本发明属于凝血检测
技术领域：
，具体涉及一种血小板聚集功能花生四烯酸检测试剂及其制备方法。
背景技术：
：血栓弹力图(teg)是一种对血小板聚集、凝血、纤溶等整个过程实施实时、动态、连续监测的凝血功能分析仪，对病人凝血状况做出定性或定量分析。血栓弹力图仪于1948年由德国人harter发明，应用于指导临床术中输血，目前已成为检测凝血功能最重要的手段之一。血栓弹力图检测血液凝血功能的原理是将传感器探头浸入血液标本中，血液标本与传感器探头间存在粘滞力，该粘滞力随着血小板聚集、凝血、纤溶等变化而改变，传感器的悬垂丝在这种粘滞力的作用下发生扭转形变，这种扭转形变被检测单元检测到并转化为电信号反馈给控制系统，控制系统接收到变化的信号后进行运算，并将运算结果以曲线图形和实时数据的形式显示在计算机屏幕上。血栓弹力图(teg)使用经抗凝处理的全血，从内外源性凝血途径激活凝血、纤溶系统系统，从而更全面、更真实地反映人体凝血因子、血小板、纤维蛋白及纤维蛋白溶解的整个过程。血小板的主要功能是凝血、止血、修补破损的血管。血小板表面与凝血功能相关的受体adp受体、α及β-肾上腺受体、凝血酶(原)受体、胶原受体(gpⅰa/ⅱa、gpⅳ、gp-ⅵ)、txa2/pgh2受体、pgi2/pge1受体、5-羟基色胺受体、肝素受体、pfa(血小板激活因子)受体、纤维蛋白原受体、ca2+受体纤维连接蛋白受体、血小板因子4受体、血管紧张素ⅱ受体、ldl受体、hdl受体、vwf受体(gpⅰb/ⅸ)和gpⅱb/ⅲa(纤维蛋白原受体)等。血小板gpⅱb/ⅲa膜受体是位于血小板表面的的粘附性糖蛋白，是血小板表面数量最多的一种整合素，血小板表面约有5×104～8×104个gpⅱb/ⅲa膜受体。adp、aa、凝血酶等可以激活血小板，使其表面的gpⅱb/ⅲa膜受体构象发生变化，从而使gpⅱb/ⅲa膜受体对可溶性纤维蛋白原、vwf等亲和力增加，最终使血小板聚集在桥联纤维蛋白、vwf上，形成血小板血栓。细胞膜中的磷脂在磷脂酶a2催化下释放出花生四烯酸aa(结合在磷脂甘油2位碳上)，aa在环氧酶cox(即前列腺素h合成酶pghs)的催化下形成pgg2和pgh2，二者在相应前列腺素异构酶作用下代谢生成各种前列腺素pgs。pgs包括pge、pgf、pgd、pgi2(由血管内皮细胞产生，诱导血管舒张并抑制血小板聚集)和txa2(由血小板产生，诱导血管收缩，是一种强血小板激动剂)等。阿司匹林使血小板的环氧化酶cox乙酞化，抑制血栓素txa2合成、血小板的释放反应(如肾上腺素，胶原、凝血酶等引起的释放)以及内源性adp、5-羟色胺等的释放，从而抑制血小板聚集阿司匹林作为经典的抗血小板药物，在临床中应用的范围之广、频率之高，远胜其他抗凝药物。目前血栓弹力图(teg)在检测血小板聚集功能时缺乏足够的灵敏度，即对服用阿司匹林药物的患者标本不能有效检出，或者虽能有效检出，但和其他方法相比不能比较真实的反映血小板被抑制的程度。技术实现要素：针对目前血栓弹力图(teg)在检测血小板聚集功能时缺乏足够的灵敏度，对服用阿司匹林药物的患者标本不能有效检出，有些虽能有效检出，但和其他方法相比不能比较真实的反映血小板被抑制的程度的缺陷和问题，本发明提供一种血小板聚集功能花生四烯酸检测试剂及其制备方法。本发明解决其技术问题所采用的方案是：一种血小板聚集功能花生四烯酸检测试剂，包括花生四烯酸钠和冻干保护剂。上述的血小板聚集功能花生四烯酸检测试剂，所述冻干保护剂包括糖类冻干保护剂和聚合物类冻干保护剂。上述的血小板聚集功能花生四烯酸检测试剂，所述糖类冻干保护剂为海藻糖、蔗糖、葡聚糖、葡萄糖中的一种或几种。上述的血小板聚集功能花生四烯酸检测试剂，所述糖类保护剂为海藻糖，海藻糖的添加量为1％。上述的血小板聚集功能花生四烯酸检测试剂，所述聚合物类冻干保护剂为牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的一种或几种。