用于食源性致病菌快速检测的荧光标记试纸条及制备方法

1.本发明属于致病菌检测技术领域，具体涉及构建一种以上转换纳米颗粒为荧光标记物的试纸条以实现对食源性致病菌快速、灵敏、高特异性的检测。


背景技术：

2.食源性疾病已成为全球公共卫生安全问题，其常因摄入被致病微生物及其毒素或其它化学物质污染的食品引起。其中受食源性细菌影响的食品在严重情况下会导致疾病和死亡。
3.人是食源性致病菌的适宜宿主，营养不良的幼儿、老人及免疫缺陷者更为易感。据报道，每年约有14000例志贺氏菌病，志贺氏菌引起的细菌性痢疾主要通过消化道传播。为了监视相关食源性疾病的发生和传播，需要定期检查食品以确保公共卫生安全，因此，使用快速、高度敏感的工具对这些食源性病原体进行快速而敏感的筛查至关重要。
4.在传统的检测方法中，选择性培养和生化检测主要用于检测食源性致病菌。这些方法通常需要大量的时间和劳力。由于分子生物学技术的发展，已经开发了一种基于脱氧核糖核酸(dna)分子的实时定量pcr方法来检测食源性致病菌。但是，基于pcr的方法需要复杂的细胞破碎和核酸提取方案。因此，在一定程度上限制了食源性致病菌的快速和实时检测。
5.从整体上看，传统检测方法虽然技术要求低，成本低，但是耗时费力，检测不准确，而实时定量pcr方法虽然克服了传统方法上的一些不足，但是成本较高，操作技术要求高，耗时仍然长。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中存在的不足，本发明提出了一种用于食源性致病菌快速检测的荧光标记试纸条及制备方法，可以实现对食品中食源性致病菌的快速、高特异性、高灵敏度的检测。
7.本发明所采用的技术方案如下：
8.一种用于食源性致病菌快速检测的荧光标记试纸条制备方法，包括以下步骤：
9.步骤1、采用高温热分解法合成稀土元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒；
10.步骤2、利用四氟硼酸亚硝离子对步骤1中合成的上转换荧光纳米颗粒表面进行羧基修饰，使上转换荧光纳米颗粒具有水溶性和抗体连接稳定性；
11.步骤3、利用酰化催化剂在水溶液中经过颗粒初洗、活化、偶联、封闭的步骤，形成食源性致病菌特异性抗体与上转换纳米颗粒的稳定连接结构；该稳定连接结构为抗体上转换偶联物；
12.步骤4、利用玻璃纤维膜处理液对样品垫进行处理，在样品垫烘干后，切割成适宜大小进行拼接；
13.步骤5、利用玻璃纤维膜处理液对结合垫进行处理，烘干后，用不同比例的步骤3所
制得的抗体上转换偶联物对结合垫进行喷涂；
14.步骤6、将食源性致病菌特异性抗体以及抗食源性致病菌抗体的特异性二抗溶液用包被液稀释，然后以0.5μl/cm的喷量和30mm/s的速度在硝酸纤维素膜划线，构成t线和c线，t线和c线间的距离恒定；利用食源性致病菌特异性抗体以及抗食源性致病菌抗体的特异性二抗作为捕捉探针；
15.步骤7、将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫分别以恒定距离与重叠厚度粘贴在pvc荧光胶板上，以保证层析过程顺利进行；
16.步骤8、制备不同浓度梯度的菌液，用步骤7所制得的试纸条对菌液进行检测，用荧光光谱仪测得t线、c线荧光强度值，绘制标准曲线；
17.步骤9、制备待测样品，测得加入待测样品后的t线、c线荧光值，得到待测样品中的实际目标细菌的数量，实现定量检测；
18.步骤10、根据步骤8和步骤9结果对试纸条进行校正，加入已知量待测样液，对试纸条上的t线、c线荧光进行判断，以实现快速检测。
19.进一步，其特征在于，所述稀土掺杂的上转换荧光纳米材料是掺杂镧系元素的上转换荧光纳米颗粒，且该上转换荧光纳米颗粒在980nm激发光下548nm处具有强烈的荧光值，可用于标记抗体。
