一种基于核酸调控聚合物温敏相变的可视化核酸检测方法

1.本发明涉及生物医学检测技术领域，具体涉及一种基于核酸调控聚合物温敏相变行为的核酸可视化检测的方法。


背景技术：

2.核酸的快速检测在现代医学检测中具有重要意义，是监控、诊断一些流行性疾病的关键手段。相对免疫学的检测，核酸检测具有较高的准确性和时效性：一方面，它能用于病原识别，对疾病传播的中间媒介进行预警，在疾病的预防和传播控制上不可或缺；另一方面，它能在病人病程的早期，甚至尚未出现明显免疫反应时即可做出准确判断，指导疾病早期干预和确切治疗，这在一些起病迅速、致死率高的疾病治疗中是挽救病人生命的关键一环，在传染性高的疾病中也是避免大范围传染的重要助力。
3.要对极微量的核酸进行检测，需要特异性识别、信号放大和信号分析三个步骤。通过特异性地扩增核酸目标序列，可以同时实现特异性和信号放大，在商业应用中主要通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)及等温扩增(thermostat amplification)两类过程实现。前者是检测机构进行核酸检测的标准方法，但是依赖于精密而昂贵的周期性温度调控设备，比较适合专业机构使用。相比等温扩增如滚环扩增(rolling circle amplification，rca)则只需要一个恒定的温度即可实现，大大降低了对昂贵设备的依赖，同时对人员操作的专业要求也更低，因此更便于个人和社区使用。但是现有的等温扩增检测方法仍依赖精密设备进行信号采集和分析。例如荧光信号通常需要灵敏的光电倍增管采集。相比之下，可视化检测的方法可通过简单的手机拍摄或目视判断，具有廉价、便携的特点，因此逐渐成为个人核酸分析的重要发展方向。可视化分析需要远远超过荧光分析的信号强度，这通常依赖长时间的核酸扩增信号放大来实现，但是一方面长时间的扩增降低了检测速度，另一方面基因的可扩增性是有限的，过度的扩增反而带来检测误差，因此可视化核酸分析方法在灵敏度、检测限、检测速度上存在一定的局限。针对这些问题，已有一些基于复合纳米颗粒的信号放大的方法，但是纳米颗粒在制备、储存以及安全性上的不足限制了这类方法的应用，且增加了额外的操作，使成本上升。因此突破传统的信号放大原理，开发不完全依赖核酸扩增、灵敏、快速且简便易行的可视化核酸分析新方法十分必要。
4.树枝化烷氧醚是一种温敏大分子，其温敏行为受到环境因素调控。将含有氨基基团的单体与树枝化烷氧醚单体共聚可以形成含氨基的树枝化烷氧醚共聚物，标记为pg1am。由于该类共聚物带有带正电的氨基，前期研究发现，其可与带有负电基团的核酸在溶液中形成具有较强相互作用的组装结构。考虑到树枝化烷氧醚类分子温敏相变行为具有环境敏感性，核酸与这类分子由于有较强的相互作用，因此核酸可能是一种潜在的调控其温敏相变行为的敏感因素。从宏观上看这种敏感性将为高灵敏、可视化核酸检测开辟全新的道路。如何将敏感性物质和核算的检测进行有效结合，成为亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种基于核酸调控聚合物温敏相变的可视化核酸检测方法，克服核酸检测依赖昂贵设备，需在实验室中配合专业人员才能完成，且检测过程复杂、耗时较长、检测结果不够直观等一系列困难。
6.为达到上述目的，本发明采用如下发明构思：
7.利用含氨基的树枝化烷氧醚聚合物与核酸静电结合，随着温度变化可以表现出明显的透过率差异。且利用该聚合物与不同浓度的核酸结合后，将特定温度下的透过率差异拟合得到核酸浓度与透过率的关系曲线，即标准曲线。检测时把一定量的核酸与聚合物混合后，将特定温度下的透过率与标准曲线对照，即可直观地测定体系中核酸的浓度，实现核酸的快速可视化检测。
8.根据上述发明构思，本发明采用如下技术方案：
9.一种基于核酸调控聚合物温敏相变的可视化核酸检测方法，采用含氨基的树枝化烷氧醚聚合物作为聚合物试剂；
10.将含氨基的树枝化烷氧醚聚合物与核酸混合后得到混合溶液，含氨基的树枝化烷氧醚聚合物与核酸形成的组装结构，随着温度变化混合溶液整体表现出对应的透过率变化，且透过率的变化与混合溶液体系中的核酸浓度负相关；
11.将特定温度下的透过率差异拟合得到核酸浓度与透过率的关系曲线，即标准曲线；
12.检测时，把一定量的含氨基的树枝化烷氧醚聚合物与核酸混合后，将特定温度下的透过率与标准曲线对照，即可直观地测定溶液体系中核酸的浓度，进行核酸的可视化检测。
13.优选地，溶液体系的透过率、含氨基的树枝化烷氧醚聚合物相变温度与核酸的浓度呈负相关关系。
14.优选地，利用紫外
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可见光分光光度计以不低于0.5℃/min的升温速率，来记录25
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60℃的混合溶液浊度曲线。
15.优选地，含氨基的树枝化烷氧醚共聚物和dna的质量比为n:p，将不同n:p的混合溶液作为检测样品，进行浊度测试以绘制标准曲线，并将核酸扩增体系的样品置于恒温水浴槽中观察体系的温敏相变行为，进行核酸的可视化检测。进一步优选地，n:p为(32
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2):1。
16.本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
17.1.本发明基于核酸调控聚合物温敏相变的可视化核酸检测方法，所用的聚合物为含氨基的树枝化烷氧醚聚合物，核酸与上述聚合物产生相互作用，能够改变整体的温敏相变行为；核酸的检测依赖于核酸加入后复合物具有的温敏相变行为，且透过率、相变温度与核酸加入量呈负相关关系，从而很好地实现核酸的可视化快速检测；
