一种同时检测石蒜属植物生物碱合成途径中14种代谢物的方法

1.本发明涉及生物碱类物质检测技术领域，具体涉及一种同时检测石蒜属植物生物碱合成途径中14种代谢物的方法。


背景技术：

2.石蒜属(lycoris spp.)是石蒜科(amaryllidaceae)球根草本植物，很多品种石蒜是中国特有的观赏和药用花卉，富含多种石蒜属植物特有的生物碱成分，药用价值极高。因此，对石蒜中生物碱含量进行准确定性和定量分析是育种和生物碱类物质合成代谢研究的重要内容之一。
3.包括加兰他敏在内的许多植物次生代谢产物在植物中的含量较低且资源有限，这极大的限制了这类具有极高药用价值的植物天然产物的商业化应用。因此探索代谢工程的方法来生产加兰他敏等生物碱，将为药用植物资源保护和可持续开发利用提供新的思路，同时也具有较好的经济和社会价值，而这些工作的关键前提是探明石蒜加兰他敏生物合成途径。
4.迄今为止，研究认为石蒜属加兰他敏等生物碱合成途径可以分为4大步骤：初始合成反应、降孤挺花啶(norbelladine)骨架的形成、酚环化反应及不同生物碱亚组骨架的形成和核心骨架结构的修饰。初始步骤反应底物来源于初生代谢产生的苯丙氨酸(l
‑
phenylalanine)和酪氨酸(l
‑
tyrosine)。在苯丙氨酸解氨酶(pal)的作用下，苯丙氨酸转化为反式桂皮酸(trans
‑
cinnamic acid)，再经过两步可能由细胞色素p450家族酶催化的羟基化(肉桂酸
‑4‑
羟化酶ca4h，肉桂酸
‑3‑
羟化酶ca3h)反应，及后续的脱c反应，生成3,4
‑
二羟基苯甲醛(3,4
‑
dihydroxybenzaldehyde；3,4
‑
dhba)。在酪氨酸脱羧酶(tydc)的作用下，酪氨酸转化为酪胺(tyramine)。3,4
‑
dhba和tyramine经过缩合和还原反应，最终生成降孤挺花啶(norbelladine)。norbelladine在氧位甲基转移酶(o
‑
methytransferase，omt)的催化下接受一个甲基基团转变为4
’‑
o
‑
甲基降孤挺花啶(4
’‑
o
‑
methylnorbelladine)，作为整个合成途径的核心中间产物，4
’‑
o
‑
methylnorbelladine是石蒜科多种生物碱的共同前体。再经过可能由细胞色素p450家族酶催化的邻
‑
对、对
‑
邻或对
‑
对位的氧化性c
‑
c酚环化反应，4
’‑
o
‑
methylnorbelladine可生成石蒜碱型(lycorine
‑
type)、加兰他敏型(galanthamine
‑
type)和水仙环素型(narciclasine
‑
type)三种生物碱骨架结构；这些结构再经过复杂的o
‑
甲基化、n
‑
甲基化、c
‑
c和c
‑
o键形成、氧化还原、去甲基化和羟基化修饰反应，最终生成结构各异的生物碱类化合物。研究表明，加兰他敏的合成是按照4
’‑
o
‑
甲基降孤挺花啶(4
’‑
o
‑
methylnorbelladine)、n
‑
去甲基那维定(n
‑
demethylnarwedine)、n
‑
去甲基加兰他敏(n
‑
demethylgalanthamine)、加兰他敏(galanthamine)的路线进行。
5.现有技术中，未发现针对加兰他敏合成途径代谢物即苯丙氨酸、4
‑
羟基桂皮酸、4
‑
羟基苯甲醛、3,4
‑
二羟基肉桂酸、反式桂皮酸、酪氨酸、酪胺、3,4
‑
二羟基苯甲醛、降孤挺花啶、4
’‑
o
‑
甲基降孤挺花啶、去甲基加兰他敏、加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏同时检测，准确
