一种电致化学发光适配体传感器的制备方法及应用与流程

1.本发明属于功能材料与生物传感检测技术领域，具体涉及一种基于硫化铋纳米棒抑制钌基金属有机框架的电致化学发光适配体传感器的制备方法及应用。


背景技术：

2.脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，don)，又称呕吐毒素，主要由禾谷镰刀菌(f.graminearum)和黄色镰刀菌(f.culmorum)等产生，在小麦、大麦、燕麦、玉米等农作物中多见，是一种分布面广、影响较大的单端孢霉烯族化合物。don对人体和动物均有较强毒性，主要体现在影响生命体的正常生长发育，对脾脏、心脏和肝脏等造成潜在危害。don在全球各国均有出现，在我国主要分布于长江以南区域，其不仅污染谷类作物及其制品，并且会转移至肉制品、内脏及乳及乳制品、蛋等动物源食品中。因此，有必要开发一种灵敏度高、特异性强、稳定性好、检测限低等优点的检测方法。
3.电致化学发光(electrochemiluminescence，简称ecl)，又称电化学发光，是通过对电极施加一定电压进行电化学反应直接或间接引发的化学发光现象；电致化学发光分析是通过光电倍增管等光学仪器收集其ecl信号，根据待测物浓度与ecl信号之间的线性关系，实现对待测物质定量测定的一种分析方法。相比于其他分析技术，电致化学发光传感器综合了电化学检测和化学发光的优点，具有高灵敏度、快速、低本底等优良特性。适配体是使用selex技术从dna库中选择的寡核苷酸链，它对目标物具有高度的特异性和亲合力，其功能与传统的抗体相似，但物理尺寸更小，更容易修饰和标记，稳定性更高。将适配体作为一种识别元件，与电致化学发光技术相结合，可以提高电致化学发光传感器的检测性能。本发明制备了一种基于硫化铋纳米棒抑制钌基金属有机框架的电致化学发光适配体传感器，并实现了对呕吐毒素的高灵敏检测。
4.钌基金属有机框架(ru
‑
mofs)化合物因其独特的片状堆积结构、高效的发光效率、良好的化学和物理稳定性及生物相容性，使其成为电致化学发光探针的理想材料。ru
‑
mofs纳米材料结合了联吡啶钌和金属有机框架的优点，使其具有更加优异的性能。此外，bi2s3作为一种禁带宽度为1.3ev的直接带隙材料，在光催化剂、太阳能电池、贮氢材料、热电材料等领域有着广泛的应用。
5.fang等利用含氟香豆素硅酞菁和鲁米诺的tio2‑
b一体式生物探针，制备了一种电致化学发光免疫传感器，用于呕吐毒素的定量分析。但是作为发光试剂的鲁米诺，需要在偏碱性条件下溶解从而产生有效的电致化学发光信号，这一条件限制了其在电致化学发光免疫传感器中的应用；lv等利用金纳米粒子功能化的纳米多孔钴催化钌硅球，制备了一种检测呕吐毒素的电致化学发光免疫传感器。但是其使用的纳米材料合成方法复杂，且需要氨水等危险化学品。目前没有报道关于此两种纳米材料制备的电致化学发光传感器以及利用电致化学发光适配体传感器对呕吐毒素进行检测。因此，制备一种合成方法简单、操作方便且无多种条件限制的电致化学发光适配体传感器检测呕吐毒素是十分重要的。


技术实现要素：

6.本发明的目的是基于硫化铋纳米棒抑制钌基金属有机框架制备一种电致化学发光适配体传感器实现对呕吐毒素的高灵敏检测。
7.本发明提出一种基于硫化铋纳米棒抑制钌基金属有机框架制备的电致化学发光适配体传感器检测呕吐毒素的方法，其包括以下步骤：
8.第一步，钌基金属有机框架(ru
‑
mofs)的合成，将9mg三(4,4
‑
二羧基联吡啶)氯化钌、45mg硝酸锌、45mg吡嗪、90mg十六烷基三甲基氯化铵、45ml纯水混合在100ml烧杯中，超声均匀后，将上述混合溶液转移到内衬为聚四氟乙烯的反应釜中，120℃反应4h，得到橙黄色浊液，8500rpm离心10min，最后真空干燥后得到钌基金属有机框架(ru
‑
mofs)；
