一种对天然药物产物进行筛选和垂钓的方法

1.本发明属于药物筛选技术领域，具体涉及一种对天然药物产物进行筛选和垂钓的方法


背景技术：

2.药物先导物的发现及其靶点的确证是药物开发的首要环节，而高通量药物筛选技术是药物发现环节的核心性技术，根据已证实靶点蛋白互作形成的复合物空间结构，从庞大的药物库中初步筛选出一系列可匹配的高活性分子结构，是药物开发全产业链最为关键的一环。由于药物研发后期的合成、优化、临床前及临床试验手段已较为成熟，整个研发环节的技术壁垒仍是先导化合物的发现，因此高通量药物筛选成为其中的重中之重。现有的高通量筛选技术(high throughput screening，hts)主要包括放大化学发光、亲和均相检测和表面等离子共振法等方法，这些技术的出现虽然大大加快了药物筛选速度，但仍然具有很大的局限性：包括检测成本高、用药量大、容易出现假阳性信号等。并且我国在药物筛选方面的发展起步较晚，仅有个别国家重点实验室具有高通量筛选的系统，开发新的简单易行的高通量药物筛选技术仍十分重要。
3.分子垂钓(molecule fishing)是一种基于药物靶点与活性分子的相互作用，从复杂的生物样品中亲和选择配体，以实现先导化合物的发现的高通量生物分析方法，具有特异性强、效率高、对样品预处理要求少等特点，是传统高通量筛选方法(high throughput screening,hts)基础上的重要技术进步。其中，基于表面等离子共振(surface plasmon resonance,spr)的生物分子相互分析(biomolecular interaction analysis,bia)技术是一种新型生物传感技术。由此技术开发出的生物传感仪器商品名为biacore，其不需要使用荧光标记和同位素标记，直接通过表面等离子共振的物理光学现象，测量其光学反射率的变化，实时追踪生物分子间相互作用的方法，具有极高的灵敏度、分辨率和特异性。然而，biacore技术对样品要求高，对样品量耗费巨大，且样品无法回收，具有明显的局限性。
4.拉曼光谱分析技术基于每种物质特有的拉曼谱峰，拉曼峰的位置和强度、拉曼谱线的数目直接与样品分子振动或转动能级有关，可以极其灵敏地进行物质定性、定量分析，但是拉曼信号强度较低限制了拉曼散射的应用和发展。直到金属表面增强拉曼散射(surface
‑
enhanced raman spectroscopy，sers)的发现，极大地增加了拉曼光谱信号强度，使极微量、超灵敏分析成为可能。sers技术在药物高通量筛选方面有着重大意义，但是目前尚没有sers与天然药物产物库相结合，应用于中药活性分子的药物筛选分子垂钓。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明公开了一种中药活性分子的筛选和垂钓方法，将sers技术与天然药物产物库相结合，通过表面增强拉曼散射对于影响目标蛋白互作的小分子进行垂钓和特异性的高通量筛选，通过质谱和红外光谱等技术完成对垂钓得到的分子进行结构验证。
6.包括以下步骤：
7.步骤s1，分别制备金属纳米粒子探针和磁珠探针；
8.步骤s2，将所述步骤s1制得的金属纳米粒子探针、磁珠探针分别与靶蛋白或靶蛋白结合受体蛋白偶联；
9.步骤s3，将所述步骤s2制得的金属纳米粒子探针或磁珠探针同时加入待筛选天然药物产物中，孵育；
10.步骤s4，将所述步骤s3中筛选出的带有靶向药物的探针通过离心或磁分离的方法分离出来；
11.步骤s5，将所述步骤s4分离出的探针通过酸性溶液洗脱，得到不含金属纳米粒子或磁珠微粒的靶向药物溶液；
12.步骤s6，将所述步骤s5得到的靶向药物溶液进行核磁共振、快速液相串联高分辨质谱或红外光谱学检测，确认其分子结构信息；
13.步骤s7，将制备的金属纳米粒子探针或磁珠探针与拉曼信号分子耦联，再将金属纳米粒子探针和磁珠探针分别与靶蛋白或靶蛋白结合受体蛋白耦联，加入s5垂钓筛选出的化合物；
14.步骤s8，检测拉曼信号，判断所述待筛选天然药物产物是否为靶向药物，所述靶向药物具有抑制或激活靶蛋白与其结合受体结合的活性；
15.在某些实施例中，所述天然药物产物为通过处理后的中药提取混合物。
16.在某些实施例中，所述金属纳米粒子探针为金纳米粒子探针或银纳米粒子探针。
