用于评估癌症的种系风险的方法和组合物

用于评估癌症的种系风险的方法和组合物
1.本技术是申请号为201580050654.8的中国专利申请的分案申请，原申请是2015年8月19日提交的pct国际申请pct/us2015/045856于2017年3月20日进入中国国家阶段的申请。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求于2014年8月20日提交的美国临时申请no.62/039,691的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
4.本发明涉及基于分析循环血细胞的dna双链断裂(double stranded breakage，dsb)修复途径中的细胞质蛋白和核蛋白来评估癌症(例如，乳腺癌和卵巢癌)的种系风险的方法和组合物。


背景技术：

5.来自高风险乳腺癌家族的个体占发病病例的约10％。在这些个体中，在20％至40％的病例中可检测到brca1和brca2基因中的种系突变(tonin等，nature medicine，2：1179
‑
1183(1997))。其他中等至高外显率基因促成可遗传乳腺癌素质(mannucci等，chemosphere，(2012))。这些基因倾向于与brca1和brca2共享共同的途径并在dna的双链断裂修复中发挥作用。这些基因中的一些的纯合突变导致范科尼贫血(fanconi anemia，fa)、共济失调毛细血管扩张症和nijmegen断裂综合征。14个fa基因与brca1一起在常见dna修复途径中协同作用，并且如果突变的话，则表现出乳腺癌的风险。响应于dna损伤(图1)，atm(ataxia telangiectasia mutated，共济失调毛细血管扩张症突变的)和atr(ataxia telangiectasia and rad3
‑
related，共济失调毛细血管扩张症和rad3相关的)激酶激活包含fanca、b、c、e、f、g、l和m的fa核心复合物，然后其将fancd2和fanci单泛素化(monoubiquinate)。该复合物然后与其他下游蛋白质fancd1(brca2)、fancn(palb2)和fancj(brip1)相互作用以通过同源重组启动dna修复。brca1也已被鉴定为palb2/brca2复合物的上游调节子，促进其定位于dna损伤位点(casadei等，cancer res，71：2222
‑
2229(2011))。brca1主要作为与bard1的异二聚体存在，形成有助于brca1响应于dna损伤的泛素连接酶(starita等，cancer biol ther 5：137
‑
141(2006))。palb2、brip1和bard1基因突变与乳腺癌风险增加有关(seal等，nat genet 38：1239
‑
1241(2006)；stacey等，plos med 3：e217(2006))。
6.nijmegen断裂综合征是由nbn基因突变引起的小头畸形、生长迟缓、智力残基、免疫缺陷和恶性肿瘤风险增加的常染色体隐性染色体不稳定综合征(bogdanova等，int j cancer，122：802
‑
806(2008))。nbn与mre11a和rad50形成复合物以形成dna双链断裂修复所需的mre11复合物(heikkinen等，carcinogenesis，27：1593
‑
1599(2006)；desjardins等，bmc cancer，9：181)(2009))。该复合物响应于dna损伤而与brca1以及与fancd2共定位(wang等，genes dev，14：927
‑
939(2000))。已发现nbn、mre11a或rad50中的杂合突变与乳腺
癌风险增加有关(bogdanova等，int j cancer，122：802
‑
806(2008)；heikkinen等，carcinogenesis，27：1593
‑
1599(2006)；hsu等，cancer epidemiol biomarkers prev，16：2024
‑
2032(2007))。
7.已采用信息学方法来策展新鉴定的遗传变体以确定它们是否为致病性的。这些信息学方法将由进化序列保守模型(align
‑
gvgd)获得的因果关系的先验概率与变体在测序家族中与癌症分离的可能性如何进行组合，无论该变体是否与可见于已知的致病性突变(如果变体为致病性的，则其应当对于brca1为致死性的或对于brca2引起fa)、发病年龄和与变体相关的癌症类型以及相关乳腺肿瘤的组织学相组合。align
‑
gvgd方法的精度可以很高；然而，其需要对调用变体进行测序并且可能过于权衡高外显率变体，因为中等外显率变体将根本不显示与癌症表型共传递。


技术实现要素：

8.本发明涉及基于在循环血细胞中分析dna双链断裂(dsb)修复途径中的蛋白质来评估癌症(例如，乳腺癌和卵巢癌)的种系风险的方法和组合物。此途径中基因(brca1、brca2、fancd1、nbn及其他基因)的突变在纯合状态下可能为致死性的或者引起范科尼贫血(fa)以及在杂合状态下增加乳腺癌和卵巢癌风险。本文公开的方法测量由这些基因的变体引起的每种分子表型的功能性，其指示突变状态并且因此指示种系遗传风险。这些变体驱动的表型的鉴定可以作为dna测序的辅助手段实施，特别是用于注释不确定意义的变体时，或者作为风险评估的独立方法实施。