定量的方法，为生物碱类物质的快速定量分析带来不便。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测石蒜属植物生物碱合成途径中14种代谢物的方法。本发明提供的方法实现了快速定量分析石蒜属植物生物碱合成途径中14种代谢物的目的。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了一种同时检测石蒜属植物中生物碱合成途径中14种代谢物的方法，包括以下步骤：
9.将待测石蒜属植物样品和提取剂混合，进行提取，得到上机样品；
10.将所述上机样品进行液相色谱串联二级质谱检测；
11.所述液相色谱串联二级质谱检测的参数包括液相色谱检测参数和质谱检测参数：
12.所述液相色谱检测参数包括：
13.液相色谱柱：硅胶型色谱柱；
14.进样量：5～10μl；
15.流速：0.2～0.3ml/min；
16.流动相包括流动相a和流动相b；所述流动相a为甲酸水溶液；所述流动相b为乙腈；
17.洗脱方法：梯度洗脱；
18.梯度洗脱的程序为：
19.0～1min：95％a；
20.1～5min：95～55％a；
21.5～7min：55～0％a；
22.7～8min：0％a；
23.8～8.1min：0～95％a；
24.8.1～10min：95％a；
25.质谱检测条件包括：
26.离子源：电喷雾离子源；
27.离子源喷雾电压：
‑
4500～5500v；
28.扫描方式：正离子或负离子扫描下以多反应检测模式进行分析；
29.所述生物碱合成途径中14种代谢物包括苯丙氨酸、4
‑
羟基桂皮酸、4
‑
羟基苯甲醛、3,4
‑
二羟基肉桂酸、反式桂皮酸、酪氨酸、酪胺、3,4
‑
二羟基苯甲醛、降孤挺花啶、4
’‑
o
‑
甲基降孤挺花啶、去甲基加兰他敏、加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏；
30.监测离子对包括：苯丙氨酸的母离子为m/z 166
±
1da；4
‑
羟基桂皮酸的母离子为m/z 163
±
1da；4
‑
羟基苯甲醛的母离子为m/z 123
±
1da；3,4
‑
二羟基肉桂酸的母离子为m/z 179
±
1da；反式桂皮酸的母离子为m/z 147
±
1da；酪氨酸的母离子为m/z 182
±
1da；酪胺的母离子为m/z 138
±
1da；3,4
‑
二羟基苯甲醛的母离子为m/z 137
±
1da；降孤挺花啶的母离子为m/z 260
±
1da；4
’‑
o
‑
甲基降孤挺花啶的母离子为m/z 274
±
1da；n
‑
去甲基加兰他敏的母离子为m/z274
±
1da、兰他敏的母离子为m/z 288
±
1da；石蒜碱的母离子为m/z 288
±
1da；力可拉敏的母离子为m/z 290
±
1da。
288
±
1da；力可拉敏的母离子为m/z 290
±
1da。
41.本发明利用液相色谱串联二级质谱检测及选择的14种物质的母离子信息监测，能够提高14种代谢物的定性及定量分析的准确性。
附图说明
42.图1为浓度为2.56ng/ml的标准溶液的色谱图。
具体实施方式
43.本发明提供了一种同时检测石蒜属植物中生物碱合成途径中14种代谢物的方法，包括以下步骤：
44.将待测石蒜属植物样品和提取剂混合，进行提取，得到上机样品；
45.将所述上机样品进行液相色谱串联二级质谱检测。
46.在本发明中，如无特殊说明，本发明所用原料均优选为市售产品。
47.本发明将待测石蒜属植物样品和提取剂混合，进行提取，得到上机样品。
48.本发明对所述待测石蒜属植物样品的种类或类型不做具体限定，在本发明的具体实施例中，所述待测石蒜属植物样品优选为长筒石蒜的鳞茎或换锦花的鳞茎。在本发明中，所述待测石蒜属植物样品的粒径优选为0.075mm～0.187mm。在本发明中，所述待测石蒜属植物样品优选通过冷冻干燥和研磨得到：所述冷冻干燥的温度优选为
‑
50℃～
‑
