一种检测盐酸托莫西汀对映异构体的反相液相色谱方法与流程

1.本发明属于药物分析领域，具体涉及一种反相液相色谱法分析测定盐酸托莫西汀对映异构体的方法。


背景技术：

2.盐酸托莫西汀(atomoxetine hydrochloride)是一种选择性去甲肾上腺素重摄取抑制剂(snri)，由美国eli lilly公司研制开发。该药于2002年7月正式获fda批准，2003年成功上市销售，是美国fda许可用于治疗注意缺陷障碍伴多动症(adhd)的第一个非中枢兴奋剂；其能延长在突触裂隙释放去甲肾上腺素的活性，主要用于治疗成人及7岁以上儿童的adhd。国内外的多项研究显示，盐酸托莫西汀临床疗效显著，患者顺应性高，应用安全。
3.盐酸托莫西汀化学名为(
‑
)
‑
n
‑
甲基
‑3‑
苯基
‑3‑
(o
‑
甲苯氧基)
‑
丙胺盐酸盐[(r)
‑
n
‑
methyl
‑3‑
phenyl
‑3‑
(o
‑
tolyloxy)
‑
propan
‑1‑
amine hydrochloride]，分子式为c
17
h
21
no
·
hcl，分子量为291.82，结构式见表1。现临床所批准使用的是盐酸托莫西汀左旋异构体，由于不同的对映异构体显示出不同的疗效和毒性，故盐酸托莫西汀及其制剂在生产过程中的异构体检查对其安全用药有着重要意义。目前bp2020和usp2020等标准中均规定盐酸托莫西汀对映异构体的含量不得超过0.5％。
[0004]
表1中间体水解物及其对映异构体结构式
[0005][0006][0007]
通过查阅中外文献及专利发现目前已有相关文献报道采用高效液相法测定盐酸托莫西汀对映异构体，其中较多采用正相hplc系统，部分采用反相色谱系统结合蒸发光散
射检测器，比如《hplc法检查盐酸托莫西汀左旋异构体的有关物质》陈杰等采用甲醇
‑
异丙醇
‑
三乙胺(960:40:0.5)为流动相，漂移管温度须达到90℃，对仪器设备的要求较高；另有需要先衍生化处理后再进行检测，比如《盐酸托莫西汀中s
‑
异构体杂质含量的柱前衍生高效液相色谱法测定》张小燕等建立了柱前衍生化反相高效液相色谱法测定盐酸托莫西汀中异构体杂质的方法，该方法的灵敏度为定量限0.25μg/ml，检测限0.08μg/ml，且操作较复杂，不利于企业对产品质量的把控。因此，建立一种灵敏度高、简便易行、普适性高的色谱方法用于测定盐酸托莫西汀对映异构体是具必要性的。


技术实现要素：

[0008]
为了解决目前技术问题，本发明通过大量实验探索后提供了一种采用反相色谱系统分离分析盐酸托莫西汀对映异构体的方法，采用普通紫外检测器，操作简便易行，普遍适用性较高，并能达到较高灵敏度，能更好地控制盐酸托莫西汀的产品质量。
[0009]
本发明提供的技术方案是：
[0010]
一种检测盐酸托莫西汀对映异构体的反相液相色谱方法，使用硅胶表面涂敷有纤维素
‑
三(4
‑
甲基苯甲酸酯)为填料的多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱，以0.05
‑
0.2mol/l六氟磷酸钾溶液和有机相混合溶液为流动相对盐酸托莫西汀对映异构体进行hplc分离测定，所述hplc的色谱条件包括：
[0011]
有机相占流动相体积比18％～38％；
[0012]
六氟磷酸钾溶液中加入0.1％二乙胺且用磷酸调节ph至3.0～6.0；
[0013]
流动相流速为0.5～0.8ml/min；
[0014]
色谱柱温度为25～35℃；
[0015]
检测器采用紫外检测器，检测波长为200～250nm。
[0016]
优选地，所述多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱的型号为chiralcel oj
‑
rh。
[0017]
优选地，所述有机相为乙腈。
[0018]
优选地，所述有机相占流动相体积比28％。
[0019]
优选地，所述六氟磷酸钾溶液的浓度为0.1mol/l。
[0020]
优选地，所述六氟磷酸钾溶液的ph为4.5。
[0021]
优选地，所述色谱柱温度为30℃。