9.本发明的方法特别地可用于至少两个方面：(i)本发明的方法提供了通过基因测序鉴定的不确定意义的变体(variant of uncertain significance，vus)的功能注释；以及(ii)本发明的方法允许评价通过brca1和brca2的dna测序未鉴定到的种系风险。来自高风险乳腺癌家族的个体占发病病例的约10％。在这些个体中，在20％至40％的病例中可检测到brca1和brca2基因中的种系突变。在90％至95％的病例中，这些dna变体由于其是无义的小框外插入(out
‑
of
‑
frame insertion)或缺失突变、较大基因重排和截短剪接改变而可容易地显示出破坏基因功能。在5％至10％的dna测序测试中(在一些国家中更高)，鉴定到vus。在剩余60％至80％的来自高风险家族的个体中，突变可见于brca1
‑
fa途径中的其他基因中。注释这些基因中鉴定到的变体可能存在与当注释brca1和brca2中的变体时面临的那些困难相同的困难。在未定义百分比的病例中，无法在已知的风险基因中发现突变。
10.除了对突变进行分类之外，这些新方法也可以代表用于鉴定功能上重要的遗传变体的基因组测序的替代方案。大多数的测序方法在范围和深度上受到限制，其中某些基因组区域难以捕获、扩增或组装。这些限制通常导致包含小于整个期望区域的完成序列。因此，可能错过重要的功能变体。蛋白质水平上的直接功能测试通过查询关键生物学功能是否受到损害而绕过这一担忧，并且因此可以对鉴定遗传风险更灵敏和更具特异性。由于这些测定使用标准试剂(商业抗体和磁珠)和容易获得的技术(流式细胞术)，故使得它们自身易于在研究和临床实验室环境中采用，同时最小地改变设备和工作流程。
附图说明
11.图1.显示结合配偶体和结合位点的brca1蛋白的图。细胞系包括已知的致病性突
变(红色)、良性野生型变体(蓝色)和vus(紫色)。
12.图2.在拟辐射剂(radiomimetic agent)存在下的细胞培养降低携带brca1突变和拟表型的细胞系中的核定位。箱线图比较了对照(cntrls)、不确定意义的变体(vus)、拟表型(phenocopy,pheno
‑
c)或突变体(muts)lcl的brca1响应于丝裂霉素c(mitomycin c，mmc)、博来霉素(bleo)、二环氧丁烷(deb)或组合(combo)处理的标准化定位。示出了通过曼
‑
惠特尼检验(mann
‑
whitney test)的处理组相对于对照的各种分布的成对比较的p值。
13.图3.在携带brca1突变和拟表型的细胞系中，brca1与相互作用蛋白的结合降低。箱线图比较了对照(cntrls)、不确定意义的变体(vus)、拟表型(pheno
‑
c)或突变体(muts)lcl中palb2、bard1、fancd2和brca2与brca1的归一化结合。示出了通过曼
‑
惠特尼检验的处理组相对于对照的各种分布的成对比较的p值。
14.图4.在携带brca1突变和拟表型细胞系中，p53的磷酸化降低。箱线图比较了对照(cntrls)、不确定意义的变体(vus)、拟表型(pheno
‑
c)或突变体(muts)lcl中通过dcw核定位测量的归一化磷酸化p53、总p53和磷酸化p53/总p53比值。示出了通过曼
‑
惠特尼检验的处理组相对于对照的各种分布的成对比较的p值。
15.图5.携带brca1突变和拟表型细胞系形成独特的簇。蛋白质结合、p53磷酸化和核定位测定的热图显示出两个簇—突变体和拟表型(左)，和对照(右)。突变体和拟表型相互交叉，表明它们的相似性，对照和vus相互交叉，表明它们的相似性。b1＝brca1，b2＝brca2，1＝对照，3＝vus，5＝突变体，6＝拟表型。
16.图6.核定位测定具有小的变异系数(cv)。单独核定位测定的cv的箱线图。
17.图7.brca1与相互作用蛋白的结合测定具有小的变异系数(cv)。单独brca1蛋白结合测定的cv的箱线图。
18.图8.p53磷酸化测定具有小的变异系数(cv)。单独p53磷酸化测定的cv的箱线图。
19.图9.每个单独的fva相对于所有其他fva的关联图。矩阵中存在的测定之间的比较，其中1为最高(磷酸化p53与brca1 mmc以及brca1 deb与brca1 combo)而0.1为最低(bard1与fancd2)。
具体实施方式
20.本文公开的用于评估乳腺癌或卵巢癌之种系风险的方法基于来自目的对象(特别是人对象)全血的白细胞(white blood cell，wbc)的功能变体分析(functional variant analysis，fva)。
21.如本文使用的短语“白细胞”包括淋巴细胞(即，t细胞和b细胞)、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。在一些具体实施方案中，分离b细胞并将其用于分析。
22.如本文使用的术语“功能变体分析”是指设计用于确定目的基因的变体的功能表型，即目的基因的变体是否编码有功能的、有部分功能的或非有功能的蛋白质的分析。蛋白质的功能性(functionality)根据蛋白质的生物学功能可在多种测定中进行评价，并且在许多情况下可与疾病(例如，癌症)的致病性相关。如果确定所编码蛋白质的功能性为野生型基因所编码蛋白质的功能性的至少80％、85％、90％、95％或更高，则目的基因的变体编码有功能的蛋白质。有功能的变体包括功能增益变体，即，与由野生型基因编码的蛋白质相