70℃，真空度优选为2～10pa。本发明对所述研磨的参数不做具体限定，只要能够将所述待测石蒜属植物样品的粒径研磨至0.075～0.187mm即可。
49.在本发明中，所述提取剂优选为乙醇溶液；所述乙醇溶液的质量浓度优选为70～75％。在本发明中，所述待测石蒜属植物样品以干基计，所述待测石蒜属植物样品和提取剂的用量比优选为0.02g：(1～2)ml。
50.在本发明中，所述提取优选在超声的条件下进行，所述超声的功率优选为200w，时间优选为28～40min。在本发明中，所述提取的次数优选≥2次，进一步优选为2次。在本发明中，多次提取的具体操作优选包括：将待测石蒜属植物样品和提取剂混合后，进行提取、离心分离，得到上清液和滤渣；所述滤渣和提取剂混合后，再次进行提取、离心分离，得到上清液和滤渣；所述滤渣根据需要再与提取剂混合，进行提取、离心分离，将得到的上清液合并作为提取体系。在本发明中，所述离心分离的转速优选为13000rpm，时间优选为10min。
51.所述提取后，本发明优选还包括将所得提取体系依次进行氮吹、复溶、稀释和过滤，得到所述上机样品。本发明对所述氮吹的时间不做具体限定，只要将提取体系吹至近干即可。在本发明中，所述复溶的试剂优选为甲醇水溶液；所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比优选为1：3.5～4.5。在本发明中，所述稀释的试剂优选为复溶的试剂一致，在此不再赘述；本发明对所述稀释的试剂的用量不做具体限定，只要能够稀释至标准曲线设置的浓度范围即可，即0.5～500ng/ml。在本发明中，所述过滤的滤膜优选为0.22μm滤膜。
52.得到上机样品后，本发明将所述上机样品进行液相色谱串联二级质谱检测。
53.在本发明中，所述液相色谱串联二级质谱检测的参数包括液相色谱检测参数和质谱检测参数：
54.所述液相色谱检测参数包括：
55.液相色谱柱为硅胶型色谱柱，优选为waters uplc hss t3柱，2.1mm
×
100mm，1.8μm；
56.进样量为5～10μl，优选为5μl；
57.流速为0.2～0.3ml/min，优选为0.3ml/min；
58.流动相包括流动相a和流动相b；所述流动相a为甲酸水溶液，所述甲酸水溶液的体积浓度优选为0.1～0.5％；所述流动相b为乙腈；
59.洗脱方法：梯度洗脱；
60.梯度洗脱的程序如表1所示：
61.表1梯度洗脱的程序
[0062][0063]
质谱检测条件包括：
[0064]
离子源：电喷雾离子源；
[0065]
离子源喷雾电压：
‑
4500～5500v；
[0066]
扫描方式：正离子或负离子扫描下以多反应检测模式进行分析；
[0067]
所述生物碱合成途径中14种代谢物包括苯丙氨酸、4
‑
羟基桂皮酸、4
‑
羟基苯甲醛、3,4
‑
二羟基肉桂酸、反式桂皮酸、酪氨酸、酪胺、3,4
‑
二羟基苯甲醛、降孤挺花啶、4
’‑
o
‑
甲基降孤挺花啶、去甲基加兰他敏、加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏；
[0068]
监测离子对包括：苯丙氨酸的母离子为m/z 166
±
1da；4
‑
羟基桂皮酸的母离子为m/z 163
±
1da；4
‑
羟基苯甲醛的母离子为m/z 123
±
1da；3,4
‑
二羟基肉桂酸的母离子为m/z 179
±
1da；反式桂皮酸的母离子为m/z 147
±
1da；酪氨酸的母离子为m/z 182
±
1da；酪胺的母离子为m/z 138
±
1da；3,4
‑
二羟基苯甲醛的母离子为m/z 137
±
1da；降孤挺花啶的母离子为m/z 260
±
1da；4
’‑
o
‑
甲基降孤挺花啶的母离子为m/z 274
±
1da；n
‑
去甲基加兰他敏的母离子为m/z274
±
1da、兰他敏的母离子为m/z 288
