检测抗乳腺癌天然抗体的检测试剂、试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明属于免疫学技术临床应用领域，涉及用于检测抗乳腺癌天然抗体检测试剂、试剂盒及其应用方法。


背景技术：

2.恶性肿瘤是威胁人类健康的主要杀手之一。根据世界卫生组织最新公布的数据，全球每年新发癌症患者约两千万人左右,因癌症而死亡的人数高达九百万以上。中国的癌症新发病例数中居全球首位，每年新患癌症人数已接近500万。之前，肺癌一直是全球发病率最高的肿瘤；而2020年最新数据显示，乳腺癌患病人数达226万/年，其次是肺癌，新增患病人数220万/年。肺癌死亡率仍居首位，平均每年有180万人死于肺癌。尽管乳腺癌患者的生存期相对较长，死亡率仍然上升到了第五位，每年高达68万患者死于乳腺癌。其实，乳腺癌是女性人群最常见的恶性肿瘤，发病率在女性肿瘤患者中居首位。2020年，中国女性乳腺癌新发病例数为42万。虽然早期诊断和治疗技术不断提高，乳腺癌死亡率呈下降趋势，但由于化疗耐药问题难以解决，延长晚期病人生存期仍然是乳腺癌治疗的瓶颈，解决乳腺癌耐药问题是提高生存率的关键环节。
3.化疗在肿瘤治疗中的地位越来越重要。但是化学药物在杀伤肿瘤细胞的同时，还可能诱导肿瘤干细胞表达耐药蛋白，主要是三磷酸腺苷结合盒转运蛋白(atp-binding cassette transporters,abc转运蛋白)。这种转运蛋白能够介导多种底物分子在细胞内外跨膜转运。根据序列同源性及跨膜域拓扑结构，将abc转运蛋白分为7个亚家族(abc a-g)。迄今为止，在人类发现的abc家族已有49个成员，与药物转运相关的蛋白主要集中于abcb、abcc和abcg这几个亚家族中。研究发现，abc转运蛋白泵功能与降低肿瘤细胞内药物聚集有关，是肿瘤细胞产生耐药性的主要原因，成为肿瘤细胞免受化疗药物攻击的重要防御机制。abcc5属于abc转运蛋白超家族成员之一，这种转运蛋白能够结合三磷酸腺苷并利用能量驱动各种不同分子跨膜运转。进一步的研究表明，abcc5在乳腺癌细胞中高度表达，可能是乳腺癌细胞耐受化疗药物的重要原因。
4.目前临床靶向治疗肿瘤的热点仍然是单克隆抗体，如临床广泛应用的曲妥株单抗(trastuzumab)和贝伐株单抗(bevacizumab)。前者以上皮细胞生长因子二型受体(her2)为标靶，后者以血管内皮细胞生长因子a(vegf-a)为标靶。这两种单克隆抗体已成为临床治疗晚期肿瘤的重要手段。然而，由于副作用太大，只能做为三线治疗药物使用。此外，单克隆抗体用药时间过长会刺激免疫系统产生抗抗体，削弱单抗的治疗效果。
5.曲妥珠单抗主要用于治疗乳腺癌。它是一种重组dna衍生的人源化单克隆抗体，以her2为标靶，选择性地作用于her2的细胞外部位，阻止人体表皮生长因子与her2结合，从而阻断癌细胞的生长，或者刺激人体自身免疫细胞去摧毁癌细胞，即所谓的抗体依赖式细胞介导的细胞毒反应(adcc)。曲妥珠单克隆抗体已成为临床治疗晚期乳腺癌的重要手段。然而，曲妥珠单抗只有短期治疗效果，数月后会产生明显的耐药性。此外，曲妥珠单抗用药还会产生严重的副作用，如心脏毒性以及胃肠道反应等等。因此寻找更为安全有效的药物治
疗晚期乳腺癌已成为临床肿瘤领域的研究热点。
6.近来有关天然抗体的研究报道提示，人血中50％以上的抗体属于天然抗体，主要由b1淋巴细胞自动分泌产生,不需要特异性的抗原刺激。天然抗体参与机体的各种生理调节和免疫功能稳定,充当固有免疫和特异免疫系统之间的桥梁。值得注意的是，某些天然抗体具有免疫监视功能，随时清除体内形成的恶性变细胞,维持内环境稳定。因此，保持一定水平的天然抗体可以起到防癌作用。据此推论，天然抗体缺乏或阴性者发生肿瘤的风险可能明显高于正常人群。建立检测天然抗癌抗体方法有助于研发肿瘤发生发展规律，找到有效治疗肿瘤的方法。最近，青岛海兰深生物科技有限公司引进了人血浆天然抗癌抗体检测技术。项目研究发现，5％～10％的健康人血浆中富含天然抗癌抗体。通过实验室研究证明,富含天然抗癌抗体的健康人血浆可以明显地抑制多种癌细胞的生长与增殖，包括原发性肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、鼻咽癌及口腔癌等。此外研究中还发现，某些健康人血浆中含有较高水平的抗耐药蛋白的天然抗体。如果利用生物制品公司血浆库筛查出富含抗耐药蛋白的天然抗体血浆，并常规输注给正在接受化疗的中晚期肿瘤患者，或许可以预防交叉耐药性,提高化疗效果。对于延长中晚期肿瘤患者的生存时间，提高其生活质量具有重要的意义。