比，所编码蛋白质的功能性提高至少10％、15％、20％、25％、50％、75％或更多。如果确定所编码蛋白质的功能性为野生型基因所编码蛋白质的功能性的20％至80％，例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％，则目的基因的变体编码有部分功能的蛋白质。如果确定所编码蛋白质的功能性小于野生型基因所编码蛋白质的功能性的20％、15％、10％、5％或更低，则目的基因的变体编码非有功能的蛋白质。
23.在一些实施方案中，功能变体分析被设计为评价dna双链断裂(dsb)修复途径中基因的变体的功能性。这样的基因包括例如atm、brca1、brca2、palb2、fanc基因组(例如，fancd2、fancc、fancf)、nbn、bard1、p53、rad50/51、nbs1、abraxas、ctip和dna连接酶基因。
24.在一些具体实施方案中，功能变体分析被设计为评价brca1或其他dsb修复基因的变体是否显示破坏或降低响应于dna损伤的brca1与其蛋白质配偶体(例如，palb2、brca2或fancd2)结合，破坏或降低响应于dna损伤的p53磷酸化，和/或破坏或降低响应于dna损伤的brca1复合物向细胞核转运。
25.根据本公开内容，将dna损伤剂施用于细胞(即，白细胞)以允许显现和评价brca1或其他dsb修复基因的变体的功能性。适用于本发明的dna损伤剂包括引起dna双链断裂或dna交联的所有试剂，包括辐射，例如uv(200
‑
400nm)及在其他频率下的辐射(例如，x射线、γ射线)；热破坏；化合物，例如已知诱变剂(例如，mmc、deb、bleo)；及其组合。
26.然后，在一种或更多种功能变体分析(fva)测定中分析经dna损伤剂处理的细胞。然后，将结果与对照值进行比较，所述对照值例如，来自具有已知与乳腺癌和/或卵巢癌相关的变体的细胞和/或具有已知不与乳腺癌或卵巢癌相关的基因序列的正常型细胞的值。对照值可以基于早先时间的评估提供，或者可以基于与测试细胞平行(side
‑
by side)进行的评估获得。
27.根据本公开内容，可以进行一种或更多种fva测定以确定brca1基因和/或其他dsb基因的变体的功能性，从而确定对象患有或发生乳腺癌和/或卵巢癌的风险。在一些实施方案中，进行一种fva测定，并且所述fva测定选自brca1核定位测定、结合测定(配偶体如palb2、brca2或fancd2与brca1的结合)或p53磷酸化测定。在一些具体实施方案中，fva测定是brca1核定位测定。在另一些实施方案中，进行至少两种fva测定。在一些实施方案中，两种fva测定选自表2中具有至少0.82的“r”值的那些对。在另一些实施方案中，两种fva测定选自表2中具有至少0.84的“r”值的那些对。在又一些实施方案中，两种fva测定选自表2中具有至少0.91的“r”值的那些对。在一些具体实施方案中，两种fva测定选自响应于mmc的p53磷酸化测定和brca1核定位测定的组合，或者响应于deb的brca1核定位测定与响应于mmc、deb和bleo之混合物(cocktail)的brca1核定位测定的组合。多种fva测定的进行使得更精确地确定对象中存在的变体是否为致病性(即，与癌症有关)。
28.对于每种类型的fva测定，可以使用任何常规测定形式。例如，为了评价brca1核定位，可以使用常规的western印迹分析、elisa及任何其他合适的蛋白质测定。在一些具体实施方案中，如实施例中所示使用数字细胞western(digital cell western；dcw)核定位，其需要少得多的起始细胞并且更快且更灵敏。类似地，为了评价蛋白质与brca1的结合，可利用常规的免疫沉淀。在一些具体实施方案中，使用利用磁珠、差别设门(differential gating)和流式细胞术的高通量形式。为了评价p53磷酸化，可以使用用于测定p53磷酸化的常规方法，但是在一些具体实施方案中，如实施例中所示使用数字细胞western(dcw)核定
位。
29.基于fva分析的结果，可以确定brca1基因或其他dsb修复基因的变体是否可能与乳腺癌和/或卵巢癌有关。应当注意，本发明的方法无需用确定性或序列结果预测即可确定可能性或风险。例如，当fva测定是brca1核定位测定时，与正常细胞相比受试细胞中brca1核定位的显著降低指示对象中的brca1变体可能是与癌症有关的变体。
30.通过以下实施例对本说明书进行进一步举例说明，这些实施例不应被解释为以任何方式限制。所有引用的参考文献(包括如本技术通篇引用的参考文献、授权专利和公开的专利申请)的内容通过引用明确地并入本文。
31.实施例1.数字细胞western和核定位测定
32.本实施例描述了用于数字细胞western和核定位测定的示例性方案和试剂。
33.a.固定细胞
‑
贴壁细胞方案：
34.1.在固定之前，用胰蛋白酶处理贴壁细胞并在50ml falcon管中收集培养物。
35.2.涡旋，对细胞进行计数(在管中20μl台盼蓝+20μl细胞培养物，然后将10μl混合物置于countess细胞计数室载玻片上)并记录。
36.3.离心以除去培养基
‑
胰蛋白酶混合物并用500μl培养基使细胞重悬。
37.如果存在较大的沉淀，则添加更多的培养基。
38.4.通过吸移来混合细胞以避免在固定之前发生任何成团或将聚集的细胞作为整体固定。
39.5.向细胞中添加1/5或100μl的“抑制剂混合物(inhibitor mix cocktail)”。
40.6.通过短暂涡旋混合并在37℃,5％co2下孵育10分钟。
41.7.如果使用较大体积的固定培养基(fixation media)，则离心细胞以沉淀并从falcon管中移除所有培养基。
42.8.添加1