±
1da；石蒜碱的母离子为m/z 288
±
1da；力可拉敏的母离子为m/z 290
±
1da；
[0069]
所述监测离子对优选还包括：苯丙氨酸的子离子选自质荷比m/z为120
±
1da；4
‑
羟基桂皮酸的子离子选自质荷比m/z为119
±
1da；4
‑
羟基苯甲醛的子离子选自质荷比m/z为95
±
1da；3,4
‑
二羟基肉桂酸的子离子选自质荷比m/z为135
±
1da；反式桂皮酸的子离子选自质荷比m/z为103
±
1da；酪氨酸的子离子选自质荷比m/z为136
±
1da；酪胺的子离子选自质
荷比m/z为121
±
1da；3,4
‑
二羟基苯甲醛的子离子选自质荷比m/z为108
±
1da；降孤挺花啶的子离子选自质荷比m/z为138
±
1da；4
’‑
o
‑
甲基降孤挺花啶的子离子选自质荷比m/z为137
±
1da；n
‑
去甲基加兰他敏的子离子选自质荷比m/z为213
±
1da；兰他敏的子离子选自质荷比m/z为213
±
1da；石蒜碱的子离子选自质荷比m/z为147
±
1da；力可拉敏的子离子选自质荷比m/z为233
±
1da。
[0070]
所述液相色谱串联二级质谱检测后，还包括将所得14种代谢物的质谱峰面积代入各物质的浓度
‑
峰面积标准曲线中，得到14种代谢物的含量。
[0071]
本发明对所述各物质的浓度
‑
峰面积标准曲线的获取方式不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的获取方式进行获取即可。
[0072]
下面结合实施例对本发明提供的同时检测石蒜属植物中生物碱合成途径中14种代谢物的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0073]
实施例1一种同时检测石蒜属长筒石蒜中生物碱合成途径中14种代谢物含量的方法
[0074]
包括如下步骤：
[0075]
s1、标准溶液的制备：
[0076]
分别称取0.10g 14种物质的标准品作为目标物，使用甲醇为溶剂稀释定容至100ml，得到14种物质的标准储备液，储备液浓度均为1mg/ml；
[0077]
然后分别取上述标准储备液置于容量瓶中，用甲醇定容配成5.0μg/ml的混合标准中间液；
[0078]
根据需要移取适量混合标准中间液，分别用甲醇稀释成浓度100ng/ml、40ng/ml、16ng/ml、6.4ng/ml、2.56ng/ml、1.024ng/ml、0.4096ng/ml、0.464ng/ml、0.0655ng/ml的系列标准溶液。
[0079]
s2、待测样品溶液的配制
[0080]
以长筒石蒜的鳞茎为待测样品0.2g(含水量90％)，于
‑
70℃、8pa的条件下冷冻干燥，研磨至粒径为0.075mm；将鳞茎干样0.02g置于ep管中加入1ml 70wt％乙醇554，200w超声提取28min，13000rpm离心10min，取上清；滤渣加入1ml 70wt％乙醇再次200w超声提取28min，涡旋1min，13000rpm离心10min，合并两次上清液，氮吹浓缩至近干后，加入1ml复溶溶剂(含甲醇与水的混合溶液，其中甲醇与水的体积比为1：4)，复溶溶剂稀释d倍(本实例中为1000倍)至浓度0.5～500ng/ml，过0.22μm滤膜，得待测样品溶液。
[0081]
s3、液相色谱
‑
串联二级质谱分析检测
[0082]
利用液相色谱
‑
串联二级质谱对标准溶液和待测样品溶液进行检测，获得样品中14种代谢物的峰面积数据；
[0083]
其中，色谱条件为：
[0084]
液相色谱柱：waters uplc hss t3柱(2.1mm
×
100mm，1.8μm)；
[0085]
进样量：5μl；
[0086]
流速：0.3ml/min；
[0087]
