一种同时测定色氨酸和犬尿氨酸含量的方法与流程

1.本发明属于生物化学领域，具体涉及一种同时测定色氨酸和犬尿氨酸含量的方法。


背景技术：

2.色氨酸(tryptophan，trp)是人体必需的氨基酸。摄入体内的trp主要经犬尿氨酸代谢通路代谢，其中犬尿氨酸(kynurenine，kvn)是该代谢途径中最为重要的中间代谢产物之一。犬尿氨酸途径下产生大多数代谢物是神经活性的，这些代谢物在调节n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体功能和自由基的产生中具有重要作用。而nmda受体与多种神经退行性疾病有关，如亨帕金森症、阿尔茨海默病、抑郁症等。此外，自由基以及兴奋性氨基酸的产生还可破话脑内细胞，加重卒中状态下的脑损伤。脑脊液是存在于脑室及蛛网膜下腔的一种无色透明的液体，其中包含大量脑组织的代谢物，能够反应脑内代谢情况。所以，研究色氨酸以及犬尿氨酸在大鼠脑脊液中的含量对心脑血管疾病以及中枢神经系统疾病研究有着重要的意义。
3.由于犬尿氨酸分子结构较小，使用高效液相色谱质谱联用法(hplc ms/ms)，在质子撞击后产生的片段也较小，而对检测的选择性和灵敏度造成影响，且由于设备昂贵，检测成本高，不适用广泛应用。
4.专利cn101776662a公开了一种犬尿氨酸的检测方法，其使用的高效液相色谱荧光法(hplc-fld)则由于犬尿氨酸本身不能产生荧光，须采用在线衍生的方法，较为复杂，重现性较差。
5.现有技术色谱条件主要针对大鼠血清、脑组织、肠组织中色氨酸或犬尿氨酸色氨酸含量。《高效液相色谱紫外法测定血清犬尿氨酸及色氨酸及其临床应用》(王瑞，2006)报道了一种利用高效液相色谱-紫外检测法(hplc-uv)检测血清中犬尿氨酸和色氨酸的方法。由于symmetry shield c18柱对犬尿氨酸这种碱性物质保留时间较长，且脑脊液成分较复杂，易受杂质影响，无法实现在大鼠脑脊液中同时检测犬尿氨酸和色氨酸。
6.脑脊液是颅腔内固有的内容物之一，脑脊液运走脑组织的代谢产物，调节着中枢神经系统的酸碱平衡，所以其中包含代谢产物及炎性渗出物，尤其是脑内代谢物较多，较血液样品干扰大。主要技术难度在于脑脊液包含多种脑内代谢物，脑脊液体积小造成代谢物浓度大，杂质影响大；酸碱度处于动态变化中，对样品ph有所影响，常规酸沉淀或达不到理想效果，已有分析方法难以准确分析。而血清较脑脊液稳定，代谢物浓度相对低，且成分较为稳定，已有常规分析方法可处理。
7.由于现有技术尚未有关于大鼠脑脊液色氨酸或犬尿氨酸含量同时测定的报道，故亟需一种准确可靠的检测方法，对脑脊液中色氨酸和犬尿氨酸含量进行同时检测，以对相关的病理和药学研究提供科学依据。