9.第二步，硫化铋(bi2s3)的合成，称取1.82g硝酸铋，加入25ml乙二醇，在氮气氛围中脱氧15min，得到溶液a；称取1.351g硫化钠，加入10ml乙二醇与20ml纯水，搅拌至完全溶解，得到溶液b；在剧烈搅拌下，将溶液b滴加到溶液a中，随后加入1.922g尿素和20ml纯水，继续搅拌30min；再将混合溶液转移到内衬为聚四氟乙烯的反应釜中，180℃反应12h，得到黑色浊液，洗涤三次后真空干燥得到硫化铋(bi2s3)；
10.第三步，玻碳电极(gce)首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用纯水洗去表面残留粉末，将抛光后的玻碳电极依次置于乙醇和蒸馏水中分别超声处理5
‑
10min，并在室温下干燥；
11.第四步，移取6μl金纳米粒子(aunps)溶液滴加至玻碳电极表面，室温下干燥，得到aunps/gce；继续移取20μl ru
‑
mofs溶液滴加在aunps/gce表面，室温下干燥，得到ru
‑
mofs/aunps/gce；然后将ru
‑
mofs/aunps/gce浸入0.5
‑
2.5μm/l巯基功能化的呕吐毒素适配体溶液(sh
‑
apt)中，在37℃条件下孵育2h，用ph为7.4的磷酸盐缓冲液清洗电极，得到sh
‑
apt/ru
‑
mofs/aunps修饰玻碳电极；最后移取5μl mch溶液滴加在sh
‑
apt/aunps/gce表面以封闭电极表面上非特异性活性位点，并保存在4℃冰箱中备用；
12.第五步，取0.5
‑
2mg/ml硫化铋溶液10ml，加入0.8ml、0.1m/l的haucl4溶液和2ml、50mm/l的柠檬酸钠溶液，在80℃水浴条件下合成bi2s3@au复合物，将其与适配体互补链(cdna)在室温下震荡12h，得到au@bi2s3‑
cdna标记物；
13.第六步：将au@bi2s3‑
cdna标记物与sh
‑
apt/aunps/gce在3
‑
60℃条件下孵育30
‑
120min，得到au@bi2s3‑
cdna/sh
‑
apt/aunps修饰电极；
14.第七步：将步骤六获得的修饰电极浸入不同浓度的呕吐毒素标准溶液中，在4℃冰箱中孵育40min，用纯水冲洗电极表面，得到呕吐毒素的电致化学发光适配体传感器，保存在4℃冰箱中备用。
15.作为优选地，第四步中巯基功能化的呕吐毒素适配体溶液的浓度为1.0μm/l。
16.作为优选地，第五步中硫化铋溶液的浓度为0.5mg/ml。
17.作为优选地，第六步中孵育时间为60分钟、孵育温度为37℃。
18.本发明中的巯基功能化的呕吐毒素适配体溶液(sh
‑
apt)和适配体互补链(cdna)购买自上海生工。
19.本发明还提供了一种电致化学发光适配体传感器在检测呕吐毒素中的应用，具体为：
20.使用三电极体系进行测定，以上述方法制得的电致化学发光适配体传感器为工作
电极，ag/agcl为参比电极，铂丝电极为对电极，在0.1m/l ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；采用电位范围
‑
1.8v
‑
1.5v，扫描速率0.05v/s，电致化学发光设备光电倍增管800v对不同浓度的呕吐毒素标准溶液进行检测，通过电致化学发光设备采集的1.5v的ecl信号强度，通过ecl信号强度与呕吐毒素标准溶液浓度之间的关系，检测呕吐毒素。
21.本发明提供了一种基于硫化铋纳米棒抑制钌基金属有机框架制备的电致化学发光适配体传感器的制备方法及其对呕吐毒素的高灵敏检测，特点是基于ru
‑
mofs纳米材料的大比表面积及较高的发光效率，将其作为电致化学发光探针，并进一步功能化呕吐毒素适配体，同时以bi2s3标记适配体互补链，适配体与互补链结合使得bi2s3作用到ru
‑
mofs纳米材料上以抑制其ecl信号，利用适配体对呕吐毒素的特异性识别，实现对呕吐毒素的高灵敏、高稳定性检测。所制得的呕吐毒素电致化学发光适配体传感器，具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测限低等优点，可用于食品中呕吐毒素的检测，在食品安全监控方面具有非常重要的应用价值。
附图说明
22.图1是本发明实施例中ru
‑
mofs的sem图；
23.图2是本发明实施例中bi2s3的sem图；