技术实现要素：

7.本发明提供一组用于检测人血浆中抗乳腺癌天然抗体浓度的线性抗原多肽，包含此多肽的检测试剂、试剂盒，以及使用所述抗原多肽检测人血浆中抗乳腺癌天然抗体的方法和应用。本发明的抗原多肽可用于制备酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,elisa)抗体检测试剂盒，及检测人血浆中抗乳腺癌天然抗体浓度，还可用于用于筛检人血浆样品中抗乳腺癌天然抗体，从富含抗乳腺癌天然抗体的人血浆提取、制备抗癌丙种球蛋白,并用于荷瘤动物模型研究。所述抗原多肽衍生自人乳腺癌相关的abcc5和her2蛋白序列，其中两条来自abcc5转运蛋白(seq id no:1和seq id no:2)，另外两条来自her2受体蛋白(seq id no:3和seq id no:4)。表1和表2所示的斜体和下划线区域代表组成所述抗原多肽的氨基酸序列。这些抗原多肽能够分别与人血浆中abcc5和her2天然抗体发生特异性结合。
8.表1.人abcc5蛋白序列
[0009][0010]
表2.人her2蛋白序列
[0011][0012]
本发明利用免疫信息学方法和表位制图技术，分析abcc5和her2蛋白序列上的人类白细胞二类抗原(human leukocyte antigen ii,hla-ii)表位和b细胞表位，甄别具有高度亲和力的氨基酸序列，进而设计能被绝大多数人类抗原提呈细胞识别的hla-ii限制性表位及线性抗原多肽。
[0013]
本发明提供了用以定性或定量检测人血浆中抗乳腺癌天然抗体浓度的抗原多肽，所述抗原多肽可以是单一多肽或复合多肽，可制备用于检测人血浆中抗乳腺癌天然抗体的试剂盒，这些抗原多肽能够与人血浆中的抗乳腺癌天然抗体发生特异性结合。
[0014]
已经公认，抗原抗体的结合主要发生在抗原决定簇(即抗原表位)与抗体结合位点之间。因此，两者在空间结构和构型上越接近完全互补，抗原抗体的结合就越稳定，特异性就越强，结合效率就越高，
[0015]
本发明根据蛋白表位的生物学特性，针对多个表位进行免疫信息学预测和模拟，经过分析与抗原性相关的各种参数，分别设计了四种在空间结构和构型上与人血浆中目标抗体完全互补的线性抗原多肽，其氨基酸序列见表3。
[0016]
表3.检测人血浆中abcc5和her2天然抗体的线性抗原多肽序列
[0017][0018]
本发明中，“天然抗体”与“自身抗体”可互换使用，是指自然存在于体内的，能识别目标物质(例如目标蛋白质，例如炎性细胞因子)的抗原表位的多种抗体(单克隆抗体和/或
多克隆抗体)混合物。本发明所定义的“抗乳腺癌天然抗体”是自然存在于人体内的，能识别乳腺癌相关蛋白，例如人atp结合盒转运蛋白c5(abcc5)和/或人表皮生长因子受体2(her2)的抗原表位的多种抗体(单克隆抗体和/或多克隆抗体)的混合物，例如可以是能识别乳腺癌相关蛋白，例如atp结合盒转运蛋白c5(abcc5)和/或人表皮生长因子受体2(her2)的抗原表位的天然igg抗体。在一些实施方案中，本发明的“抗乳腺癌天然抗体”也称抗abcc5和/或抗her2天然抗体，是指抗abcc5天然抗体或抗her2天然抗体，或者抗abcc5和her2天然抗体。在本发明的一些实施方案中，所述
““
抗乳腺癌天然抗体”是指能识别选自seq id no:1-4的任一个、任两个、任三个或四个多肽序列的抗体(单克隆抗体和/或多克隆抗体)的混合物。富含抗乳腺癌天然抗体的血浆可能具有治疗或预防乳腺癌的作用。此外，检测血浆中抗乳腺癌天然抗体的水平可以预测乳腺癌的发病风险，血浆中抗乳腺癌天然抗体水平偏低或阴性者乳腺癌的发病风险可能较高。而血浆中抗乳腺癌天然抗体水平偏低或阴性者可以通过定期输入富含抗乳腺癌天然抗体的血浆而预防乳腺癌。