20.进一步，其特征在于，所述稀土元素掺杂的上转换荧光纳米材料采用高温热分解法合成，具体操作为：将稀土激活剂和敏化剂的氯化物、naoh、nh4f、ycl3加入到有机溶剂中，经过不同阶段的温度反应后，经乙醇洗涤溶于环己烷后获得稀土元素掺杂的上转换荧光纳米材料。
21.进一步，其特征在于，利用四氟硼酸亚硝离子亚硝化作用对上转换荧光纳米颗粒表面进行羧基修饰，使上转换荧光纳米颗粒表面具有水溶性和抗体连接的稳定性。
22.进一步，其特征在于，所述利用四氟硼酸亚硝离子亚硝化作用的操作过程为：将bf4no、上转换颗粒溶解分散在n，n
‑
二甲基甲酰胺溶液中；加入甲苯和环己烷，离心，加入聚丙烯酸水溶液、丙酮搅拌获得表面进行羧基修饰的上转换荧光纳米颗粒。
23.进一步，其特征在于，步骤3中利用酰胺化反应制备抗体与上转换颗粒的稳定连接结构的操作过程为：加入nhs、edc、初洗缓冲液、偶联缓冲液、封闭缓冲液、抗体、上转换颗粒，获得抗体上转换偶联物；
24.进一步，其特征在于，所述样品垫、结合垫的制备方法是：将样品垫浸泡在玻璃纤维膜处理液中，后烘干，吸附力为19
‑
23μl/cm2；结合垫用玻璃纤维膜处理液浸泡，室温晾干后烘干；等比例对样品垫、结合垫进行切割。
25.进一步，其特征在于，步骤6中制备硝酸纤维素膜t线和c线的方法是：硝酸纤维素膜的爬速为89
‑
90秒，切割设定长度，将硝酸纤维素膜贴在荧光pvc胶板上；将相关抗体用t线、c线包被液稀释，在硝酸纤维素膜上进行划线，构成检测区和质控区；t线、c线间的距离恒定；后置于37℃的鼓风干燥箱烘48
‑
50h，密封保存。
26.进一步，其特征在于，步骤7中试纸条的拼接的操作是：把样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫依次粘贴在pvc胶板上，样品垫与结合垫衔接部分重叠1
‑
1.5mm，硝酸纤维膜与吸水垫部分重叠2mm，以保证层析过程顺利进行，将拼接后的试纸条至于室温中进行保存。
27.进一步，其特征在于，利用发光性能可调的上转换发光材料制备荧光标记试纸条，使荧光标记试纸条具有显著的光稳定性，用于长期监测食源性致病菌，而没有显著信号强度的损失，结果更可靠，准确。
28.进一步，其特征在于，步骤10中检测方法是：将校准后的试纸条放入便携智能读取设备，设备近红外激发光光源所发出的光线经聚焦镜、二向色镜、聚焦镜、滤光片后被智能手机后置摄像头捕捉，获得荧光标记试纸条图像，以快速辨别样品食源性致病菌污染情况。
29.进一步，通过便携式荧光成像设备获取荧光标记试纸条的荧光图像，结合图像处理及化学计量学技术，实现食源性致病菌的定量检测。
30.一种用于食源性致病菌快速检测的荧光标记试纸条，采用上述用于食源性致病菌快速检测的荧光标记试纸条及其制备方法制备而成，用于对食品中食源性致病菌进行检测。
31.本发明的有益效果：
32.本发明方法在抗体上修饰上转换纳米颗粒作为荧光信号，在硝酸纤维素膜上喷涂对应的特异性一抗溶液和特异性二抗溶液。当加入目标物后，目标物会与上转换抗体偶联物进行结合，在试纸条流动过程中，待测物会与硝酸纤维素膜上t线抗体结合，经红外激发光照射后，t线呈现荧光，且待测物浓度越高，t线荧光强度越强。同时c线始终发光，可作为判断试纸条是否具有检测性的依据。根据荧光强度不同，可以实现对目标细菌的定量检测。此外，在便携式试纸条读取设备中，可通过智能手机成像，快速判断样品中是否含有待测样品，同时实现定量检测。本方法灵敏度高，特异性强，操作简单，检测速度快，可通过改变不同的抗体连接实现不同目标物的检测，在食品分析检测领域具有重要的意义。
附图说明
33.图1是本发明荧光标记试纸条结构以及检测示意图；
34.图2中，a为实际牛奶样品t线荧光光谱；b为实际牛奶样品成像结果。
具体实施方式
