一种中性粒细胞胞外诱捕网的快速检测方法与流程

本发明涉及医学检验技术领域，特别涉及一种中性粒细胞胞外诱捕网的快速检测方法。

背景技术：

nets（中性粒细胞胞外诱捕网）是由中性粒细胞受到刺激活化后释放到胞外的一种网状结构，以dna为骨架，其间镶嵌有组蛋白、髓过氧化物酶(mpo)、中性粒细胞弹性蛋白酶(ne)、组织蛋白酶g、钙网蛋白、蛋白酶3等具有杀菌和增加通透性作用的蛋白。nets主要依靠其独特的三维网状结构捕获病原体，并依靠包含的大量抗菌蛋白对病原体进行杀灭，同时nets对病原体的捕捉固定可以增强其他白细胞的吞噬作用。nets释放发挥其抗菌作用后，可被血浆dna酶和巨噬细胞快速清除。在各种生理或病理条件下，若nets不能正常生成，或生成太多，或生成后不能及时被降解，则会导致疾病的发生。

nets由于在固有免疫中承担了重要的作用，一直以来是中性粒细胞功能研究的热点。然而由于其自身特殊性，nets检测也一直是中性粒细胞研究的一个难点。虽然有多种方式已报道可用于nets的检测，但其检测的金标准尚未完全确立。目前比较主流的方式是使用荧光显微镜通过对中性粒细胞胞膜外dna与中性粒细胞分泌的蛋白共定位来确认nets。该方法虽然可以比较准确的检测到nets，但仍旧存在主观性强且不能准确定量等缺点。也有部分研究人员尝试使用流式细胞术来检测nets，但是这些方法或受制于实验流程繁琐或受制于实验材料的特殊（例如某些实验室自配试剂或染料）均未获得广泛的接受或开展。

cn108362871a公开了一种用于中性粒细胞胞外诱捕网检测的试剂盒及检测方法，其需要使用一抗和二抗，存在的问题为：1.检测过程复杂，例如每次实验需要添加荧光二抗，同时整个检测过程需要添加固定剂并多次洗涤步骤，成本高，速度慢，整个过程约需要2-3小时。2.实验过程受影响因素较多，如添加二抗结合一抗环节极易受环境和人为因素干扰，检验均一性不容易保证。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种中性粒细胞胞外诱捕网的快速检测方法，能够对中性粒细胞受到刺激后生成的nets进行定性和定量分析，检测结果稳定，重复性好，检测步骤简单，检测过程短，仅需45分钟即可完成。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种中性粒细胞胞外诱捕网的快速检测方法，包括以下步骤：

（1）预刺激：将具有调理作用的大肠杆菌或佛波酯加入至待测样品中，37±1℃，5%co2培养箱刺激培养1-3小时；本步骤用于诱导产生nets；

（2）孵育：向步骤（1）处理后的待测样品中加入抗人fitc-mpo抗体和dna特异性荧光染料，室温孵育30-32分钟；

（3）检测：向步骤（2）处理后的待测样品中加入红细胞裂解液，裂解15-18分钟后，直接上流式细胞仪检测，其中fitc通道检测mpo表达，apc通道检测dna特异性荧光染料表达，双阳性定义为胞外诱捕网表达，从而实现对胞外诱捕网的定性和定量分析。

现有技术普遍采用二抗结合一抗的方式检测nets，检测过程复杂，成本高，速度慢，易受到干扰。针对此问题，发明人期望探索获得一种改进的方法以节约步骤、缩短时间、抗干扰，降低成本，为此，发明人不断进行尝试和探索，终于发现了稳定的mpo直标抗体并结合sytoxred或sytoxblue来检测nets，改进检测流程，从而大大缩短检测时间，最短可45分钟完成检测，不易受干扰且步骤少，成本低。二抗链接一抗受检测环境影响不稳定，而mpo直标抗体则完全避免此问题，且为商业化抗体，检测结果稳定可靠。