17.在某些实施例中，所述拉曼信号分子为4
‑
mba或4
‑
abp。
18.在某些实施例中，所述靶蛋白为pd
‑
l1蛋白。
19.在某些实施例中，所述结合受体为具有能够与靶蛋白或核酸结合活性的受体蛋白。
20.在某些实施例中，所述步骤s8中的判断具体为：
21.若检测到sers信号明显由强变弱或由弱变强，则所述待筛选化合物为针对特定靶点的靶向药物；
22.若sers信号没有明显改变，则所述待筛选化合物非针对特定靶点的靶向药物。
23.在某些实施例中，所述方法还包括设置阳性对照，所述阳性对照为已知具有抑制靶蛋白与靶蛋白结合受体结合活性的化合物。
24.在某些实施例中，所述天然药物为穿心莲。
25.本发明首次将拉曼信号检测与天然药物产物库尤其是中药材提取混合物库结合，应用到基于分子垂钓的抑制剂或激动剂筛选技术领域，并结合金属纳米粒子及磁珠，在蛋白质互作水平上发生作用，形成简单灵敏的抑制剂筛选方法。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
27.图1为实施例3中两种拉曼探针制备及小分子抑制剂筛选过程示意图。
28.图2为实施例4中抑制剂的垂钓及回收过程示意图。
29.图3为实施例4中抑制剂回收后质谱检测结果。
30.图4为实施例5中垂钓后的抑制剂sers检测过程示意图。
具体实施方式
31.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。
32.实施例1制备金(银)纳米粒子
33.1.制备金纳米粒子
34.金纳米粒子(aunps)：取一只250ml三口烧瓶，用王水(1份浓硝酸加入3份浓盐酸)清洗，第二天取出冲洗干净后再用注射用水洗涤三次，保证壁内纯净无杂质。放入烘箱烘干，冷却至室温。烧瓶中加入2ml 1％的haucl4加水至200ml，接上冷凝管，用电热套加热至150℃，搅拌加热回流至微沸。加入2ml 1％柠檬酸钠，控制温度，观察颜色变化，从淡黄色到黑色(110℃
‑
120℃)，再到红色(90℃)，降温至90℃，保持该温度40min，得到金纳米粒子分散体系。
35.2.制备银纳米粒子
36.银纳米粒子(agnps)：取一只250ml三口烧瓶在酸缸浸泡过夜，第二天取出冲洗干净后再用注射用水洗涤三次，保证壁内纯净无杂质。放入烘箱烘干，冷却至室温。期间精确称量0.018g硝酸银粉末，小心倒入三口烧瓶中。加入100ml超纯水，摇匀，接上冷凝管并设定电热套温度为100℃，将溶液搅拌加热至微沸后立刻快速加入2ml 1％的柠檬酸钠溶液。观察溶液颜色变化：浅黄，到深黄，再到灰绿，观察到颜色不再发生变化，稍稍降温到90℃，继续磁力搅拌，维持40min得到银纳米粒子分散体系。用紫外分光光度计测定银纳米粒子的吸光度曲线：将银纳米粒子5倍稀释后检测，观察最大吸收波长范围(420
‑
480nm)正确，并没有其他杂峰，即可初步判断合成粒径均一。利用公式：a＝kbc(a＝amax，k＝3
×
10
11
m
‑1cm
‑1，b＝1cm)计算银纳米粒子的浓度。4℃保存备用。
37.实施例2磁纳米粒子的制备
38.百迈格生产的商品化羧基磁珠，配置浓度为0.5mg/ml，用磁珠保存液冲洗并磁分离重复三次，重悬在保存液中以防止磁珠聚集，于4℃保存备用。
39.实施例3合成pd
‑
l1蛋白抑制剂筛选相关的两种拉曼探针(拉曼信号分子偶联在银纳米粒子上)
40.具体过程如图1所示：
41.在pd
‑
1/pd
‑
l1方案中，银纳米粒子的合成方法同上。探针的制备，agnps(1.0ml,0.30nm)加入5.0μl 1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)(2.5mm)和5.0μl n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)(2.5mm)反应1h来活化agnps表面的羧基，离心除去多余的活化剂(4000g，7min)。之后加入3.0μl 1mg/ml pd
‑
1和20μl拉曼信号分子4
‑
氨基联苯(4
‑
aminobiphenyl,4
‑
abp)(5.0mm)偶联2小时，离心除去未偶联的pd
‑