35.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
36.本发明所提出的一种用于食源性致病菌快速检测的荧光标记试纸条制备方法，包括如下步骤：
37.步骤1、采用高温热分解法，分别将稀土激活剂和稀土敏化剂的氯化物、naoh、nh4f、ycl3加入到混有1
‑
十八烯和油酸的有机溶剂中，分别经过3个阶段的温度反应后，迅速升温至300℃，维持该温度1个小时，经乙醇和环己烷反复洗涤后获得稀土元素掺杂的上转换荧光纳米材料；本实施例中所述的稀土掺杂的上转换荧光纳米材料是掺杂镧系元素的上转换荧光纳米颗粒，例如采用er获得掺杂的nayf4:yb/er上转换荧光纳米颗粒；且该上转换荧光纳米颗粒在980nm激发光下548nm处具有强烈的荧光值，可用于标记抗体。
38.步骤2、利用四氟硼酸亚硝离子快速对步骤1中合成的上转换荧光纳米颗粒表面进行羧基修饰，称取bf4no固体溶解在n，n
‑
二甲基甲酰胺溶液中，将步骤1中所合成的上转换
纳米颗粒加入到该溶液中，使上转换纳米颗粒均匀分散在该溶液中，加入甲苯和环己烷，离心；加入聚丙烯酸水溶液并加热。最后加入丙酮，离心获得羧基修饰的上转换纳米颗粒；使上转换荧光纳米颗粒表面具有水溶性和抗体连接的稳定性。
39.步骤3、利用酰化催化剂在水溶液中形成抗体与上转换纳米颗粒的稳定连接物，操作过程为：配制初洗缓冲液、偶联缓冲液、封闭缓冲液、保存缓冲液等对上转换纳米颗粒与抗体进行连接，通过edc和磺基
‑
nhs介导的酰胺化反应实现了抗体与上转换颗粒的结合；
40.步骤4、在本实施例中将牛奶及乳制品作为样品，将用于施加牛奶及乳制品样品的玻璃纤维样品垫浸泡在玻璃纤维膜处理液中，在回旋式震荡器上回旋浸泡，室温晾干后鼓风干燥。烘干的样品垫切割成大小为4mm
×
15mm，放进铝箔袋中抽真空密封保存；
41.步骤5、将用于装载颗粒标记抗体的样品垫用玻璃纤维处理液浸泡，在回旋式振荡器上回旋浸泡，室温晾干后鼓风干燥。烘干的结合垫在切割成大小为4mm
×
3mm。将制备好的ucnp
‑
抗体标记物用微球稀释液稀释，喷在结合垫上，然后鼓风干燥。烘干后将结合垫放进铝箔袋中抽真空密封保存。待干燥后，将结合垫与样品垫组装在一起，以确保溶液在检测过程中正确迁移通过检测条。
42.步骤6、将福式志贺氏菌特异性抗体以及抗福式志贺氏菌抗体的特异性二抗溶液用包被液稀释，将硝酸纤维素膜切割后贴在pvc胶板上，将稀释后的特异性二抗溶液以0.5μl/cm的喷量和30mm/s的速度在硝酸纤维素膜划线，形成平型分布的t线(检测线)和c线(质控线)，即构成检测区和质控区，二者之间的距离为5mm。划好线后将整张pvc胶板放进鼓风干燥箱烘干，烘干后放进铝箔袋中抽真空密封保存。
43.步骤7、将样品垫、结合垫以及吸水垫以恒定距离与1mm重叠厚度粘贴在pvc荧光胶板上，以保证层析过程顺利进行；试纸条在拼装前，需对各部分进行处理，具体操作为：
44.样品垫：采用玻璃纤维膜，首先将玻璃纤维膜浸泡在玻璃纤维膜处理液(20mm tris
‑
base,含0.5％(w/v)tetronic 1307，0.05％(w/v)酪蛋白，0.3％(w/v)pvp
‑
k30，0.05％(v/v)吐温
‑
20，ph＝8.0)中，回旋浸泡2h，室温晾干后放进鼓风干燥箱中，30℃烘48h，然后放进铝箔袋中抽真空密封保存。
45.结合垫：采用玻璃纤维膜，首先用玻璃纤维处理液(20mm tris
‑
base,含0.5％(w/v)tetronic 1307，0.05％(w/v)酪蛋白，0.3％(w/v)pvp
‑
k30，0.05％(v/v)吐温
‑
20，ph＝8.0)浸泡，回旋浸泡2h，室温晾干后放进鼓风干燥箱，30℃烘48h。将制备好的ucnps
‑
抗体标记物用微球稀释液(20nm tris
‑