[0022]
优选地，所述检测波长为225nm。
[0023]
本发明中所涉及到的百分比均为体积百分比。
[0024]
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
[0025]
1.本发明实现了对盐酸托莫西汀及其对映异构体的有效分离和检测，所使用的反相色谱系统具有色谱介质性能稳定，分离能力强，操作过程简单等优点，能够更方便地实现对产品生产过程环节的质量控制，提高最终产品品质，保证临床用药的安全有效。
[0026]
2.本发明的定量限0.016μg/ml，检测限0.0035μg/ml，具有很高的灵敏度，而且准确度高、重复性好、检测时间短，为产品研发和生产过程提供了更加简便、稳定、可靠的分析检测方法。
附图说明
[0027]
图1为系统适用性hplc色谱图；
[0028]
图2为专属性实验中空白溶剂hplc色谱图；
[0029]
图3为专属性实验中空白辅料溶液hplc色谱图；
[0030]
图4为酸破坏实验hplc色谱图；
[0031]
图5为盐酸托莫西汀对映异构体标准曲线图；
[0032]
图6为检测盐酸托莫西汀异构体定量限的hplc色谱图；
[0033]
图7为检测盐酸托莫西汀口服溶液中间产品异构体含量得到的hplc色谱图。
具体实施方式
[0034]
为便于本领域技术人员理解本发明内容，下面结合具体实施例进一步描述本发明的技术方案，但以下内容不应以任何方式限制本发明权利要求书请求保护的范围。
[0035]
以下诸实施例中，所用仪器与试剂如下：
[0036]
仪器：戴安u
‑
3000高效液相色谱仪。
[0037]
试剂：六氟磷酸钾、磷酸和二乙胺均为分析纯，乙腈为色谱级。
[0038]
盐酸托莫西汀消旋体对照品及对映异构体对照品均为申请人购买自cprd。
[0039]
实施例1固定相的筛选
[0040]
色谱仪器：戴安u
‑
3000高效液相色谱仪
[0041]
色谱柱：chiralpak ad
‑
rh，chiralpak as
‑
rh，chiralcel od
‑
rh和chiralcel oj
‑
rh(150mm*4.6mm,5μm)
[0042]
检测器及波长：uv
‑
225
[0043]
流速：0.7ml/min
[0044]
进样量：10μl
[0045]
柱温：30℃
[0046]
流动相：0.1mol/l六氟磷酸钾溶液(加入0.1％二乙胺，用磷酸调节ph4.5)
‑
乙腈(72:28，v/v)
[0047]
稀释液：为流动相。
[0048]
灵敏度溶液制备：精密称定盐酸托莫西汀对映异构体，用稀释液配制成浓度为0.015μg/ml的溶液。
[0049]
系统适用性溶液：取盐酸托莫西汀消旋体适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.02mg的溶液，作为系统适用性溶液。
[0050]
不同固定相灵敏度和分离度结果见表1。
[0051]
表1对映异构体检测的固定相筛选
[0052][0053][0054]
结论：以上结果表明采用以上色谱条件分离盐酸托莫西汀及其对映异构体时，使用chiralcel oj
‑
rh分离效果最好，灵敏度最高，故优选chiralcel oj
‑
rh色谱柱。
[0055]
实施例2流动相的筛选
[0056]
(1)不同流动相比例的检测效果试验
[0057]
流动相一：六氟磷酸钾溶液
‑
乙腈(77:23，v/v)
[0058]
流动相二：六氟磷酸钾溶液
‑
乙腈(72:28，v/v)
[0059]
流动相三：六氟磷酸钾溶液
‑
乙腈(67:33，v/v)
[0060]
色谱仪器：戴安u
‑
3000高效液相色谱仪
[0061]
色谱柱：chiralcel oj
‑
rh(150mm*4.6mm,5μm)
[0062]
检测器及波长：uv
‑
225
[0063]
流速：0.7ml/min
[0064]
进样量：10μl
[0065]
柱温：30℃
[0066]
稀释液：为流动相
[0067]
表2对映异构体检测的流动相比例筛选
[0068][0069]