‑
25ml冰冷的甲醇(取决于期望的细胞密度)，涡旋并置于冰上5分钟或更长的时间。
43.9.可将细胞转移至储存管或板，其应当是密封的以避免甲醇蒸发。
44.10.细胞可以在
‑
80℃下储存长达2年或在4℃下储存一周。如果运输距离短于一周，则细胞的运输应当在干冰或冷袋上进行。
45.b.使荧光团与抗体缀合：
46.使用novus biologicals试剂盒：lightning link r
‑
藻红蛋白缀合试剂盒方案#703
‑
0010。
47.1.对于每10μl待标记的抗体添加1μl ll改性剂试剂(10x储液)(总计10μl)。轻轻混合。
48.2.从lightning
‑
link
‑
抗体混合物的小瓶上移除旋盖，并将混合物直接吸移入小瓶中的冻干材料中。通过使用移液管将液体取出并重新分配一次或两次来轻轻地重悬，在室温下在抽屉(黑暗)中孵育过夜。
49.3.在
‑
20℃下储存。
50.c.使抗体/荧光团缀合到珠上：
51.免疫共沉淀试剂盒
‑
目录号14321d。
52.抗体偶联方案(步骤#3)
‑
如果还未这样做，则将珠以10mg/ml重悬于储存缓冲液
中；使用1ml的珠。每1mg珠使用5μg抗体＝总计50μg抗体。
53.第1天：
54.1.对磁体进行消毒以防止意外样品污染。
55.2.吸移合适量的m
‑
270epoxy(参见下表中抗体和c1体积的计算)。
56.3.用1ml c1洗涤珠并通过涡旋或吸移混合。
57.4.将管置于磁体上1分钟并允许在管壁处收集珠。除去上清液。
58.5.向经洗涤的珠添加合适体积的抗体+c1(参见下表中抗体和c1体积的计算)，并通过轻轻涡旋或吸移混合。
59.实例：如果要偶联5mgm
‑
270epoxy并且所需抗体量的体积为100μl，则应添加150μl的c1(即，250μlc1
–
100μlab＝150μl)。
60.6.添加合适体积的c2并通过轻轻涡旋或吸移混合。
61.抗体和c1体积的计算
62.一般来说，c1+ab体积等于c2体积。总反应体积(c1+μlab+c2)应为100μl/mg珠。
63.7.在37℃下在滚筒(roller)上孵育过夜(16小时至24小时)。管中的流体应当充分混合。
64.第2天
65.1.将管置于磁体上1分钟并允许在管壁处收集珠。除去上清液。
66.2.hb洗涤：添加合适体积的hb并通过涡旋或吸移混合。珠(mg)体积hb(μl)10mg珠＝800μl hb
67.3.将管置于磁体上1分钟并允许在管壁处收集珠。除去上清液。
68.4.lb洗涤：添加合适体积的lb并通过涡旋或吸移混合。10mg珠＝800μl lb
69.5.将管置于磁体上1分钟并允许在管壁处收集珠。除去上清液。
70.6.短暂sb洗涤：添加合适体积的sb并通过涡旋或吸移混合。10mg珠＝800μl lb
71.7.将管置于磁体上1分钟并允许在管壁处收集珠。除去上清液。
72.8.再次重复短暂sb洗涤。
73.9.长时sb洗涤：添加合适体积的sb并通过涡旋或吸移混合。10mg珠＝800μl lb
74.10.在室温下在滚筒/旋转器上孵育15分钟。
75.11.将管置于磁体上1分钟并允许在管壁处收集珠。除去上清液。
76.12.使抗体偶联的珠重悬于100μl sb/mg珠中并在2℃至8℃下储存直至使用。
77.10mg珠＝1ml sb缓冲液
78.最终珠浓度为10mg/ml抗体偶联的珠。
79.d.使细胞与抗体/荧光团/珠复合物组合：
80.1.在96孔板上每个孔使用甲醇中的200,000(2
×
105)个固定细胞。
81.2.以5,000g旋转5分钟以使细胞沉淀。
82.3.通过温柔的倾倒(flick)和干燥除去甲醇。
83.4.用200μl通用fva缓冲液洗涤
‑
以5,000g旋转5分钟以使细胞沉淀。通过温柔的倾倒和干燥除去上清液。
84.5.重复步骤#4。
85.6.使细胞重悬于20μl通用fva缓冲液中。
86.7.确定实验需要多少抗体
‑
每使用10μl抗体，添加1μl ll淬灭剂(10x储存液)试剂。
87.8.将抗体以期望的浓度(默认为1:20稀释度)添加至96孔板中的20μl细胞中。
88.9.在冰上孵育30分钟(当可用时建议在摇床上)。
89.10.为了洗涤，将200μl通用fva缓冲液直接添加到96孔板中并以5,000g旋转5分钟以使细胞沉淀，温柔的倾倒以除去上清液，再次重复洗涤。
90.11.重悬于180μl通用fva缓冲液中，并将板置于冰上直至运行。
91.12.在液流供料机(flow machine)上运行(设置机器需要30分钟，所以早点完成设置)。
92.缀合细胞/抗体在10小时内有效。信号衰减在2小时时开始。
93.dcw核定位测定短方案：
94.作为一个实例，对于brca1 fva核定位测定，使培养的细胞血清饥饿24小时，之后在通过载剂或以下拟辐射药物处理24小时：0.1μg/ml博来霉素，0.5μg/ml 1,3
‑
丁二烯二环氧化物(1,3
‑
butadiene diepoxide,deb)和/或1.5μg/ml丝裂霉素c(mmc)或者其组合。
95.对于细胞的核提取，将200,000个细胞用pbs洗涤，然后使用细胞裂解缓冲液(例如，active motive 10x低张缓冲液，目录号40010)进行裂解。这导致约至少50％细胞的细胞裂解。然后使制备物旋转，并使包含细胞核和未裂解细胞的沉淀重悬于通用fva缓冲液(50mm tris
‑
hcl钠ph7.4，0.02％叠氮化钠)中。用荧光染料缀合的抗brca1和针对区分完整细胞与细胞核群体的细胞质标志物的抗体(例如，内质网检测抗体)探测整个制备物。在量化之前，还用dapi染色样品并流式分选。