[0019]
经固相化学法合成上述抗原多肽，可单独或经混合用于制备elisa抗体检测试剂盒，按设定的流程规范检测人血浆中抗乳腺癌天然抗体的浓度。包括上述一种、两种、三种或四种抗原多肽的检测试剂在实际应用中可制备成简单易用的便捷试剂盒，以玻璃、医用塑料等非金属材料真空密封包装，4度(4℃)环境下可保存6个月以上。简言之，将其中一种抗原多肽或两种、三种或四种抗原多肽的混合液包被在马来酰亚胺(maleimide)活化的96孔微量检测板，在40-45摄氏度(40-45℃)烤箱中干燥后，用非金属包装材料真空密封包装，制成试剂盒。优选地，所述两种、三种或四种抗原多肽的混合液是所含两种、三种或四种抗原多肽的质量体积浓度比为1:1、1:1:1或1:1:1:1的混合物。优选地，任何一种、两种、三种或四种抗原多肽均为纯度》95％的制品。
[0020]
因此，根据本发明之一，提供了用于检测abcc5和her2天然抗体的检测试剂，其中包含选自如下四种抗原多肽中的任意一种、两种、三种或四种：
[0021]
h-glsldasmhsqlrildskfrrtrplecg
–
oh(seq id no:1)；
[0022]
h-dyhhglsalkpirttskhqhpvdnaglfscd-oh(seq id no:2)；
[0023]
h-dllallppgaastqvctgtdmklrlpas-oh(seq id no:3)；和
[0024]
h-kvarcpsgvkpdlsympiwkfpdeegah-oh(seq id no:4)。
[0025]
在一些实施方案中，所述检测试剂由选自所述四种抗原多肽中的任意一种、任意两种、任意三种或四种抗原多肽组成。
[0026]
在一些实施方案中，所述四种抗原多肽中的任意一种、任意两种、任意三种或四种抗原多肽均为高纯度制品，优选为纯度》95％的化学合成制品。
[0027]
在一些实施方案中，所述四种抗原多肽中的任意一种、任意两种、任意三种或四种抗原多肽可以混合使用，在混合使用时，所述任意两种、任意三种或四种抗原多肽可以相等的质量比例混合。因此，在一些实施方案中，所述检测试剂是所述任意两种、任意三种或四种抗原多肽的混合物，例如可以是混合液。在一些实施方案中，所述检测试剂中任意两种、任意三种或四种抗原多肽的比例为1:1、1:1:1或1:1:1:1(质量比)。
[0028]
根据本发明的另一个方面，提供一种包含上述检测试剂的试剂盒。
[0029]
在一些实施方案中，所述试剂盒包括微量检测板，所述检测试剂被包被在微量检测板的孔内。
[0030]
在一些实施方案中，在所述试剂盒中，将包被有上述检测试剂的微量检测板干燥后，用非金属医用包装材料真空密封包装。在一些实施方案中，所述微量检测板是马来酰亚胺(maleimide)活化的96孔微量检测板。
[0031]
在一些优选的实施方案中，所述非金属医用包装材料为玻璃或医用塑料。
[0032]
在另一些实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。在一些实施方案中，阳性对照和/或阴性对照被包被在微量检测板上。阳性对照又可以称为阳性标准品，例如可以是抗人abcc5抗体或抗人her2抗体或二者的混合物，阴性对照例如可以是任何不含有乳腺癌相关蛋白的抗体，例如抗人abcc5抗体或抗人her2抗体或二者的试剂，例如白蛋白溶液。
[0033]
根据本发明的另一个方面，提供一种使用上述检测试剂或上述试剂盒检测待测样品中抗乳腺癌天然抗体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使用上述检测试剂通过抗原抗体结合反应检测待测样品中的抗abcc5和/或抗her2天然抗体的水平。所述方法优选是在体外进行的，并且目的是获得检验数据本身而不以诊断为目的。
[0034]