1(4000g，7min)得到agnps4
‑
abp@pd
‑
1探针。
42.同理，使用5.0μl 100mm edc和100mm nhs活化表面修饰羧基的磁珠(400μl，
300nm，0.5mg/ml)，反应1h后，磁分离除去多余活化剂。加入3.0μl pd
‑
l1(1mg/ml)偶联2h,磁分离去除未偶联的pd
‑
l1，用pbs缓冲液重悬后得到mns@pd
‑
l1。
43.实施例4天然药物提取物混合物中抑制剂的筛选、垂钓及回收
44.从天然药物产物库中可以用拉曼探针垂钓其中可以开发成新药的抑制剂。样品经过简单前期处理，将中药材穿心莲研磨成粉末，用30倍80％乙醇浸泡，40℃40khz超声30min/次*3次，合并3次滤液，旋蒸。去离子水复溶，依次加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液旋蒸后可得到中药成分的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相。
45.具体过程如图2所示，金属球和磁珠通过亲和反应彼此靠近，当距离达到10nm内拉曼报告分子的信号会得到指数级的增强。在针对特定靶点的新药筛选过程中，当有药物结合在靶点上时，金属球和磁珠不能通过亲和反应彼此靠近，距离不能达到10nm内，拉曼报告分子仅有极弱的拉曼信号。之后用磁铁回收偶联磁珠的蛋白和结合的抑制剂，先用pbs清洗，再通过酸性溶液清洗，使蛋白结构改变，抑制剂脱落，离心取上清，回收中药活性分子抑制剂。进一步用核磁共振、质谱等方法进行结构鉴定，并用于后续的活性检测等。
46.以垂钓特异性针对pd
‑
1/pd
‑
l1有明确抑制效果的小分子抑制剂bms
‑
202为例，小分子抑制剂bms
‑
202可诱导pd
‑
l1的二聚化，并使人的pd
‑
1/pd
‑
l1复合物解离。将bms
‑
202加入到之前制备的穿心莲石油醚相，正丁醇相，乙酸乙酯相和水相中，与agmns融合pd
‑
l1银探针混合后，离心分离，用注射用水洗涤磁探针3次后，加入1％乙酸清洗去除银纳米粒子，离心取上清，上清液用冻干机冻干，去除水分和乙酸，收集样品进行质谱检测。从质谱分子量图中验证该小分子抑制剂是否可被垂钓；质谱结果图显示该小分子抑制剂(m/z＝378.2190)，在不同穿心莲萃取层中均可被金属纳米粒子探针所垂钓出来。结果如图3所示(图3中a，b，c分别为石油醚，乙酸乙酯，正丁醇相垂钓出的小分子抑制剂质谱检测结果)。
47.快速液相串联高分辨质谱方法：色谱条件，色谱柱为thermoscientific hypersil gold(50*2.1mm,1.9μm)，流动相为0.1％甲酸(a)
‑
乙腈(b)，流速为0.3ml/min，柱温为25℃，进样量为1μl；质谱条件，sheath gas flow rate:40，aux gas flow rate:15，sweep gas flow rate:0，spray voltage:3.25kv，capillary temp为250℃，s
‑
lens rf level为0，aux gas flow rate为300℃。
48.实施例5表面增强拉曼光谱仪检测垂钓得到的抑制剂的拉曼信号
49.具体过程如图4中所示，
50.(1)阴性对照：免疫亲和结构的评价
51.拉曼探针现用现配，按3：1的体积比例混合金属探针和磁探针，分别于孵育20分钟、30分钟，40分钟、50分钟、60分钟、过夜后进行取样，立即进行拉曼信号检测并做图，选择时间较短斜率较小而信号强的时间为拟定的孵育时间。
52.(2)实验组：免疫亲和抑制效力评价
53.准确吸取金属纳米粒子探针150μl和磁纳米粒子探针50μl，同时加入垂钓得到的1μg/ml化合物1μl，按得到的孵育时间孵育后分别在毛细玻璃管中或标准pcr管中进行拉曼信号检测，设定曝光时间为5s，曝光次数为10次取平均值，判断该化合物是否有抑制结合作用。拉曼信号变得很弱，说明有作为抑制剂的可能。
54.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本
发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。