96.在流式细胞仪上使用前向散射(forward scatter，fsc)和侧向散射(side scatter，ssc)参数来调整尺寸和复杂性以捕获异质珠群(至少5倍差异)，对于fsc和ssc两者的低设置，设置应当设定为对数标度。然后，对样品的目的群体将停止门限定为至少50,000个事件。
97.在dynal磁珠上通过fva免疫共沉淀珠测定来测量内源性突变体brca1
‑
相互作用蛋白的结合。使用brca1作为诱饵，使用荧光染料缀合的一抗来设门和量化配偶体(不受限制，例如brca2、palb2、bard1和fancd2)的结合。在突变体、vus和野生型lcl中比较蛋白质复合物的结合。
98.试剂
99.多聚甲醛(20x)或甲醛溶液
100.1.将10g的em级多聚甲醛添加到25ml的1x pbs中。
101.2.添加1ml naoh(约4粒)并在约60℃下在加热块上轻轻搅拌直至pfa溶解。使混合物在室温下冷却。
102.3.用1m hcl调节ph至7.4，然后通过添加25ml pbs将最终体积调节至50ml。
103.4.通过0.45μm(或更小)膜过滤器过滤溶液以除去任何特定物质。
104.5.在
‑
20℃下等分储存数月。避免光源和反复冷冻/解冻。
105.甲醛溶液：sigma#f8775
‑
25 ml。
106.抑制剂
‑
固定混合物(10x)
genet，8：387
‑
391(1994)；serova等，am j hum genet，58：42
‑
51(1996))，插入缺失(indel)(c.66_67delag)(struewing等，nat genet，11：198
‑
200(1995))，或者在ring结构域中的单核苷酸变体(p.cys61gly)(gorski等，am j hum genet，66：1963
‑
1968(2000))，dna结合结构域中的单核苷酸变体(p.ser1040asn)(friedman等，nat genet，8：399
‑
404(1994))，卷曲螺旋结构域中的单核苷酸变体(p.arg1443gly)(castilla等，nat genet，8：387
‑
391(1994))或bcrt结构域中的单核苷酸变体(p.val1713ala)(表1)(struewing等，am j hum genet，57：1
‑
7(1995)；carvalho等，cancer res，67：1494
‑
1501(2007))。对于次要等位基因(minor allele)，将具有可测量的纯合子频率的变体(p.asp693asn，p.ser784leu，p.pro871leu，p.glu1038gly，p.lys1183arg，p.ser1613gly)归类为良性，并将剩余的(p.gln356arg，p.arg841trp，p.tyr856his，p.glu1250lys)归类为vus。对于来自千人基因组计划的具有良性变体或vus的细胞系，基因组序列的检查表明一种细胞系na20412具有两种vus(p.arg841trp和p.s993n)。剩余的细胞系在已知的乳腺癌基因中没有致病性突变(参见表1)。因此，有一个可能的例外，具有良性变体的细胞系真正代表对照。在此报道的测定显示在9次重复中具有小的变异系数(cv)，表明各自的定量和可重复性质(图6至8)。对照的cv与突变体以及拟表型和vus的cv之间的成对比较使用精确版本的曼
‑
惠特尼检验进行，并且在所有比较中均产生不显著的p值。
129.brca1中的突变改变brca1响应于拟辐射剂的核定位
‑
brca1、brca2、palb2、bard1、fancd2及该蛋白质复合物的其他成员在细胞周期的s期期间共定位并形成核灶区(nuclear foci)(scully等，cell，88：265
‑
275(1997)；chen等，mol cell，2：317
‑
328(1998))。由其沿着减数分裂细胞中联会复合体定位可知，其在重组和基因组完整性中发挥作用。形成核灶区的过程由促进dna损伤的试剂触发(venkitaraman，annu rev pathol，4：461
‑
487(2009))。为了测试这样的拟辐射dna损伤剂对brca1核定位的影响，用dna交联药物mmc和deb，以及dna断裂药物bleo单独地和三者组合地处理同步lcl，然后测量总brca1和核brca1。对于单独的deb(曼
‑
惠特尼检验p＝0.001)、mmc(p＝0.029)、bleo(p＝0.001)或药物联合处理(p＝0.001)二者，与对照相比，具有brca1突变的lcl中核brca1的标准化(以均值为中心，每次测定按比例调整标准差)量降低(图2)。因此，这些核定位测定可以容易地区分已知突变与野生型对照。brca1核定位测定显示出彼此之间的强相关性；对于deb和bleo处理观察到最强的相关性(图9)。
130.brca1中的突变改变与辅因子palb2、brca2和fancd2的结合。brca1中的突变如下影响与辅因子的结合
‑
通过修饰结合发生的位点，通过修饰brca1蛋白的折叠和蛋白质结合位点，或者通过修饰细胞内brca1的量。bard1与ring结构域结合，palb2与卷曲螺旋结构域结合。其他因子不直接与brca1结合，而是与brca1的结合配偶体结合形成蛋白质结合复合物(图1)。如在蛋白质免疫共沉淀测定中观察到的，与对照lcl相比，在突变体lcl中，brca1与palb2(曼