上述的血小板聚集功能花生四烯酸检测试剂，所述聚合物类冻干保护剂为牛血清白蛋白，牛血清白蛋白的添加量为2％。上述的血小板聚集功能花生四烯酸检测试剂，还包括抗氧化，所述抗氧化剂为二硫苏糖醇、叔丁基对苯二酚、二丁基羟基甲苯和硫代硫酸钠中的一种或几种。本发明还提供一种血小板聚集功能花生四烯酸检测试剂的制备方法，包括以下步骤：(1)按配方量量取冻干保护剂和抗氧化剂，加入纯净水或纯化水充分溶解得到冻干保护剂溶液；(2)按配方量称取花生四烯酸钠，将其倒入冻干保护剂溶液中，混合均匀得到花生四烯酸钠检测试剂母液；(3)将花生四烯酸钠检测试剂按照每瓶20-60微升分装至西林瓶中得到成品花生四烯酸钠检测试剂；(4)将花生四烯酸钠检测试剂真空冷冻干燥得到花生四烯酸钠试剂冻干品。本发明的有益效果：本发明充分考虑诊断试剂对抗血小板药物的不同反应性，对目前临床上常用的阿司匹林、布洛芬等均有较好的灵敏度。本发明花生四烯酸杯检测试剂用于服药后肝素钠抗凝血液检验，其检验结果准确性好，批内和批间精密度高。具体实施方式下面结合实施例对本发明进一步说明。本发明提供一种血小板聚集功能花生四烯酸检测试剂，该检测试剂包括花生四烯酸钠、冻干保护剂和抗氧化剂，其中冻干保护剂包括糖类冻干保护剂和聚合物类冻干保护剂，糖类冻干保护剂可以为海藻糖、蔗糖、葡聚糖、葡萄糖中的任一种或任几种；聚合物类冻干保护剂可以为牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的任一种或任几种；抗氧化剂可以为二硫苏糖醇、叔丁基对苯二酚、二丁基羟基甲苯和硫代硫酸钠中的任一种或任几种。实施例1：本实施例的花生四烯酸检测试剂总量为40微升，按体积比各原料的用量分别为花生四烯酸钠0.5％、海藻糖1.0％、牛血清白蛋白2.0％、二硫苏糖醇0.03％、二丁基羟基甲苯0.04％、余量为纯化水。制备方法：(1)按配方量量取海藻糖、牛血清白蛋白、二硫苏糖醇和二丁基羟基甲苯，加入纯净水或纯化水充分溶解得到冻干保护剂溶液；(2)按配方量称取花生四烯酸钠加到制得的冻干保护剂溶液中，混合均匀，得到花生四烯酸钠检测试剂母液；(3)将花生四烯酸钠检测试剂按照每瓶40微升分装至西林瓶中得到成品花生四烯酸钠检测试剂；(4)将花生四烯酸钠检测试剂真空冷冻干燥得到花生四烯酸钠试剂冻干品。实施例2：本实施例的花生四烯酸检测试剂总量为60微升，按体积比各原料的用量分别为花生四烯酸钠1.0％、海藻糖2.0％、牛血清白蛋白3.0％、二硫苏糖醇0.06％、二丁基羟基甲苯0.06％、余量为纯化水。制备方法：(1)按配方量量取海藻糖、牛血清白蛋白、二硫苏糖醇和二丁基羟基甲苯，加入纯净水或纯化水充分溶解得到冻干保护剂溶液；(2)按配方量称取花生四烯酸钠加到制得的冻干保护剂溶液中，混合均匀，得到花生四烯酸钠检测试剂母液；(3)将花生四烯酸钠检测试剂按照每瓶60微升分装至西林瓶中得到成品花生四烯酸钠检测试剂；(4)将花生四烯酸钠检测试剂真空冷冻干燥得到花生四烯酸钠试剂冻干品。实施例3：本实施例的花生四烯酸检测试剂总量为40微升，按质量体积浓度计，各原料的用量分别为花生四烯酸钠0.5％、海藻糖2.5％、牛血清白蛋白2.0％、二硫苏糖醇0.09％、二丁基羟基甲苯0.02％、余量为纯化水。制备方法：(1)按配方量量取海藻糖、牛血清白蛋白、二硫苏糖醇和二丁基羟基甲苯，加入纯净水或纯化水充分溶解得到冻干保护剂溶液；(2)按配方量称取花生四烯酸钠加到制得的冻干保护剂溶液中，混合均匀，得到花生四烯酸检测试剂母液；(3)将花生四烯酸钠检测试剂按照每瓶40微升分装至西林瓶中得到成品花生四烯酸检测试剂；(4)将花生四烯酸检测试剂真空冷冻干燥得到花生四烯酸试剂冻干品。试验例：本试验例提供一种学白板聚集功能花生四烯酸检测试剂，该试剂中花生四烯酸的添加量为0.1-3.0％。