在一些实施方案中，所述方法包括使所述检测试剂与待测样品中的抗abcc5和/或抗her2天然抗体之间发生抗原抗体结合反应，以及确定待测样品中的抗abcc5和/或抗her2天然抗体的水平。利用抗原多肽通过抗原抗体结合反应检测或确定待测样品中的抗体水平的技术在本领域是众所周知的，例如酶联免疫吸附测定(elisa)方法。在优选的实施方案中，在上述方法中通过酶联免疫吸附测定(elisa)方法检测或确定待测样品中抗abcc5和/或抗her2天然抗体的水平。
[0035]
在更优选的实施方案中，所述酶联免疫吸附测定为夹心法elisa。
[0036]
在一些实施方案中，所述方法的实施步骤包括：(1)在适合于上述检测试剂与待测样品中的抗abcc5和/或抗her2天然抗体之间发生抗原抗体结合反应的条件下使上述检测试剂分别与待测样品、阴性对照和阳性对照混合孵育，然后加入酶标二抗并孵育，之后加入显色剂，显色后终止反应并检测光密度值(od)；(2)判定抗abcc5和/或抗her2天然抗体的水平。所述水平可以是相对水平，例如待测样品中抗abcc5和/或抗her2天然抗体相对于阳性对照的相对水平。
[0037]
在一些实施方案中，用阳性样品比值(psr)判定抗abcc5和/或抗her2天然抗体的相对水平。在一些实施方案中，psr计算公式为：
[0038]
psr＝[待测样品od值
–
nc od值]/[阳性对照od值
–
nc od值]
[0039]
其中nc为阴性对照。用psr平均值和标准差表示样品(例如血浆)中的抗体浓度。
[0040]
在一些实施方案中，可以设定抗abcc5和/或抗her2天然抗体阳性样品和阴性样品阈值。使用正常人群的样品检测结果，并通过百分位数法确定抗abcc5和/或抗her2天然抗体阳性样品和阴性样品的阈值。样品检测结果高于阳性样品阈值为阳性，表示样品中抗abcc5和/或抗her2天然抗体含量较高，此时阳性样品即为富含抗abcc5和/或抗her2天然抗体的血浆，可用于治疗乳腺癌。确定阳性样品阈值可以使用例如第95百分位数法、第90百分位数法等。样品检测结果低于阴性样品阈值为阴性，表示样品中抗abcc5和/或抗her2天然抗体含量较低，乳腺癌的发病风险可能较高。确定阴性样品阈值可以使用例如第5百分位数、第10百分位数等。在一些实施方案中，所述正常人群可以是正常成年人。正常人群也可以被称为健康人群，是指是临床体检确定的未曾患有乳腺癌的人群。应当理解，阳性样品阈
值和阴性样品阈值的确定是为了筛选出抗abcc5和/或抗her2天然抗体含量相对较高或含量相对较低的样品，因此在确定阈值时不限于特定的正常人群，亦不限于特定的百分位数。例如，检测时可以使用已有的正常人群检测结果，也可以使用新的一组正常人群的样品进行检测。正常人群中的个体数量可以任意选择，只要其检测结果具有统计学意义，例如可以是不低于50个、不低于100个、不低于200个等。在不同情况下，可以根据不同需要设置不同的阈值，以用于不同的目的。
[0041]
本领域技术人员容易获知适合于检测试剂与待测样品中的抗abcc5和/或抗her2天然抗体之间发生抗原抗体结合反应的条件，例如可以根据常规的抗原抗体反应条件和/或常规实验可以获知。
[0042]
在一些实施方案中，上述步骤(1)中的混合孵育包括将上述检测试剂包被在马来酰亚胺(maleimide)活化的微量检测板上，并在所述微量检测板的孔中加入待测样品。
[0043]
在一些实施方案中，所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗人igg抗体，在一些实施方案中，所述显色剂是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)。在一些实施方案中，使用硫酸溶液终止反应，硫酸溶液的浓度优选为10-12％(体积/体积比)。在一些实施方案中，光密度(od)值的检测波长为450nm，参考波长为630nm。
[0044]
在一些实施方案中，所述样品为人血浆。在一些实施方案中，所述样品为健康人或正常人血浆。在一些实施方案中，所述样品更优选为单一个体血浆。所述健康人或正常人可以是临床体检确定的未曾患有乳腺癌的人。在一些实施方案中，个体血浆为来自单一健康个体或单一正常个体的血浆。