‑
惠特尼p＝0.01)和fancd2(p＝0.02)的结合显著降低，但是与bard1和brca2的结合则不然(图3)。因此，这些结合测定中的两个将高风险突变与良性变体区分开。这些蛋白质与brca1的结合在对照和vus细胞系中是相同的。这些palb2、brca2和fancd2结合测定显示出彼此之间的强相关性，反映了这些因子彼此已知的相互作用以及它们在启动同源重组中的共有作用(参见图9)(d'andrea，n engl j med，362：1909
‑
1919(2010))。
131.brca1中的突变降低p53的磷酸化。brca1的功能之一是使p53磷酸化，这是可以被
brca1基因中的突变改变的活性。对于每种细胞系，通过数字细胞western技术测量总p53和磷酸化p53两者。总p53在对照、brca1突变体和vus lcl中相同(图4)。与对照lcl相比，在突变体lcl中磷酸化p53和磷酸化p53/总p53比值减小(分别为曼
‑
惠特尼p＝0.007，p＝0.005)；因此，测量磷酸化p53可以提高鉴定突变的准确性。磷酸化p53和磷酸化p53/总p53比值彼此强烈相关并且还与核定位测定相关，特别是在用deb、bleo或组合处理后(参见图9)。
132.包括brca2、fancd2、fancc、atm和nbn拟表型的brca1突变簇。所有这些测定的无监督聚类分析(unsupervised cluster analysis)的热图显示出两个明显的簇，暗示两个类别，彼此相互交错的突变体以及聚类在一起的对照和vus(图5)。vus和对照的重叠与>80％的vus代表良性变体的先前报道一致。6在所有这些测定中评估了lcl中brca2中的致病性突变(p.ser1982argfs，c.983del4，c.6503deltt，p.tyr42cys，c.6174delt，c.6426deltt，p.lys3326ter和p.trp194ter)以及fancd2(p.arg1236his)、fancc(c.456+4a＞t)、fancf(p.gln6ter)、atm(c.6404instt，p.trp2638ter)和nbn(c.657del5)中的单致病性突变。这些突变细胞系显示deb(曼
‑
惠特尼p＝0.01)、bleo(p＝0.01)和组合核定位测定(p＝0.01)；p53磷酸化测定(p＝0.04)；以及磷酸化p53/总p53比值(p＝0.038)降低，表明brca1中突变的拟表型(图2、4和5)。热图证明，brca2、fancc和nbn lcl与brca1突变相互交错，支持了它们代表拟表型的见解。对于这些突变体lcl，未观察到palb2、brca2和fancd2与brca1的结合降低。这些结果表明核定位测定可以充当鉴定dsb修复途径中的致病性突变的基础，而结合测定可以用于区分brca1中的突变与其他基因中的突变。
133.讨论
134.开发了使用具有荧光标记抗体的经改进流式细胞术的fva以满足高通量定量免疫测定的需求，所述免疫测定评估遗传变体对蛋白质定量、翻译后修饰和与其他蛋白质相互作用的表型效应。选择这些测定法评估brca1及其结合配偶体在控制监测dsb和dna交联之大分子复合物的组装和活性中的作用，这种作用之前被称为“染色体监管者(chromosomal custodian)(venkitaraman，science 343：1470
‑
1475(2014))”。
135.fva包括两种主要方法。在dcw核定位中，使荧光探针在室温下迅速退火至透化的固定细胞，并用经改进的流式细胞术进行评估以量化蛋白质及其翻译后修饰。基于单个信号强度，对每个细胞独立地测量其蛋白质表达水平。对于每个实验，将100,000至一百万个数据点归一化并计算为数字值，因此为数字细胞western。在此，该技术被改进为不仅包括总p53和磷酸化p53的测量，而且还包括完整细胞或核级分中brca1的测量。转而，通过使细胞暴露于拟辐射药物mmc、deb和bleo来增强brca1的核定位。在蛋白质免疫共沉淀测定中，使特异性蛋白质复合物与抗体偶联的珠基质结合，然后量化与各种结合配偶体的相互作用。在brca1的情况下，结合的蛋白质包括palb2、fancd2、brca2和bard1。这些fva对于多种分析物而言为快速、定量、低成本和模块化的。因此，它们可以容易地适用于临床实验室，不同于先前所述需要转染、使用非宿主细胞和延长培养期的转录激活、小集落表型、拯救辐射抗性、泛素连接酶活性或者顺铂或parb抑制剂敏感性互补测定，(carvalho等，int j biochem cell biol，39：298
‑
310(2007)；bouwman等，cancer discov，3：1142
‑
1155(2013))。例如，相对于fva的2天，小鼠es细胞中的顺铂或parb抑制剂敏感性互补测定从开始到结束需要8周(bouwman等，cancer discov，3：1142
‑
1155(2013))。对于每个测定收集的
合计(aggregate)大量数据点确保结果为具有窄cv的高度定量，并且因此可测量不同变体或处理条件之间的小差异。所述测定可以评估brca1基因的任何变体，并不如先前所述的蛋白酶解、磷酸肽结合和转录激活测定那样局限于brct结构域(lee等，cancer res，70：4880
‑
4890(2010))。
136.当将fva应用于brca1变体时，观察到三种不同的种类
‑