本实施例将花生四烯酸钠用量取0.1％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％和3.0％七个水平。实验分组如下表1。表1花生四烯酸杯主要原料添加量优化分组实验编号检测对象1花生四烯酸钠(0.1％)2花生四烯酸钠(0.5％)3花生四烯酸钠(1.0％)4花生四烯酸钠(1.5％)5花生四烯酸钠(2.0％)6花生四烯酸钠(2.5％)7花生四烯酸钠(3.0％)表2花生四烯酸杯不同用量主要原料对血栓弹力图各指标的影响注：从表2中各数据可以看出，编号2实验组中r、k、angle和ma与参比试剂测量结果的相对偏差最小，且满足相对偏差不大于10％。所以本发明试剂中花生四烯酸钠用量优选0.5％。由于花生四烯酸钠极不稳定，在空气中很容易被氧化变质。考虑在其配方中加入抗氧化保护剂。花生四烯酸杯检测试剂加入的糖类冻干保护剂为海藻糖、蔗糖、葡聚糖和葡萄糖中的一种或几种，预实验结果显示加入试剂质量体积0.5～2.5％的海藻糖时冻干效果最好，且对花生四烯酸杯检测试剂各指标无明显影响。加入不含还原基海藻糖，可在冻干全过程保护花生四烯酸钠免受低温和脱水导致的变质失活。花生四烯酸杯检测试剂加入的聚合物类冻干保护剂为牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的一种或几种，实验结果显示加入试剂质量体积0.1～4.0％的牛血清白蛋白时冻干效果最好，且对花生四烯酸杯检测试剂各指标无明显影响。加入牛血清白蛋白可以保护花生四烯酸钠在冻干中避免低温和脱水对其活性的影响。花生四烯酸杯检测试剂加入的抗氧化剂为二硫苏糖醇、叔丁基对苯二酚、二丁基羟基甲苯和硫代硫酸钠中的一种或几种，实验结果显示加入试剂质量体积0.02～0.1％的二硫苏糖醇和0.02～0.1％二丁基羟基甲苯时冻干效果最好，且对花生四烯酸杯杯检测试剂各指标无明显影响。优选二硫苏糖醇和二丁基羟基甲苯作为联合抗氧化体系，可有效防止花生四烯酸钠氧化导致的活性丧失。用牛血清白蛋白、海藻糖、二硫苏糖醇和二丁基羟基甲苯做冻干保护剂，花生四烯酸钠活性保持的效果最为理想。经初步预实验后，将各冻干保护剂用量暂定为：海藻糖选择1.0％、1.5％和2.0％三个水平；牛血清白蛋白选择1.0％、2.0％和3.0％三个水平；二硫苏糖醇选择0.03％、0.06％和0.09％三个水平；二丁基羟基甲苯选择0.02％、0.04％和0.06％三个水平。采用l9(43)正交表进行正交试验设计，海藻糖为因素1，占据正交表的第一列，1.0％为水平①、1.5％为水平②、2.0％为水平③；牛血清白蛋白为因素2，占据正交表的第二列，1.0％为水平①、2.0％为水平②、3.0％为水平③；二硫苏糖醇为因素3，占据正交表的第三列，0.03％为水平①、0.06％为水平②、0.09％为水平③；二丁基羟基甲苯为因素4，占据正交表的第四列，0.02％为水平①、0.04％为水平②、0.06％为水平③；各试验水平、因素组合如下表3所示。表3花生四烯酸杯检测试剂配方优化试验设计方案以某进口试剂为参比试剂，每个样本分别用本发明试剂和参比试剂平行做三次，检测结果如下表4所示。表4花生四烯酸杯检测试剂优化试验结果注：从表4中各数据可以看出，编号6实验组中r、k、angle和ma与参比试剂测量结果的相对偏差最小，所以本发明试剂中海藻糖用量优选1.0％、牛血清白蛋白用量优选2.0％、二硫苏糖醇用量优选0.03％，二丁基羟基甲苯用量优选0.04％。应用例：本发明的花生四烯酸检测试剂能够用于全血检测和在血栓弹力图(teg)技术中用于抗凝全血检测。血栓弹力图(teg)检测特征量说明如下：血凝时间r：凝血酶等凝血因子被充分激活，纤维蛋白凝血块形成开始，到血栓弹力图仪描计振幅达到2mm所需时间。r值延长，说明某些凝血因子缺乏；r值缩短，说明血液呈高凝状态。