[0045]
在更优选的实施方案中，上述步骤(1)包括：
[0046]
将表1中所列四种抗原多肽分别用67％乙酸溶解为5毫克/ml储存液,放置-20℃冰箱中保存，可以单独放置或将四种储液等体积混合后放置；
[0047]
将单独储存液或混合液用包被液稀释为10～50微克/ml的工作液，该包被液为含0.15m氯化钠和10mm edta的0.1m磷酸盐缓冲液，ph值为7.0～7.4之间；
[0048]
用工作液包被马来酰亚胺(maleimide)活化的96孔微量检测板，4℃过夜孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液为含0.15m氯化钠和0.1％tween-20的0.1m磷酸盐缓冲液，ph值为7.0～7.4之间；
[0049]
待测血浆样品设双复孔，另设2个阴性对照(nc)孔(为不含抗abcc5抗体和抗her2抗体的阴性对照液，如牛血清白蛋白，藉此可反映表3所述的四种多肽抗原在抗abcc5和her2天然抗体阴性反应体系中的实验指标值)和2个阳性对照(pc)孔(为抗人abcc5和her2抗体的混合物，藉此可反映表3所述的四种多肽抗原在抗abcc5和her2天然抗体阳性反应体系中的实验指标值)；
[0050]
用分析液将待测血浆样品1:100-200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，即含0.15m氯化钠和10mm edta的0.1m磷酸盐缓冲液，ph值为7.0～7.4之间，每孔加100μl；20-25℃孵育1-2小时，然后洗板3遍；
[0051]
用分析液(即含0.15m氯化钠和10mm edta的0.1m磷酸盐缓冲液，酸碱度为7.0～7.4之间)稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人igg抗体(用以验证血浆中被检测的物质是否是特异性抗体)，抗体稀释比例为1:10000～1:50000，每孔加100μl，20-25℃孵育1-2小时；
[0052]
用洗液(即含0.15m氯化钠和0.1％tween-20的0.1m磷酸盐缓冲液，ph值为7.0～
7.4之间)洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)，室温避光20～30分钟；
[0053]
每孔加50μl终止液12％硫酸溶液(12％h2so4)，然后用酶标仪检测光密度(od)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm，检测过程在加入终止液后10分钟内完成，由此相对定量分析不同个体血浆中抗abcc5和her2天然抗体的水平。
[0054]
在一些实施方案中，可以针对乳腺癌患者体外检测血浆中抗abcc5天然抗体和/或抗her2天然抗体的水平，在进行群体随机抽样分析时，针对每一个体检测所得数据进行分析。
[0055]
在本发明的另一个方面，提供上述检测试剂或试剂盒在检测样品中抗abcc5天然抗体和/或抗her2天然抗体中的应用。在一些实施方案中，所述应用是体外的、非诊断目的。
[0056]
在本发明的另一个方面，还提供上述检测试剂在制备用于检测样品中抗abcc5天然抗体和/或抗her2天然抗体的试剂中的应用。
[0057]
在优选的实施方案中，所述样品为人血浆，更优选为单一个体血浆。
[0058]
在更优选的实施方案中，个体血浆为来自健康个体的血浆。
[0059]
在本发明的另一个方面，还提供上述检测试剂或试剂盒在筛选富含抗abcc5天然抗体和/或抗her2天然抗体的人血浆中的应用。
[0060]
除非另外指出，本发明所述的抗原多肽序列从左至右为从n端到c端。
[0061]
基于以上方案，本发明提供了一种精度高、操作简易、成本适中的抗abcc5天然抗体和/或抗her2天然抗体检测技术，并在此基础上，进一步提供了对抗abcc5天然抗体和/或抗her2天然抗体的半定量(或相对定量)的分析和应用方案，进而为为发展基于健康人血浆抗abcc5和her2天然抗体的技术开发和应用，例如预测乳腺癌的发病风险和发展全新且副作用低的免疫治疗策略奠定重要基础。