流动相：流动相a，甲酸
‑
水溶液(体积浓度为0.1％)；流动相b，乙腈；
[0088]
洗脱方法：梯度洗脱，梯度洗脱的程序如表1所示。
[0089]
图1为浓度为2.56ng/ml的标准溶液的色谱图，从图1可以看出：在上述检测条件
下，苯丙氨酸的保留时间为3.16min；4
‑
羟基桂皮酸的保留时间为5.18min；4
‑
羟基苯甲醛的保留时间为5.02min；3,4
‑
二羟基肉桂酸的保留时间为4.58min；反式桂皮酸的保留时间为6.62min；酪氨酸的保留时间为1.85min；酪胺的保留时间为1.96min；3,4
‑
二羟基苯甲醛的保留时间为4.26min；降孤挺花啶的保留时间为3.81min；4
’‑
o
‑
甲基降孤挺花啶的保留时间为4.40min；n
‑
去甲基加兰他敏的保留时间为3.24min；加兰他敏的保留时间为3.49min；石蒜碱的保留时间为2.98min；力可拉敏的保留时间为3.48min。
[0090]
质谱条件及扫描方式为：
[0091]
质谱采用的是美国ab sciex公司的6500三重四极杆质谱检测系统，配有电喷雾(esi)离子源和analyst 1.6.2工作站。
[0092]
离子源：电喷雾离子源(esi)；
[0093]
扫描方式：正离子或者负离子扫描下以mrm模式进行分析；
[0094]
离子源：电喷雾离子源；
[0095]
离子源喷雾电压：
‑
4500
‑
5500v；
[0096]
扫描方式：正离子或负离子扫描下以多反应检测模式进行分析；
[0097]
监测离子对情况如表2所示。
[0098]
表2监测离子对情况
[0099][0100]
s4、标准曲线的绘制及样品结果的计算。
[0101]
以标准溶液中目标物的浓度为横坐标，以标准溶液中目标物的质谱峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，分别得到14种物质的标准曲线，结果如表3所示。
[0102]
表3 14种代谢物的标准曲线
[0103][0104]
根据信噪比法计算14种代谢物的检出限和定量限，结果如表4所示。
[0105]
表4检出限及定量限结果
[0106]
[0107][0108]
取同一丙氨酸、4
‑
羟基桂皮酸、4
‑
羟基苯甲醛、3,4
‑
二羟基肉桂酸、反式桂皮酸、酪氨酸、酪胺、3,4
‑
二羟基苯甲醛、降孤挺花啶、4
’‑
o
‑
甲基降孤挺花啶、去甲基加兰他敏、加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏标准品溶液，重复进样5次，计算峰面积的rsd分别为0.4％、0.5％、0.7％、0.4％、0.6％、0.5％、0.4％、0.6％、0.3％、0.5％、0.7％、0.6％、0.6％、0.7％，说明仪器精密度较好。
[0109]
取同一样品，按照前述样品制备方法制备供试品溶液，进样重复测定5次，计算丙氨酸、4
‑
羟基桂皮酸、4
‑
羟基苯甲醛、3,4
‑
二羟基肉桂酸、反式桂皮酸、酪氨酸、酪胺、3,4
‑
二羟基苯甲醛、降孤挺花啶、4
’‑
o
‑
甲基降孤挺花啶、去甲基加兰他敏、加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏成分含量的rsd分别为3.1％、2.5％、3.5％、2.0％、3.8％、3.4％、2.6％、2.3％、2.6％、2.3％、3.2％、3.7％、2.9％、3.6％，说明重复性较好。
[0110]
取同一样品溶液，在0、3、6、9、24h分别进样5次，测定丙氨酸、4
‑
羟基桂皮酸、4
‑
羟基苯甲醛、3,4
‑
二羟基肉桂酸、反式桂皮酸、酪氨酸、酪胺、3,4
‑
二羟基苯甲醛、降孤挺花啶、4
’‑
o
‑