血块成形时间k：从r值时间终点开始到血栓弹力图仪描计振幅达到20mm所需时间，反映纤维蛋白和血小板在凝血开始形成时的相互作用。k值的长短反映纤维蛋白原水平的高低。血凝速率angle：血栓弹力图仪描计振幅曲线弧度最大点的切线与水平线的夹角，反映血凝块形成的速率。当血液处于重度低凝状态时，描计振幅达不到20mm，此时k值无法确定。血块强度ma：血栓弹力图仪最大描计振幅，是纤维蛋白和血小板gpⅱb/ⅲa受体结合，表现纤维蛋白/血小板凝块的最大强度。抑制率％：＜50，提示药物没能起到较好的抗凝效应，存在一定程度的药物抵抗。抑制率％：≥50，提示药物起效，抑制明显。本发明所述花生四烯酸杯检测试剂直接检测经过肝素钠处理的抗凝全血，采集的抗凝全血室温放置不得超过24小时，最好在2小时内使用。其中：花生四烯酸钠：sigma；牛血清白蛋白生产厂家：bioruler；海藻糖生产厂家：上海源叶生物科技有限公司；二硫苏糖醇生产厂家：北京索莱宝科技有限公司；二丁基羟基甲苯生产厂家：上海迈瑞尔化学技术有限公司。上述血小板聚集功能检测试剂盒用于全血检测的方法如下：1)打开应用软件，在患者信息界面输入患者姓名，选择测试类型，普通杯“ck-citratedkaolin”，巴曲酶杯“a-activated”,花生四烯酸杯“aa-activated+aa”；2)在血栓弹力图仪通道上装载普通杯、巴曲酶杯和花生四烯酸杯；注意和测试类型对应！3)取出巴曲酶杯检测试剂、花生四烯酸杯检测试剂和纯化水，分别移取40μl纯化水加入试剂巴曲酶杯检测试剂、花生四烯酸杯检测试剂瓶中，盖上瓶盖，充分摇匀；4)用lml移液器从枸橼酸钠抗凝全血样本中移取1ml到试剂1瓶中，上下颠倒试剂1瓶5次充分混匀，静置4分钟激活血液；5)普通杯检测：移取20μl试剂2到普通杯杯底，再移取步骤4)中激活的血液340μl加到普通杯中，捏紧杯托，将普通杯推至顶端，测试杆拨至“测试”位，选中“ck-citratedkaolin”通道，点击软件界面“开始”或键盘f10，开始测试；6)巴曲酶杯检测：从步骤2)复溶试剂a中移取10μl液体加入巴曲酶杯中，再加入360μl肝素化血样，于杯中抽吸三次混匀，将巴曲酶杯推至顶端，测试杆拨至“测试”位，选中“a-activated”通道，点击软件界面“开始”或键盘f10，开始测试；7)花生四烯酸杯检测：从步骤2)复溶试剂a中移取10μl液体、复溶试剂c中吸取10μl液体加入花生四烯酸杯中，再加入360μl肝素化血样，于杯中抽吸三次混匀，将花生四烯酸杯推至顶端，测试杆拨至“测试”位，选中“aa-activated+aa”通道，点击软件界面“开始”或键盘f10，开始测试；8)凝血过程约30分钟结束；9)测试完成后，在软件界面点击“停止”，卸去测试杯，按实验室管理规定处置；10)抑制率：在软件界面点击“复合”，选择普通杯、巴曲酶杯和花生四烯酸杯三个通道的测试结果图，点击“完成”即可查看花生四烯酸途径的抑制率信息。11)检测完毕，关闭仪器电源开关。检验结果见表5-表9。表5高、低抑制率企业参考品检测结果表6随机3例健康人抗凝全血检测结果表7血块强度ma参考区间从表5、表6和表7可以看出，高、低抑制率企业参考品检测结果(相对偏差)值均在±10％范围内；对随机3例健康人抗凝全血检测结果均在规定范围内，本发明试剂盒检测结果和患者实际情况相一致。对本发明二磷酸腺苷检测试剂的批内精密度和批间精密度进行测定，结果见表8和表9。表8批内精密度从表8可以看出，普通杯杯、巴曲酶杯、花生四烯酸杯对新鲜枸橼酸钠和肝素钠抗凝全血批内精密度检测结果的变异系数均小于10％，批内精密度较高。表9批间精密度从表8结果可知，各特征量批间精密度的检测结果相对偏差均小于10％，批间精密度较高。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12