[0062]
本发明的检测体系是一种精准的相对定量方法，能够以合理的成本检测血浆中抗abcc5天然抗体和/或抗her2天然抗体,将在富含抗abcc5天然抗体和/或抗her2天然抗体血浆和富含抗abcc5天然抗体和/或抗her2天然抗体丙种球蛋白在低毒副作用抗乳腺癌领域运用起关键作用。
[0063]
综上，本发明发现了一种简便的人血浆抗abcc5和/或抗her2天然抗体检测手段，可用于定性或相对定量检测抗abcc5和/或抗her2天然抗体水平，辅助量化测定不同个体血浆抗abcc5和/或抗her2天然抗体水平，区分富含抗abcc5和/或抗her2天然抗体(强阳性)和低含或不含抗abcc5和/或抗her2天然抗体(阴性)的血浆。可以推断，富含抗abcc5和/或抗her2天然抗体的血浆对乳腺癌可能有防治作用。由于本发明的抗原多肽合成手段相对简单而成本适中，为下一步应用富含抗abcc5和/或抗her2天然抗体血浆防治乳腺癌和评估血浆抗abcc5和/或抗her2天然抗体阴性个体的乳腺癌发病风险的临床实践奠定了重要基础。此外，用本发明产品检测出的血浆抗abcc5和/或抗her2天然抗体阴性个体，是否具有较高的乳腺癌发病风险，可以对其进行临床随访和追踪，进而得到肯定性的结论，达到早期实施防治的目的。本发明的抗abcc5和/或抗her2天然抗体检测方法还可用于乳腺癌生物学研究，探讨乳腺癌发生机制、瘤细胞免疫“逃逸”机制及免疫监视机制等。
[0064]
附图描述
[0065]
图1是乳腺癌细胞活度实验结果，其中a是针对乳腺癌细胞株bt-474的结果，b是针对乳腺癌细胞株sk-br-3的结果。
[0066]
本发明的其它特征和优点将在随后的实施例说明中阐述，并且部分地从说明中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的主要目的和其它优点可通过实施例说明、权利要求中所特别指出的方案来实现和获得。
实施例
[0067]
以下在具体实施方案中，以表3中所列四种抗原多肽的1:1:1:1混合液作为检测试剂具体说明本发明技术方案。
[0068]
1、健康人血浆抗abcc5和her2天然抗体筛查
[0069]
在广东省某血站筛查健康献血者血浆样品中抗abcc5和her2天然抗体水平。本实验所采用的四条多肽抗原(见表3)系应用化学固相合成，纯度为95％，具体进行如下操作步骤：
[0070]
(1)操作前，每种抗原多肽用67％乙酸溶解为5.0mg/ml储存液,然后等重量体积混合并放置-20摄氏度冰箱中保存。
[0071]
(2)操作开始时，首先用包被液将抗原混合液稀释为20微克/ml的工作液，该包被液为含0.15m氯化钠和10mm edta的0.1m磷酸盐缓冲液，测得酸碱度(ph值)为7.2。
[0072]
(3)用工作液包被在马来酰亚胺(maleimide)活化的96孔检测板(thermo scientific,美国)，4摄氏度过夜孵育15小时后，用洗液洗板3遍,所述洗液为含0.15m氯化钠和0.1％tween-20的0.1m磷酸盐缓冲液，测得酸碱度ph值为7.2。
[0073]
(4)然后分步加样分析如下：
[0074]
a)待测血浆样本检测均设双复孔，另设2个阴性对照孔(nc，参照物为牛血清白蛋白(sigma-aldrich公司提供)和2个阳性对照孔(pc，参照物为抗人abcc5和her2抗体的混合物，由sigma-aldrich公司提供)。
[0075]
b)用分析液将血浆1:200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，为含0.15m氯化钠和10mm edta的0.1m磷酸盐缓冲液，测得酸碱度(ph)为7.2，每孔加100μl，室温孵育1.5小时。
[0076]