完全功能丧失的突变，其分子效应超过阈值并产生定位降低、结合降低和磷酸化降低的物理表型；部分功能丧失或亚效等位基因，其分子效应对于一些测定降低，而对于另一些测定则不降低，并且不产生公认的物理表型(在热图(图5)中观察为红色或深橙色的块)；以及正常变体，其活性相对于多个对照对于多种测定为恒定的。先前已经观察到一些brca1变体的亚效等位基因，例如brca1的brct结构域中的p.arg1699gln，其消除了microrna
‑
155的阻抑并且与癌症风险增加2倍有关(chang等，nat med，17：1275
‑
1282(2011))。大多数fva彼此相关。成对相关分析表明，响应于拟辐射剂的一种核定位测定和磷酸化p53测定将足以捕获该数据组中表型效应的范围。当聚类时，这些测定使一些等位基因的亚效作用钝化并导致两个总体等位基因类别
‑
突变和良性变体。如所示，这一发现与随着另外数据的累积，大多数vus已随着时间被重新分类为良性变体的观察结果一致(murray等，genet med，13：998
‑
1005(2011))。这些观察结果与先前的建议一致，即，基因杂合性足以用于癌症素质，并且可能引发在许多细胞分裂中积累的低但在数量上显著的基因组不稳定性水平(venkitaraman，science 343：1470
‑
1475(2014))。
137.在检查的突变体中，其他dsb修复基因中的突变产生brca1中突变的拟表型。反映出共享机制：brca2和fancd2与brca1复合物结合，而nbn与该复合物共定位在dsb位置处。这些观察结果表明，这套fva不仅可以评估brca1中vus的风险，而且可以评估dsb途径中基因中的任何vus的风险。显然，为了实现临床效用，必须将测定调整至循环b细胞(或表达这些蛋白质的其他循环细胞)，并在更宽的变体范围内进行测试以了解其准确性。为了实现临床效用和有效性，可以将测定调整至循环b细胞(或表达这些蛋白质的其他循环细胞)。正如所示，可以仅需要两种测定。这些测定在已鉴定到vus时可以充当测序的辅助手段，或者也可以独立用于评估乳腺和卵巢癌风险而无需测序。
138.材料和方法
139.细胞系和突变。来自对象的类淋巴母细胞细胞系(lymphoblastoid cell line，lcl)购自coriell institute人遗传细胞库(camden，nj)，所述对象具有brca1(gm14097p.cys61gly，gm14090c.66_67de1ag，gm20412p.arg841trp，gm13711p.ser1040asn，gm13713p.glu1250ter，gm14637p.arg1443ter，gm13710p.arg1443gly，gm13708p.tyr1563ter，gm14092p.val1713ala)brca2，(gm14805p.trp194ter，gm14170p.ser1982argfs，gm14622c.6503deltt，gm14623p.tyr42cyys，gm146224p.ser1982argfs，gm14626p.lys3326ter，gm14639c.6426deltt，gm14788c.983del4)，fancc(gm20731c.456+4a＞t)，fancd2(gm16756p.arg1236his)，fancf(gm16757p.gln6ter)，atm(gm01525c.6404instt，gm03332p.trp2638ter(儿子)、gm03334p.trp2638ter(父母))和nbn(gm15788c.657_661del5)中序列鉴定的变体。具有来自千人基因组计划的brca1基因中其他序列鉴定的变体(gm12873p.gln356arg，hg00099p.asp693asn，gm19740p.ser784leu，
gm18628p.tyr856his，gm11995p.pro871arg，gm10850p.glu1038gly，gm07056p.lys1183arg，gm19084p.glu1250lys，gm11894p.ser1613gly)的lcl也购自coriell institute。将变体分为致病性突变、良性变体或不确定意义的变体(vus)(表1)。致病性变体是截短终止获得或插入缺失，或在数据库和研究中具有致病性的一致报道的snv。对于次要等位基因，将观察到brca1基因纯合子的变体归类为良性的，因为据报道有害突变的纯合子为胚胎致死性的(hakem等，cell，85：1009
‑
1023(1996)；gowen等，nat genet，12：191
‑
194(1996))。将报道不一致的变体归类为vus。
140.分析来自千人基因组计划的细胞系的序列在其他基因中的突变，所述基因被报道为当产生突变时乳腺癌中度至高度浸透(axin2、bard1、bmpr1a、brca1、brca2、fancd2、gen1、mlh1、palb2、pold1、pole、pms2、rad51c、rad51d、tp53、xrcc2)。通过文献综述以及国立卫生研究院(national institutes of health)在ncbi网站在clinvar的报道和由国立卫生研究院提供的乳腺癌信息核心数据库(breast cancer information core database)进行变体注释。
141.将ebv无限增殖化b
‑