甲基降孤挺花啶、去甲基加兰他敏、加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏含量的rsd分别为3.1％、3.5％、3.3％、4.2％、3.4％、3.5％、3.7％、3.0％、3.6％、3.3％、3.9％、4.0％、2.8％、2.9％，说明供试用溶液14种物质在24h内稳定性较好。
[0111]
将相同条件下测得的待测样品溶液中目标物的质谱峰面积代入标准曲线的线性方程中，获得待测样品溶液中14种物质的浓度c，根据公式i计算得到样品中14种物质的含量：
[0112]
m＝(c
×
v
×
d)/m公式i；
[0113]
公式i中，m为样品中14种物质含量，单位为ng/g干重；c为待测溶液中14种物质浓度，单位ng/ml；v为复溶溶剂的体积，单位为ml；d为稀释倍数；m为样品质量，干重，单位为g。
[0114]
最终测得本实施例中某份长筒石蒜鳞茎样本中，m
3,4
‑
二羟基苯甲醛
＝28.97ng/g干重，m
3,4
‑
二羟基肉桂酸
＝12.89ng/g干重，m4‑
羟基苯甲醛
＝67.11ng/g干重，m4‑
羟基桂皮酸
＝5.72ng/g干重，m4’‑
o
‑
甲基降孤挺花啶
＝83.23ng/g干重，m
加兰他敏
＝26079.73ng/g干重，m
苯丙氨酸
＝68.94ng/g干重，m
酪氨酸
＝305541.42ng/g干重，m
力可拉敏
＝293708.65ng/g干重，m
石蒜碱
＝106286.53ng/g干重，m
n
‑
去甲基加兰他敏
＝138236.65ng/g干重，m
降孤挺花啶
＝0.68ng/g干重，m
反式桂皮酸
＝0.39ng/g干重，m
酪胺
＝19159.28ng/g干重。
[0115]
本发明中待测样品鲜重可低至0.2g。待测样品冷冻干燥后研磨成粉的重量为干重。
[0116]
实施例2一种同时检测石蒜属换锦花中生物碱合成途径中14种代谢物含量的方法
[0117]
待测样品溶液的配制
[0118]
以换锦花的鳞茎为待测样品0.2g(含水量90％左右)，于
‑
50℃、10pa的条件下冷冻干燥，研磨成粒径为0.187mm的粉；得鳞茎干样粉0.02g置于ep管中加入1ml 70wt％乙醇，超声提取28min，13000rpm离心10min，得到上清液和滤渣；滤渣加入1ml 70wt％乙醇再次超声提取28min，涡旋1min，13000rpm离心10min，得到上清液和滤渣；合并两次上清液，氮吹浓缩至近干后，加入1ml复溶溶剂(含甲醇与水的混合溶液，其中甲醇与水的体积比为1：4)，复溶溶剂稀释d倍(本实例中为1000倍)至浓度0.5～500ng/ml，过0.22μm滤膜，得待测样品溶液。
[0119]
按照实施例1的方法对待测样品溶液进行检测，结果为：
[0120]
本实例中的某份换锦花鳞茎样本中，m
3,4
‑
二羟基苯甲醛
＝41.15ng/g干重，m
3,4
‑
二羟基肉桂酸
＝15.03ng/g干重，m4‑
羟基苯甲醛
＝45.41ng/g干重，m4‑
羟基桂皮酸
＝23.74ng/g干重，m4’‑
o
‑
甲基降孤挺花啶
＝150.45ng/g干重，m
加兰他敏
＝73994.24ng/g干重，m苯丙氨酸＝350.80ng/g干重，m
酪氨酸
＝110143.47ng/g干重，m
力可拉敏
＝131211.67ng/g干重，m
石蒜碱
＝444140.79ng/g干重，m
n
‑
去甲基加兰他敏
＝109555.73ng/g干重，m
降孤挺花啶
＝6.39ng/g干重，m
反式桂皮酸
＝15.81ng/g干重，m
酪胺
＝26366.54ng/g干重。
[0121]
本发明中待测样品鲜重可低至0.2g。待测样品冷冻干燥后研磨成粉的重量为干重。
[0122]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。