技术实现要素：

8.针对现有技术中尚无在大鼠脑脊液中同时测定犬尿氨酸和色氨酸含量的方法的技术缺陷，本发明提供一种同时测定色氨酸和犬尿氨酸含量的方法。本发明所述的方法可以实现在大鼠脑脊液中同时测定色氨酸和犬尿氨酸的含量，准确可靠，简单易行，且检测限优异，弥补了现有对大鼠脑脊液中犬尿氨酸和色氨酸含量的检测能力不足的缺点。
9.为克服上述技术缺陷，本发明提供了一种同时测定色氨酸和犬尿氨酸含量的方法，其特征在于，所述方法使用hplc-uv仪，测定的样品为大鼠脑脊液，所述方法包括如下条件：
10.色谱柱：kromasil 100-5-c18；
11.流动相：水相为甲酸铵溶液，有机相为甲醇；
12.紫外检测波长：用225nm检测犬尿氨酸，279nm检测色氨酸。
13.较佳地，所述甲酸铵溶液的浓度为3-8mmol/l，优选为5mmol/l。
14.本发明中，所述hplc-uv为高效液相色谱-紫外检测。
15.本发明中，所述色谱柱kromasil 100-5-c18由瑞典eka chemicals公司生产。
16.本发明中，所述色氨酸和犬尿氨酸分别为l-色氨酸和l-犬尿氨酸。
17.在一较佳实施例中，所述有机相和所述水相的体积比为10:90-40:60，优选为20:80。
18.较佳地，所述色谱柱的柱温为30-50℃，优选为45℃。
19.较佳地，所述样品的进样体积为5-20μl，优选为10μl。
20.较佳地，所述样品的流速为0.5-3ml/min，优选为1.0ml/min。
21.较佳地，所述hplc-uv仪为thermo-dionex生产的ultimate 3000高效液相色谱仪。
22.在一较佳实施例中，所述方法的条件具体为：
23.色谱柱：kromasil 100-5-c18；
24.流动相：水相为5mmol/l甲酸铵溶液，有机相为甲醇，所述有机相和所述水相的体积比为20:80；
25.所述色谱柱的柱温为45℃；
26.所述样品的流速为1.0ml/min；
27.所述样品的进样体积为10μl；
28.紫外检测波长：用225nm检测犬尿氨酸，279nm检测色氨酸；
29.所述hplc-uv仪为thermo-dionex生产的ultimate 3000高效液相色谱仪。
30.更佳地，所述方法还包括在检测前，按如下步骤制备所述样品：所述大鼠脑脊液用冰甲醇处理后，获取上清液即得所述样品。优选地，所述大鼠脑脊液与所述冰甲醇按体积比1:3混合后，使杂质沉淀获取所述上清液。更优选地，所述混合为涡旋30s，所述沉淀为使用离心机13000rpm离心8min。
31.在一具体实施例中，所述上清液经过滤获得所述样品。
32.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
33.本发明所用试剂和原料均市售可得。
34.本发明的积极进步效果在于：
35.本发明提供的一种同时测定色氨酸和犬尿氨酸含量的方法，可同时快速测定大鼠脑脊液中色氨酸和犬尿氨酸含量，且流动相使用较少的缓冲盐，无须调ph，对仪器损坏少；样品处理简单，所用沉淀剂为甲醇，成本低。所述方法本发明的检测限改善，犬尿氨酸为0.003μg/ml，色氨酸为0.0125μg/ml。
附图说明
36.图1为实施例1测得的犬尿氨酸标准曲线；
37.图2为实施例1测得的色氨酸标准曲线；
38.图3为实施例1测得的色氨酸色谱图；
39.图4为实施例1测得的犬尿氨酸色谱图；
40.图5为对比例1对大鼠脑脊液样品检测的色谱图。
具体实施方式
41.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
42.所用动物：sd大鼠，280-350g，雄性，上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号码：scxk(沪)2017-0005，spf级。
43.仪器：ultimate 3000高效液相色谱仪(thermo-dionex)；5415r型全自动高速冷冻离心机(德国艾本德公司)；mixmate涡旋仪(德国艾本德公司)；色谱柱kromasil 100-5-c18购自瑞典ekachemicals公司。