本发明使用抗人fitc-mpo抗体和sytoxred或sytoxblue染料组合，通过流式细胞仪检测人外周血中性粒细胞nets表达能力。

红细胞裂解液用量为每100微升待测样品加500-1000微升。

作为优选，步骤（1）中，具有调理作用的大肠杆菌的终浓度为1-2×10⁸cfu/ml。具有调理作用的大肠杆菌的诱导效果要明显优于佛波酯。

作为优选，步骤（1）中，佛波酯的终浓度为1.3-1.4μmol/l。

作为优选，步骤（2）中，抗人fitc-mpo抗体用量为每100微升待测样品加20-25微升。

作为优选，步骤（2）中，dna特异性荧光染料加入后的终浓度为10-12nmol/l。

作为优选，所述dna特异性荧光染料为sytoxred或sytoxblue。

一种中性粒细胞胞外诱捕网的快速检测试剂盒，包括具有调理作用的大肠杆菌或佛波酯，抗人fitc-mpo抗体，dna特异性荧光染料及红细胞裂解液。

本发明的有益效果是：

1、检测结果稳定，重复性好；

2、实现快速的检测，省去了固定及多重洗涤步骤，整个检测过程最短用时在45分钟。

附图说明

图1是本发明流式细胞检测结果图。

图2是本发明的成像流式图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

抗人fitc-mpo抗体购自美国biolegend公司，为其生产的fitcanti-humanmpoflowkit试剂盒中的一个试剂。sytoxred，sytoxblue购自美国biolegend公司。流式细胞仪为美国bd公司流式细胞仪facscantoii。红细胞裂解液购自beckmancoulter。具有调理作用的大肠杆菌购自厂家glycotopebiotechnology，产品phagoburst中的一种试剂。

实施例1：

一种中性粒细胞胞外诱捕网的快速检测方法，包括以下步骤：

（1）预刺激：将具有调理作用的大肠杆菌加入至待测样品（人全血）中，至终浓度为1×10⁸cfu/ml，37±1℃，5%co2培养箱刺激培养3小时；

（2）孵育：向步骤（1）处理后的100微升待测样品中加入抗人fitc-mpo抗体20微升和sytoxred，sytoxred终浓度为10nmol/l，室温孵育30分钟；

（3）检测：向步骤（2）处理后的待测样品中加入红细胞裂解液500微升，裂解15分钟后，直接上流式细胞仪检测，其中fitc通道检测mpo表达，apc通道检测dna特异性荧光染料表达，双阳性定义为胞外诱捕网表达，从而实现对胞外诱捕网的定性和定量分析。

实施例2：

一种中性粒细胞胞外诱捕网的快速检测方法，包括以下步骤：

（1）预刺激：将具有调理作用的大肠杆菌加入至待测样品（人全血）中，至终浓度为2×10⁸cfu/ml，37±1℃，5%co2培养箱刺激培养1小时；

（2）孵育：向步骤（1）处理后的100微升待测样品中加入抗人fitc-mpo抗体25微升和sytoxblue，sytoxblue终浓度为12nmol/l，室温孵育32分钟；

（3）检测：向步骤（2）处理后的待测样品中加入红细胞裂解液1000微升，裂解18分钟后，直接上流式细胞仪检测，其中fitc通道检测mpo表达，apc通道检测dna特异性荧光染料表达，双阳性定义为胞外诱捕网表达，从而实现对胞外诱捕网的定性和定量分析。

实施例3：

一种中性粒细胞胞外诱捕网的快速检测方法，包括以下步骤：

（1）预刺激：将佛波酯加入至待测样品（人全血）中，至终浓度为1.35μmol/l，37±1℃，5%co2培养箱刺激培养2小时；

（2）孵育：向步骤（1）处理后的100微升待测样品中加入抗人fitc-mpo抗体22微升和sytoxred，sytoxred终浓度为10nmol/l，室温孵育30分钟；

（3）检测：向步骤（2）处理后的待测样品中加入红细胞裂解液800微升，裂解16分钟后，直接上流式细胞仪检测，其中fitc通道检测mpo表达，apc通道检测dna特异性荧光染料表达，双阳性定义为胞外诱捕网表达，从而实现对胞外诱捕网的定性和定量分析。

以只加入fitc-igg1作为同型对照，采用美国bd公司流式细胞仪facscantoii，先通过调整fsc和ssc的电压参数，选定中性粒细胞群。通过调整fitc,apc(如使用sytoxred）或bv421（如使用sytoxblue）确定阴性阈值所在位置。最后上样品管读取数值，使用diva或者flowjo软件分析结果。

图1（12张小图），竖的共4列，代表使用不同的刺激剂（从左到右分别是：未刺激组，大肠杆菌刺激，fmlp刺激，pma刺激），刺激后使用本方法检测nets的结果。共三行，分别代表健康人，代偿性肝硬化患者，慢加急性肝衰竭患者样本。结果表明使用本方式可以有效检测患者的nets表达。

图2为成像流式图，从左往右分别是，未染色对照组，未刺激对照组和刺激染色组，通过成像流式结果可以明确使用本检测方式可以有效检测中性粒细胞膜表面mpo和sytoxred表达。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。