不同流动相灵敏度和分离度结果见表2。
[0070]
结论：流动相比例为72:28时s/n值最高，灵敏度最好，且分离度较高，保留时间较短。
[0071]
(2)不同柱温的检测效果试验
[0072]
色谱仪器：戴安u
‑
3000高效液相色谱仪
[0073]
色谱柱：chiralcel oj
‑
rh(150mm*4.6mm,5μm)
[0074]
检测器及波长：uv
‑
225
[0075]
流速：0.7ml/min
[0076]
进样量：10μl
[0077]
流动相：六氟磷酸钾溶液
‑
乙腈(72:28，v/v)
[0078]
柱温一：35℃
[0079]
柱温二：30℃
[0080]
柱温三：25℃
[0081]
稀释液：为流动相
[0082]
表3对映异构体检测的柱温条件筛选
[0083][0084]
不同流动相灵敏度和分离度结果见表3。
[0085]
结论：柱温为30℃时s/n值最高，灵敏度最好，且分离度较高，保留时间较短。
[0086]
(3)不同六氟磷酸钾溶液ph的检测效果试验
[0087]
ph条件一：4.0
[0088]
ph条件二：4.5
[0089]
ph条件三：5.0
[0090]
色谱仪器：戴安u
‑
3000高效液相色谱仪
[0091]
色谱柱：chiralcel oj
‑
rh(150mm*4.6mm,5μm)
[0092]
检测器及波长：uv
‑
225
[0093]
流速：0.7ml/min
[0094]
进样量：10μl
[0095]
流动相：六氟磷酸钾溶液
‑
乙腈(72:28，v/v)
[0096]
柱温：30℃
[0097]
稀释液：为流动相
[0098]
表4对映异构体检测的ph条件筛选
[0099][0100]
不同流动相灵敏度和分离度结果见表4。
[0101]
结论：六氟磷酸钾溶液的ph为4.5时s/n值最高，灵敏度最好，且分离度较高，保留时间较短。
[0102]
实施例3方法学考察
[0103]
(1)系统适用性
[0104]
色谱仪器：戴安u
‑
3000高效液相色谱仪
[0105]
色谱柱：chiralcel oj
‑
rh(150mm*4.6mm,5μm)
[0106]
检测器及波长：uv
‑
225
[0107]
流速：0.7ml/min
[0108]
进样量：10μl
[0109]
柱温：30℃
[0110]
流动相：0.1mol/l六氟磷酸钾溶液(加入0.1％二乙胺，用磷酸调节ph4.5)
‑
乙腈(72:28，v/v)
[0111]
稀释液：为流动相。
[0112]
系统适用性溶液：取盐酸托莫西汀消旋体适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.02mg的溶液，作为系统适用性溶液。进样10μl，色谱结果如图1所示。
[0113]
结论：可知系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为对映异构体与盐酸托莫西汀，保留时间分别为22.447min和24.458min，对映异构体峰与盐酸托莫西汀峰之间的分离度符合要求(≥1.5)。
[0114]
(2)专属性
[0115]
①
选择性和干扰试验
[0116]
色谱仪器：戴安u
‑
3000高效液相色谱仪
[0117]
色谱柱：chiralcel oj
‑
rh(150mm*4.6mm,5μm)
[0118]
检测器及波长：uv
‑
225
[0119]
流速：0.7ml/min
[0120]
进样量：10μl
[0121]
柱温：30℃
[0122]
流动相：0.1mol/l六氟磷酸钾溶液(加入0.1％二乙胺，用磷酸调节ph4.5)
‑
乙腈(72:28，v/v)
[0123]
稀释液：为流动相。
[0124]
空白溶剂：流动相。
[0125]
空白辅料溶液：取空白辅料1ml，置20ml量瓶中，加稀释液至刻度，摇匀，即得。
[0126]
结论：从图2和图3结果可知，空白溶剂和空白辅料均对检测无明显干扰。
[0127]
②
强降解试验
[0128]