24.图3是本发明实施例中电致化学发光适配体传感器制备过程中不同浓度的bi2s3对ru
‑
mofs电致化学发光信号强度的影响；
25.图4是本发明实施例中电致化学发光适配体传感器制备过程中适配体浓度对ecl信号响应的影响；
26.图5是本发明实施例中电致化学发光适配体传感器制备过程中孵育时间对ecl信号响应的影响；
27.图6是本发明实施例中电致化学发光适配体传感器制备过程中孵育温度对ecl信号响应的影响。
具体实施方式
28.下面对本发明的具体实施案例做说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作流程，但是本发明的应用范围不限于下述的实施例。
29.实施例1：
30.第一步，ru
‑
mofs的合成，将9mg三(4,4
‑
二羧基联吡啶)氯化钌、45mg硝酸锌、45mg吡嗪、90mg十六烷基三甲基氯化铵、45ml纯水混合在100ml烧杯中，超声均匀后，将上述混合溶液转移到内衬为聚四氟乙烯的反应釜中，120℃反应4h，得到橙黄色浊液，8500rpm离心10min，最后真空干燥后得到ru
‑
mofs。
31.第二步，硫化铋的合成，称取1.82g硝酸铋，加入25ml乙二醇，在氮气氛围中脱氧15min，为溶液a。称取1.351g硫化钠，加入10ml乙二醇与20ml纯水，搅拌至完全溶解，为溶液b。在剧烈搅拌下，将溶液b滴加到溶液a中，随后，加入1.922g尿素和20ml纯水，继续搅拌30min。再将混合溶液转移到内衬为聚四氟乙烯的反应釜中，180℃反应12h，得到黑色浊液，洗涤三次后真空干燥得到硫化铋。
32.第三步，玻碳电极(gce)首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用纯水洗去表面残留粉末，将抛光后的玻碳电极依次置于乙醇和蒸馏水中分别超声处理5
‑
10min，并在室温下干燥。
33.第四步，移取6μl制备好的金纳米粒子(aunps)溶液滴加至玻碳电极表面，室温下干燥，得到aunps/gce。继续移取20μl ru
‑
mofs溶液滴加在aunps/gce表面，室温下干燥，得到ru
‑
mofs/aunps/gce。为了确定适配体的最佳使用浓度，将ru
‑
mofs/aunps/gce浸入浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μm/l的巯基功能化的呕吐毒素适配体溶液中，在37℃条件下孵育2h，用ph为7.4的磷酸盐缓冲液清洗电极，得到sh
‑
apt/ru
‑
mofs/aunps修饰玻碳电极。最后移取5μl mch溶液滴加在sh
‑
apt/aunps/gce表面以封闭电极表面上非特异性活性位点，并保存在4℃冰箱中备用。
34.第五步，取0.5mg/ml硫化铋溶液10ml，加入0.8ml 0.1m/l haucl4溶液和2ml 50mm/l柠檬酸钠溶液，在80℃水浴条件下合成bi2s3@au复合物，将其与适配体互补链(cdna)在室温下震荡12h，得到au@bi2s3‑
cdna标记物。
35.第六步：将au@bi2s3‑
cdna标记物与sh
‑
apt/aunps/gce在37℃条件下孵育1h，得到au@bi2s3‑
cdna/sh
‑
apt/aunps修饰电极。
36.第七步：将步骤六获得的修饰电极浸入不同浓度的呕吐毒素标准溶液中，在4℃冰箱中孵育40min，用纯水冲洗电极表面，得到呕吐毒素的电致化学发光适配体传感器，保存在4℃冰箱中备用。
37.第八步，使用三电极体系进行测定，以制得的电致化学发光适配体传感器为工作电极，ag/agcl为参比电极，铂丝电极为对电极，在0.1m/l ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行测试。采用电位范围
‑
1.8v
‑
1.5v，扫描速率0.05v/s，电致化学发光设备光电倍增管800v对不同浓度的呕吐毒素标准溶液进行检测，通过电致化学发光设备采集的1.5v的ecl信号强度，通过ecl信号强度与呕吐毒素标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线。