44.实施例1大鼠脑脊液中犬尿氨酸和色氨酸含量的测定
45.1、大鼠脑脊液的制备
46.方法为本领域常规，本发明具体所用方法如下：
47.大鼠经麻醉后采用直接穿刺小脑延髓池法：将大鼠固定在立体定位仪上，在大鼠两耳之间作水平切口，之后沿中线向颈部作竖直切口，钝性剥开菱形肌，剪断夹肌内侧二分之一，用止血钳拉开夹肌端，随即使用1ml注射器从正中线枕骨棘下约3mm处推动，直至有落空感，缓慢抽取脑脊液，约100μl后抽出针头，脑脊液移入1.5ml离心管中，置于-80℃保存。
48.2、hplc-uv检测方法
49.色谱柱：kromasil 100-5-c18；
50.流动相：水相为5mmol/l甲酸铵溶液，有机相为甲醇，体积百分比为甲醇:5mmol/l甲酸铵＝20:80；
51.流速：1.0ml/min；
52.柱温：45℃；
53.进样体积：10μl；
54.紫外检测器(uv)波长：犬尿氨酸使用225nm，色氨酸使用279nm。
55.3、标准曲线制作
56.精密称取适量l-犬尿氨酸(购自sigma aldrich，批号bcbx8788，纯度98％)和l-色氨酸(购自sigma aldrich，批号wxbd954v，纯度98％)，
57.用甲醇-水溶液(甲醇:水＝1:1)溶解后，得到1mg/ml的l-犬尿氨酸和l-色氨酸的储备液，然后各取储备液适量，用甲醇-水溶液(甲醇:水＝1:1)溶液稀释，配制成l-犬尿氨酸浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、1.2、1.6、2.4μg/ml，l-色氨酸浓度为1.25、2.5、5、7.5、15、20、30μg/ml的溶液。
58.经第2步中hplc-uv的方法测定，得
59.犬尿氨酸(kyn)的标准曲线：y＝8.943x+0.2026，r2＝0.999，如图1所示；
60.色氨酸(trp)的标准曲线：y＝0.1804x+0.0262，r2＝0.9993，如图2所示。
61.4、样品处理
62.精密吸取50μl大鼠脑脊液置于离心管中，加入150μl冰甲醇沉淀后(即大鼠脑脊液与冰甲醇的体积比为1:3)，涡旋30s后置于离心机中13000rpm离心8分钟，将上清液过滤，过滤后的上清取100μl用于进样检测，检测方法如第2步中hplc-uv方法所示。处理全过程避光操作。利用ultimate 3000高效液相色谱仪的两个uv检测通道分别以设定波长检测样品中色氨酸和犬尿氨酸，得到色氨酸和犬尿氨酸的色谱图，见图3和图4。
63.5、结果计算
64.经测量，色氨酸的吸光度值为0.650，出峰时间为5.640min，根据标准曲线计算浓度为3.459μg/ml；
65.经测量，犬尿氨酸的吸光度值为2.679，出峰时间为5.627min，根据标准曲线计算浓度为0.277μg/ml。
66.6、检测限
67.本实施例中定量限为犬尿氨酸0.1μg/ml，色氨酸为1.25μg/ml。在犬尿氨酸定量下限处测得信噪比为33，在色氨酸定量下限处测得信噪比为100，按照信噪比为3求出检测限，犬尿氨酸为0.003μg/ml，色氨酸为0.0125μg/ml。
68.对比例1现有hplc-uv法检测大鼠脑脊液中犬尿氨酸和色氨酸含量
69.大鼠脑脊液的制备同实施例1，样品处理和检测方法参照《高效液相色谱紫外法测定血清犬尿氨酸及色氨酸及其临床应用》(王瑞，2006)。
70.从冰箱中取出脑脊液样品后，室温解冻，取200μl脑脊液样品置于离心管中，加入等量5％(v/v)高氯酸溶液，涡旋混匀30s后，室温放置10-15min，然后10000r/min离心5min，取上清液分析。
71.色谱条件：
72.色谱柱：kromasil 100-5-c18；
73.流动相：15mmol/l乙酸钠-含乙腈的乙酸(含2.7％乙腈，ph 3.6)
74.流速：1.0ml/min；
75.进样体积：20μl；
76.柱温：室温；
77.紫外检测器(uv)波长：225nm。
78.结果：使用对比文件方法无法测得犬尿氨酸或者色氨酸，见图5，无法同时检测大鼠脑脊液中犬尿氨酸和色氨酸的含量。