拌过夜，离心除去过量的pdda。pdda的修饰使得fitc@ps由初始的带负电荷变为带正电荷，将fitc@ps-pdda分散于甲苯溶液中，加入mc-540，搅拌混匀后，继续搅拌反应24h，使得mc-540能够通过静电引力固定在fitc@ps上得到fitc@ps-mc-540(图3)。

实施例4

以核壳二氧化硅包覆的上转换荧光纳米材料nayf4:yb³⁺,er³⁺,nd³⁺@nayf4:nd³⁺@sio2作为基底微球，通过在反向微乳液包覆二氧化硅过程中二氢卟吩(ce6)的引入，将光敏剂ce6包覆在二氧化硅壳层中。具体步骤如下：

1、二氧化硅包覆的核壳结构上转换荧光纳米材料nayf4:yb³⁺,er³⁺,nd³⁺@nayf4:nd³⁺@msio2的制备

(1)上转换纳米材料nayf4:yb³⁺,er³⁺,nd³⁺@nayf4:nd³⁺的制备步骤如下：

(a)先配置1mmol/ml的ycl3·6h2o、ybcl3·6h2o、ndcl3·6h2o和ercl3·6h2o的水溶液；

(b)按照y:yb:er:nd＝77:20:2:1的摩尔比取2mmol稀土氯化物水溶液，加入三口烧瓶中，加入高温溶剂油酸12ml和十八烯30ml，惰性气体保护下升温160℃，反应2h，除去体系中的空气和水，得到稀土油酸化合物；

(c)降至室温，按照比例加入naoh和nh4f的甲醇溶液，惰性气体保护下室温搅拌反应0.5h除去空气，升温100℃除去甲醇，保温0.5h；

(d)惰性气体保护下升温300℃，反应1h，气体保护下缓慢降至室温，离心洗涤将得到的上转换纳米材料nayf4:yb³⁺,er³⁺,nd³⁺分散在环己烷溶剂中备用；

(e)取0.8mmolycl3·6h2o和0.2mmolndcl3·6h2o水溶液，加入油酸6ml和十八烯15ml，惰性气体保护下升温160℃，反应2h，除去体系中的空气和水，得到稀土油酸化合物；

(f)降至室温，加入nayf4:yb³⁺,er³⁺,nd³⁺的环己烷溶液，搅拌15min后加入naoh和nh4f的甲醇溶液，惰性气体保护下室温搅拌反应0.5h除去空气，升温100℃除去甲醇与环己烷，保温0.5h；

(g)惰性气体保护下升温300℃，反应1h，气体保护下缓慢降至室温，离心洗涤将得到的上转换纳米材料nayf4:yb³⁺,er³⁺,nd³⁺@nayf4:nd³⁺分散在苯乙烯中备用。

(2)nayf4:yb³⁺,er³⁺,nd³⁺@nayf4:nd³⁺@sio2的制备

(ⅰ)0.1mlco-520、6ml环己烷、4ml0.01m上转换纳米材料nayf4:yb³⁺,er³⁺,nd³⁺@nayf4:nd³⁺的环己烷溶液加入反应装置，搅拌混匀10min；

(ⅱ)向上述环己烷溶液中加入一定量光敏剂ce6，使其浓度为1mg/ml；

(ⅲ)加入0.4mlco-520和0.08mlnh3·h2o，乳化超声0.5h；

(ⅳ)加入0.04mlteos，室温搅拌反应48h；

(ⅴ)离心洗涤后分散在乙醇中，得到nayf4:yb³⁺,er³⁺,nd³⁺@nayf4:nd³⁺@ce6@sio2。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。