a.酸破坏实验：取本品1ml，置20ml量瓶中，加2mol/l盐酸溶液1ml，沸水浴加热30分钟，加2mol/l氢氧化钠溶液1ml中和，并加入正丙醇4ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，进行高效液相色谱检测，检测条件见上。检测得到的色谱图如图4所示。
[0129]
由图4可知，酸破坏出的盐酸托莫西汀对映异构体后，其与托莫西汀峰的分离度为1.90，且其他杂质的检出对映异构体的检测无明显干扰，说明本发明提供的检测方法专属性良好。
[0130]
b.碱破坏实验：取本品1ml，置20ml量瓶中，加2mol/l氢氧化钠溶液1ml，沸水浴加热60分钟，加2mol/l盐酸溶液1ml中和，并加入正丙醇4ml，用流动相稀释至刻度，摇匀。由检测得到结果可知，碱破坏出盐酸托莫西汀对映异构体后，其与托莫西汀峰的分离度为1.72，且其他杂质检出不影响盐酸托莫西汀对映异构体的检测，说明本发明提供的检测方法专属性良好。
[0131]
(3)线性和范围
[0132]
色谱仪器：戴安u
‑
3000高效液相色谱仪
[0133]
色谱柱：chiralcel oj
‑
rh(150mm*4.6mm,5μm)
[0134]
检测器及波长：uv
‑
225
[0135]
流速：0.7ml/min
[0136]
进样量：10μl
[0137]
柱温：30℃
[0138]
流动相：0.1mol/l六氟磷酸钾溶液(加入0.1％二乙胺，用磷酸调节ph4.5)
‑
乙腈(72:28，v/v)
[0139]
稀释液：为流动相。
[0140]
标准曲线：外标法
[0141]
溶液配制：精密量取100μg/ml盐酸托莫西汀对映异构体对照溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0ml分别置20ml量瓶中，加稀释液至刻度，摇匀，制成浓度约为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μg/ml标准系列溶液。按照以上色谱条件分析并记录峰面积，以峰面积对浓度做线性回归，得到回归曲线，结果见表5，回归曲线见图5。回归方程为y＝0.324x+0.0435，在0.01597
‑
20.0μg/ml浓度范围内线性良好。
[0142]
表5托莫西汀对映异构体标准曲线
[0143]
[0144]
(4)定量限和检测限
[0145]
色谱仪器：戴安u
‑
3000高效液相色谱仪
[0146]
色谱柱：chiralcel oj
‑
rh(150mm*4.6mm,5μm)
[0147]
检测器及波长：uv
‑
225
[0148]
流速：0.7ml/min
[0149]
进样量：10μl
[0150]
柱温：30℃
[0151]
流动相：0.1mol/l六氟磷酸钾溶液(加入0.1％二乙胺，用磷酸调节ph4.5)
‑
乙腈(72:28，v/v)
[0152]
稀释液：为流动相。
[0153]
取盐酸托莫西汀对映异构体对照品溶液逐级稀释至一定浓度，将信噪比s/n为3左右时的浓度定为检测限，将信噪比s/n为10左右时的浓度定为定量限。同时平行配制6份定量限浓度的溶液进行检测，计算所得峰面积及保留时间相对标准偏差，结果见表6，定量限色谱图见图6。
[0154]
表6定量限和检测限
[0155][0156]
(5)准确度
[0157]
色谱仪器：戴安u
‑
3000高效液相色谱仪
[0158]
色谱柱：chiralcel oj
‑
rh(150mm*4.6mm,5μm)
[0159]
检测器及波长：uv
‑
225
[0160]
流速：0.7ml/min
[0161]
进样量：10μl
[0162]
柱温：30℃
[0163]
流动相：0.1mol/l六氟磷酸钾溶液(加入0.1％二乙胺，用磷酸调节ph4.5)
‑
乙腈(72:28，v/v)
[0164]
稀释液：为流动相。
[0165]
精密量取盐酸托莫西汀口服溶液1.2ml、1.5ml、1.8ml，分别置50ml量瓶中，对应精密加入浓度约为2.3μg/ml托莫西汀对映异构体对照品溶液4.0ml、5.0ml、6.0ml，再用稀释液定容至刻度，摇匀。低中高每个浓度平行配制3份，分别进样并计算溶液中盐酸托莫西汀对映异构体的含量，结果如表7所示。