c)以前述洗液(即含0.15m氯化钠和0.1％tween-20的0.1m磷酸盐缓冲液，测得酸碱度为7.2)洗板3遍后，用分析液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人igg(由sigma-aldrich公司提供)，稀释比例为1:30000，每孔加100μl，室温孵育1.5小时。
[0077]
d)以前述洗液(即含0.15m氯化钠和0.1％tween-20的0.1m磷酸盐缓冲液，测酸碱度ph值为7.2)洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)(life technologies公司提供)，室温避光孵育25分钟。
[0078]
e)每孔加50μl终止液12％硫酸溶液(12％h2so4)，然后用酶标仪检测光密度(od)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm，加入终止液后10分钟内检测完毕，后续步骤将依据此结果针对每一个体进行abcc5和her2天然igg抗体的定量对比分析。
[0079]
3.天然igg抗体阳性与阴性血浆
[0080]
针对前述检测所得数据进行分析时，采用阳性样品比值(positive sample ratio，psr)判定血浆中abcc5和her2天然igg抗体水平，psr计算公式为：psr＝[待测样品od值
–
od
nc
值]/[阳性对照od值
–
od
nc
值]，nc为各样本的阴性对照。
[0081]
通过筛查100份健康人血浆，选出psr值最高和最低的血浆各两份，在过滤灭菌时
分别混合，从而获得高抗体混合血浆(阳性血浆)和低抗体混合血浆(阴性血浆)，分装后在-20度冰箱中保存，用于细胞培养之前室温解冻。
[0082]
4.乳腺癌细胞活度实验
[0083]
由于曲妥珠单抗也是以her2为靶点的单抗药物，所以选择曲妥珠单抗作比较。选择乳腺癌细胞株bt-474和sk-br-3细胞(由国家生物医学实验细胞资源库国家实验细胞资源共享服务平台提供)进行活度实验。分别用含10％胎牛血清的imdm培养基(gibco公司提供)(bt-474细胞另加0.01mg/ml的胰岛素)在96孔培养板上培养bt-474和sk-br-3细胞，每孔接种3000个细胞/100微升，每组血浆处理的细胞接种9个复孔。细胞在37度(℃)和5％二氧化碳(co2)条件下培养24小时，然后去除上清液，分别加入100微升含有20％人阴性和阳性血浆的imdm培养基、另外有一组细胞加入20％阴性血浆和曲妥珠单抗(由罗氏公司提供)，继续培养48小时，试剂空白孔仅加入100微升细胞培养基。为了检测细胞活度，加入10微升cck-8细胞计数液(sigma-aldrich公司提供)，再孵育2小时后用96孔读扳机在450nm波长检测光密度(od)值,并计算细胞活度。细胞活度＝[实验组血浆od值
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空白od值]/[阴性血浆od值
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空白od值]。如表4和图1所示,富含抗乳腺癌抗体的健康人血浆对bt-474和sk-br-3细胞活度均具有显著的抑制作用，而曲妥珠单抗仅对bt-474细胞活度有抑制作用且作用效果不及人阳性血浆。
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表4.富含抗乳腺癌抗体的健康人血浆对bt-474和sk-br-3细胞活度的影响
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注：血浆组1为阴性血浆，血浆组2为阴性血浆+曲妥珠单抗，血浆组3为阳性血浆，每组9个复孔，t检验自由度为16。
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以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。