38.实施例2：
39.第一步，如实施例1
40.第二步，如实施例1
41.第三步，如实施例1
42.第四步，如实施例1，其中巯基功能化的呕吐毒素适配体溶液的浓度选择为1.0μm/l。
43.第五步，为了验证实验的可行性，说明不同浓度硫化铋对ru
‑
mofs的ecl信号影响不同，分别取0、0.5、1.0、1.5、2mg/ml硫化铋溶液10ml，加入0.8ml0.1m/l haucl4溶液和2ml 50mm/l柠檬酸钠溶液，在80℃水浴条件下合成bi2s3@au复合物，将其与浓度为100μm/l的适配体互补链(cdna)在室温下震荡12h，得到au@bi2s3‑
cdna标记物。
44.第六步，如实施例1
45.第七步，如实施例1
46.第八步，如实施例1
47.实施例3：
48.第一步，如实施例1
49.第二步，如实施例1
50.第三步，如实施例1
51.第四步，如实施例1，其中巯基功能化的呕吐毒素适配体溶液的浓度选择为1.0μm/l。
52.第五步，如实施例1
53.第六步，为了得到最佳孵育时间，将au@bi2s3‑
cdna标记物与sh
‑
apt/aunps/gce在37℃条件下孵育30、60、90、120分钟，得到au@bi2s3‑
cdna/sh
‑
apt/aunps修饰电极。
54.第七步，如实施例1
55.第八步，如实施例1
56.实施例4：
57.第一步，如实施例1
58.第二步，如实施例1
59.第三步，如实施例1
60.第四步，如实施例1，其中巯基功能化的呕吐毒素适配体溶液的浓度选择为1.0μm/l。
61.第五步，如实施例1
62.第六步，为了确定最优孵育温度，将au@bi2s3‑
cdna标记物与sh
‑
apt/aunps/gce分别在4、25、37、60℃条件下孵育1h，得到au@bi2s3‑
cdna/sh
‑
apt/aunps修饰电极。
63.第七步，如实施例1
64.第八步，如实施例1
65.如附图1所示，ru
‑
mofs的sem图呈独特的片状堆积结构，具有较大的比表面积，基于此可作为有效的电致化学发光探针。
66.如附图2所示，bi2s3的sem图呈棒状结构，大小均匀，分布规则，为结合互补dna链提供了较多的结合位点。
67.如附图3所示，从图中可知随着bi2s3浓度的增加，ru
‑
mofs在阳极处的电致化学发光信号强度逐渐减弱，在阴极处的电致化学发光信号强度增加，证明了实验设计的可行性。
68.如附图4所示，从图中可知当适配体浓度增加到1.0μm/l时，电致化学发光信号最高，适配体浓度过高会影响后续待测目标物与其结合，所以选择1.0μm/l为适配体的最佳使用浓度。
69.如附图5所示，当时间达到60分钟时，标记后的互补dna链与适配体结合完全至饱和状态，电致化学发光信号强度最高，所以选择60分钟为最佳孵育时间。
70.如附图6所示，当温度为37℃时，电致化学发光信号强度最高，温度过高会影响适配体以及互补dna链的结构稳定性，所以选择37℃为最佳孵育温度。
71.综上，在电致化学发光适配体传感器制备过程中，当检测目标物呕吐毒素的浓度为0.5mg/ml时，通过上述方案对制备的几个关键因素：适配体浓度、孵育时间、和孵育温度进行优化，在最优条件下对传感器性能检测结果如下：
72.条件优化结果显示当体系中适配体浓度为1.0μm/l、孵育时间为60分钟、孵育温度为37℃时，所得呕吐毒素电致化学发光适配体传感器性能最佳。
73.本发明基于硫化铋纳米棒抑制ru
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mofs的电致化学发光信号强度制备了一种电致化学发光适配体传感器，实现了对呕吐毒素进行高灵敏检测，相比于其他分析技术，本发明
制备的电致化学发光适配体传感器灵敏度更高，特异性更好。本方案拓展了电致化学发光生物传感器在食品安全方面的应用，为食品中污染物的检测提供了一个新的思路。