[0166]
由表7可知托莫西汀对映异构体在各水平的回收率均在90％～108％范围内，回收率rsd为0.17％，该方法准确度良好。
[0167]
表7准确度
[0168][0169][0170]
(6)重复性
[0171]
色谱仪器：戴安u
‑
3000高效液相色谱仪
[0172]
色谱柱：chiralcel oj
‑
rh(150mm*4.6mm,5μm)
[0173]
检测器及波长：uv
‑
225
[0174]
流速：0.7ml/min
[0175]
进样量：10μl
[0176]
柱温：30℃
[0177]
流动相：0.1mol/l六氟磷酸钾溶液(加入0.1％二乙胺，用磷酸调节ph4.5)
‑
乙腈(72:28，v/v)
[0178]
稀释液：为流动相。
[0179]
精密量取盐酸托莫西汀口服溶液3ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，配置成盐酸托莫西汀对映异构体重复性溶液，平行配制6份。分别取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如表8所示。
[0180]
由表8可知，本发明提供的检测方法精密度较高，盐酸托莫西汀对映异构体含量的rsd值为0.23％，符合规定。
[0181]
表8重复性
[0182][0183]
(7)中间精密度
[0184]
色谱仪器：(1)戴安u
‑
3000高效液相色谱仪
[0185]
(2)岛津lc
‑
2040plus高效液相色谱仪
[0186]
色谱柱：chiralcel oj
‑
rh(150mm*4.6mm,5μm)
[0187]
检测器及波长：uv
‑
225
[0188]
流速：0.7ml/min
[0189]
进样量：10μl
[0190]
柱温：30℃
[0191]
流动相：0.1mol/l六氟磷酸钾溶液(加入0.1％二乙胺，用磷酸调节ph4.5)
‑
乙腈(72:28，v/v)
[0192]
稀释液：为流动相。
[0193]
取同一批号盐酸托莫西汀口服溶液，不同实验人员在不同日期使用不同仪器分别照对映异构体检查法，各平行测定6次对映异构体，计算12次对映异构体检出量rsd，结果如表9。结果显示该方法中间精密度良好，rsd为0.41％。
[0194]
表9中间精密度
[0195][0196]
(8)工艺验证中间产品异构体含量检测
[0197]
色谱仪器：戴安u
‑
3000高效液相色谱仪
[0198]
色谱柱：chiralcel oj
‑
rh(150mm*4.6mm,5μm)
[0199]
检测器及波长：uv
‑
225
[0200]
流速：0.7ml/min
[0201]
进样量：10μl
[0202]
柱温：30℃
[0203]
流动相：0.1mol/l六氟磷酸钾溶液(加入0.1％二乙胺，用磷酸调节ph4.5)
‑
乙腈(72:28，v/v)
[0204]
稀释液：为流动相。
[0205]
供试品溶液：精密量取工艺验证的中间产品3ml，置50ml量瓶中，用稀释液定容至刻度，摇匀。
[0206]
系统适用性溶液：取盐酸托莫西汀消旋体适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.02mg的溶液，作为系统适用性溶液。
[0207]
系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为对映异构体与盐酸托莫西汀，对映异构体峰与盐酸托莫西汀峰之间分离度应符合要求。
[0208]
色谱图如图7所示，结果见表10。
[0209]
图中盐酸托莫西汀对映异构体的保留时间为22.685min，盐酸托莫西汀的保留时
间为24.875min，两者之间的分离度为1.77，符合要求。
[0210]
表10中间产品对映异构体含量测定结果
[0211]
批号对映异构体含量(％)08010.19308020.19208030.192