18.2.本发明方法实施检测时，把一定体积或一定浓度的核酸与聚合物混合后，将特定温度下的透过率与标准曲线对照即可确定体系中的核酸浓度，由此提出一种用于核酸可视化检测的新方法；
19.3.本发明方法检测效率高，检测成本低，检测精度高。
附图说明
20.图1为pg1am和dna的浊度曲线图。样品均由超纯水配制，充分混合后放入石英比色皿中，利用紫外
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可见光分光光度计以0.5℃/min的升温速率记录25
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60℃的浊度曲线。虚线分别为n:p＝32:1，16:1，8:1，4:1，2:1的样品，实线为只含pg1am的对照组。随着n:p降低即体系中dna含量提高，相变温度逐渐降低，且透过率相较对照组都大幅下降，证明该方法可以通过体系温敏相变可视化检测核酸。
21.图2为40℃下不同n:p与透过率的标准曲线图。选取图1中不同样品在40℃时透过率，绘制了不同n:p与透过率的关系曲线。当n:p降低即体系中dna含量提高时，透过率逐渐降低，证明透过率的变化可以用于定量体系中的核酸含量。
22.图3为94％透过率下dna的浓度与相变温度的标准曲线图。选取图1中不同样品在94％透过率时的相变温度，计算出不同n:p样品中的dna浓度，绘制了94％透过率时dna浓度与相变温度的关系曲线。随着dna浓度的提高，相变温度逐渐降低，证明该方法可以定量检测核酸含量。
23.图4为pg1am和dna的温敏相变照片。样品1为pg1am对照组，样品2为pg1am和经rca扩增的dna，样品3为pg1am和未经rca扩增的dna。图a
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c分别为30℃、40℃和50℃时拍摄的照片。在40℃下样品2和样品3表现出透光率的差异，证明该方法可以对核酸扩增体系进行检测，以判断体系中是否含有目标核酸序列。
具体实施方式
24.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.配制了不同比例pg1am和dna的样品，样品标记为n:p＝x:1。将不同n:p的样品进行浊度测试以绘制标准曲线，并将核酸扩增体系的样品置于恒温水浴槽中观察体系的温敏相变行为。其中浊度曲线是在配备有温控的紫外
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可见光分光光度计(pe lambda 35)上测试的，将混合物水溶液放入石英比色皿(光程为10mm)中，以λ＝700nm在0.5℃/min的升温速率下进行浊度测试。选取了40℃时的透过率与不同n:p绘制了标准曲线，同时以透过率为94％时dna的浓度和相变温度作为参照绘制了标准曲线。核酸扩增体系的样品被置于恒温水浴槽中，通过改变体系温度拍摄照片记录相关温敏相变现象。
26.以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
27.实施例一：
28.在本实施例中，样品n:p＝32:1的测试
29.用超纯水配制氨基浓度为14μm的pg1am(0.1mg/ml)和磷酸基团浓度为467nm的dna(18bp)的混合液，充分混合后即得到n:p＝32:1的样品。
30.将样品n:p＝32:1水溶液放入石英比色皿中，通过改变温度(0.5℃/min)利用紫外
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可见光分光光度计记录25
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60℃的浊度曲线。
31.实施例二：
32.本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
33.在本实施例中，样品n:p＝2:1的测试
34.用超纯水配制氨基浓度为14μm的pg1am(0.1mg/ml)和磷酸基团浓度为7μm的dna(18bp)的混合液，充分混合后即得到n:p＝2:1的样品。
35.将样品n:p＝2:1水溶液放入石英比色皿中，通过改变温度(0.5℃/min)利用紫外
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可见光分光光度计记录25
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60℃的浊度曲线。
36.实施例三：
37.本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
38.在本实施例中，核酸扩增体系的温敏相变
39.利用rca先将dna进行扩增，用超纯水配制含浓度为0.1mg/ml的pg1am样品。其中样品1为pg1am对照组，样品2为pg1am和经rca扩增的dna，样品3为pg1am和未经rca扩增的dna。
40.将样品水溶液放入玻璃瓶中，置于恒温水浴槽中，通过改变体系温度拍摄照片记录相关温敏相变现象。
41.上述实施例基于核酸调控聚合物温敏相变的核酸可视化检测新方法。核酸与特定聚合物结合后，随着温度变化溶液整体表现出明显的透过率变化，且透过率的变化与体系中的核酸浓度负相关。上述实施例以核酸浓度为横坐标，透过率为纵坐标，拟合得到核酸浓度与透过率的关系曲线，即标准曲线。检测时把一定体积的核酸与聚合物混合后，将特定温度下的透过率与标准曲线对照即可确定体系中的核酸浓度，由此提出一种用于核酸可视化检测的新方法。
42.上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。