类淋巴母细胞系分别维持在补充有10％和15％胎牛血清的rpmi 1640和dmem中，并根据制造商的建议(gibco，life technologies，grandisland，ny，usa)在co2包套的37℃培养箱中培养。在所有实验之前，使细胞饥饿24小时以进行细胞同步化。这项研究得到了阿尔伯特爱因斯坦医学院的机构审查委员会(the institutional review board of the albert einstein college of medicine)的批准。
142.抗体和功能变体分析。获得天然或磷酸化形式蛋白质的抗体。对于蛋白质免疫共沉淀测定，使用以下抗体：brca1(origene ta310042)、brca2(origene ta313520)、palb2(origene ta306814)、bard1(origene ta313499)、fancd2(origene ta307630)、总p53(bd554294)和磷酸化p53(bd560282)。将brca1抗体共价偶联至磁珠，并测定结合效率高于90％(数据未示出)。将所有抗体与荧光染料缀合(innova bio lightning
‑
link apc：326
‑
0010，fitc：322
‑
0010，pecy7：762
‑
0010，apccy7：765
‑
0010，pecy5.5：761
‑
0010和rpe：703
‑
0010)。
143.功能变体分析(fva)。分析的一般方法包括细胞培养+/
‑
使用拟辐射剂。细胞培养之后是细胞固定和透化，细胞或者细胞裂解内经标记抗体的结合，brca1蛋白复合物与珠的结合，以及随后抗体与相互作用蛋白的结合。对于典型的实验，在37℃与5％co2下，将2百万个分离的lcl在6孔板的每个孔中在补充有15％(v/v)fbs(指定级)、50单位/ml青霉素和50g/ml链霉素的rpmi培养基(invitrogen a2780)中进行悬浮培养。各自进行三个生物学重复和三个技术重复。前述方法(loke等，clin genet，81：272
‑
277(2012)；loke等，hum mol genet，23：1073
‑
1083(2014))进行如下改进：
144.对于brca1核定位测定，使培养的细胞血清饥饿24小时，之后通过载剂或以下拟辐射药物处理24小时：0.1μg/ml博来霉素、0.5μg/ml 1,3
‑
丁二烯二环氧化物(deb)和/或1.5μg/ml丝裂霉素c(mmc)或组合。对于细胞的核提取，用pbs洗涤在96孔板中培养的200,000个细胞，然后使用细胞裂解缓冲液(20mm tris
‑
hcl(ph 7.4)、150mm nacl、10mm mgcl2、2mm edta、10％甘油、1％np
‑
40、1％triton x
‑
100、2.5mmβ
‑
甘油磷酸盐、1mm naf、1mm二硫苏糖醇和完全蛋白酶抑制剂
‑
roche)裂解。这导致约50％细胞的细胞裂解。通过离心收集细胞核和完整细胞，然后重悬于通用fva缓冲液(50mm tris
‑
hcl ph 7.4、100mm nacl、5％fbs、
0.02％叠氮化钠)中。用荧光染料缀合的抗brca1和内质网抗体(全细胞识别)探测整个制备物，用dapi染色并通过bdfacsriaii和bd canto ii进行分析。
145.在dynabeads上通过fva免疫共沉淀测定来测量brca1
‑
相互作用蛋白的结合。使用brca1作为诱饵，使用荧光染料缀合的抗体设门和量化brca2、palb2、bard1和fancd2的结合。比较突变体、vus和野生型lcl的结合。
146.通过fva数字细胞western分析测量总p53和磷酸化p53的相对丰度，如前所述，使用荧光染料缀合的抗天然和抗磷酸化蛋白抗体量化细胞中的erk1/2和p38(loke等，clin genet，81：272
‑
277(2012)；loke等，hum mol genet，23：1073
‑
1083(2014))。比较突变体、vus和野生型lcl的量化的总p53、磷酸化p53和磷酸化p53/总p53比值。
147.定量分析。使用配备有蓝色(488nm)、绿色(532nm)、黄色(561nm)、红色(638nm)和紫色(407nm)激光的bd facsaria ii和bd canto ii进行流式细胞术。简言之，将侧向散射高度(side
‑
scatter height，ssc
‑
h)对侧向散射宽度(side
‑
scatter width，ssc
‑
w)作图以排除双峰并鉴定固定的完整细胞和细胞核。将每个目标信号相对于单个细胞/珠测量的总设门群体归一化。所有实验均用单一颜色对照标准化，所述单一颜色对照利用所述的方法使用与dynabeads缀合的荧光团标记的靶抗体制备而成(19)。为了使结果在测定和细胞类型之间可比较，在测定基础上对强度信号进行对数转换和标准化(以均值为中心，按比例调整标准偏差)。对来自单独测定的所有技术重复进行无监督分层聚类分析，并且显示为树状图和热图。对于每种单独的细胞系测定计算9个技术重复的平均值，并且进行箱线图和曼
‑
惠特尼检验以确定核定位、蛋白质结合和p53磷酸化的差异在来自野生型和其他亚群(拟表型和突变体)的细胞系之间是否显著。使用pearson相关矩阵来评估和呈现测定之间的依赖性(参见图6)。使用所有11种测定，使用k＝2的k
‑
均值聚类将样品(即，细胞系)群分成k＝2亚群(野生型与突变体)。还使用每对测定和11种测定中的每一种单独进行k均值聚类(k＝2)。将每种单独和成对测定的聚类结果与所有11种测定的聚类进行比较，并报告为表2中的系数(等于pearson相关系数的绝对值)。
148.表1
149.[0150][0151]
表2
[0152]
[0153]