base,含15％(w/v)蔗糖，0.5％(w/v)bsa，0.5％(v/v)吐温
‑
20，0.5％(w/v)pvp，0.05％(v/v)p
‑
300，ph＝8.4)稀释后，然后喷在结合垫上，然后，然后放进放进鼓风干燥箱中，30℃下烘48h30℃的鼓风干燥箱烘48h。烘干后放进铝箔袋中抽真空密封保存。
46.硝酸纤维素膜：切割后贴在荧光pvc胶板上。用对应抗体在硝酸纤维素膜上分别绘制t线、c线。划线前将相关抗体用包被液(10mm柠檬酸钠，含1％(w/v)蔗糖，ph＝7.4)稀释，再划在硝酸纤维素膜上，二者的距离为5mm，划好膜后干燥1小时。
47.试纸条组装：把将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫按一定顺序叠放，注意各部分的重叠距离，如在硝酸纤维素膜的左上方贴有结合垫，在结合垫的左上方贴有样品垫，同时保证样品垫与结合垫衔接部分重叠1mm，结合垫与硝酸纤维素膜衔接部分重叠2mm；在硝酸纤维素膜的右上方贴有吸水垫，硝酸纤维素膜以及吸水垫衔接部分重叠1mm，以保证
层析过程顺利进行。最后将叠放好的各部分粘在pvc底板上如图1所示。
48.步骤8、制备不同浓度梯度的菌液，取福式志贺氏菌菌液接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃恒温培养24小时后进行平板计数，求出每毫升福式志贺氏菌的数目，加入pbs缓冲液稀释不同浓度梯度的菌悬液，取样加入至步骤7制得的试纸条对其进行检测，用荧光光谱仪测得t线、c线荧光强度值，绘制标准曲线；
49.步骤9、制备待测样品，取步骤7制备的试纸条，加入已知含菌浓度的待测样品，用便携式荧光光谱仪测得加入待测样品后的t线、c线荧光值，根据标准曲线，即得到待测样品中的实际目标细菌的数量；
50.步骤10、根据步骤8和步骤9结果对试纸条进行校正，加入已知量待测样液，将所得试纸条插入便携式智能读取设备，利用智能手机成像对t线、c线荧光进行判断，以实现快速判别(如图1所示)；将所得试纸条插入便携式智能读取设备，同时获取试纸条t线、c线发光图像，结合图像处理，获取光谱及感兴趣区域图像，进而结合化学计量学手段，通过建立定量检测模型，实现福式志贺氏菌的快速检测。
51.以下结合本方法所制备试纸条的检测过程作进一步解释：当在试纸条样品垫中滴加非待测物时，结合垫中的信号探针不会与非待测物发生结合，在侧向流动的过程中，信号探针仅会与c线上对应的二抗结合，c线仅在980nm近红外光激发下产生荧光信号。当在试纸条样品垫中滴加待测物时，结合垫中的信号探针会与待测物结合，在侧向流动的过程中，会再次与t线、c线上对应的抗体、二抗结合，因此，通过荧光成像设备观察对应位置条带显现情况以判断是否有食源性致病菌存在，同时通过获取的荧光图像，结合图像处理及化学计量学技术，实现食源性致病菌的定量检测；通过自制的便携式荧光检测采集光谱信号，建立食源性致病菌的定量检测模型。
52.为了进一步对检测体系特异性进行检验：在步骤7所制备的特异性试纸条中加入远高于食源性致病菌数量的金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌，在智能设备的成像下，可以看到该试纸条只对目标细菌具有t线荧光反应；
53.通过此实例，可以看出，本发明灵敏度高，特异性强，操作简单，检测速度快，并可通过更换相关抗体，实现其它目标物的检测，在食品安全检测领域具有十分重要的意义。
54.以上实施例仅用于说明本发明的设计思想和特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，本发明的保护范围不限于上述实施例。所以，凡依据本发明所揭示的原理、设计思路所作的等同变化或修饰，均在本发明的保护范围之内。