一种达托霉素中癸酸含量的测定方法与流程

1.本发明属于药物化学分析领域，具体地，涉及达托霉素中癸酸含量的测定方法。


背景技术：

2.达托霉素是由玫瑰孢链霉菌产生的一种环脂肽抗生素，由13个氨基酸组成，其中10个氨基酸组成1个氨基酸肽环，另有3个氨基酸排列成线状，这3个氨基酸中末端的l-色氨酸接着1个十碳癸酸链，是一种钙离子依赖型的抗生素。
[0003][0004]
在钙离子存在的条件下，达托霉素将以非共价键的形式与细胞膜上达托霉素结合蛋白(dbps)结合。达托霉素对于革兰阳性菌具有很好的杀菌作用，对高致病性耐药菌的有效率高，杀菌效果好，毒副作用小，目前已经被临床用于(包括但不限于)耐甲氧西林金黄色葡萄糖菌和耐万古霉素肠球菌引起的感染。
[0005]
癸酸是合成达托霉素过程中常用的一种原料，如美国专利4,885,243描述了一种通过用癸脂肪酸或其脂或盐供给发酵培养基养料而合成达托霉素的改进方法；cn101880703b公开了一种流加癸酸盐发酵达托霉素的方法。因为癸酸本身具有细胞毒作用，需严格控制达托霉素发酵过程中癸酸的浓度。《达托霉素发酵液中癸酸的毛细管气相色谱法测定》(中国医药工业杂志，2015,46(6):626-627)报道了通过气相色谱法测定达托霉素中癸酸含量，但由于气相在色谱分离过程中温度较高，达托霉素的酰胺键在高温下(柱温为210℃)会发生水解产生癸酸，不适于检测达托霉素中癸酸的含量。因此需要开发一种检测癸酸含量同时避免达托霉素分解的新方法，为达托霉素的质量控制提供依据。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供一种达托霉素中癸酸含量的测定方法，该方法可以在检测癸酸含量同时避免达托霉素分解，为达托霉素发酵过程中癸酸含量的检测以及成品中癸酸残留的控制提供依据。
[0007]
为实现上述目的，本发明开发了癸酸的液质检测方法，具体地，开发了一种使用lc-ms法对达托霉素中癸酸的含量进行测定的方法，包括如下步骤：
[0008]
a.量取一定量的待测样品溶液进行lc-ms分析；
[0009]
b.采用eic模式提取m/z＝171.1390，按照公式计算含量：
[0010]
样品中癸酸含量(ppm)＝106×
样品中癸酸峰面积/(对照品峰面积/对照品浓度(mg/ml)
×
样品样品浓度(mg/ml))。
[0011]
具体地，步骤a中所述的lc优选为超高压液相，其色谱条件为：
[0012]
色谱柱为c18，2.1mm
×
100mm，1.8μm柱；
[0013]
流动相为体积比为50︰50的甲醇和10mm甲酸铵；
[0014]
柱温30℃；
[0015]
流速0.5ml/min；
[0016]
进样量：10μl。
[0017]
所述lc-ms测定中对照品溶液配制方法为：精密称取癸酸对照品适量，加50％的甲醇水溶液溶解并定量稀释制成浓度为5μg/ml的溶液。
[0018]
所述超高压液相测定中供试品溶液配制方法为：精密称取癸酸原料适量，加50％的甲醇水溶液溶解并定量稀释制成浓度为5mg/ml的溶液。
[0019]
所述超高压液相的运行时间为6min，数据采集时间为6min。
[0020]
具体地，步骤a中采用的ms为四极杆飞行时间质谱仪，具体的质谱检测条件如下：
[0021]
质谱采用-esi扫描模式，扫描范围为100m/z-1700m/z；
[0022]
质谱切换阀：0-1min：waste，1-6min：ms，
[0023]
干燥气温度320℃；干燥气流速8l/min；
[0024]
鞘气温度350℃；鞘气流速11l/min；
[0025]
毛细管电压4000v；喷嘴电压0v；毛细管出口电压95v。
[0026]
进一步地，所述质谱测定采用提取eic模式，提取m/z＝171.1390，进行定量分析。
[0027]
本发明的有益效果：
[0028]
本发明公开了一种液质联用法测定达托霉素中癸酸含量的方法体系，通过液相色谱将达托霉素和癸酸分离，通过质谱检测器对癸酸进行定量。本发明的方法简便、快速、专属性强、灵敏度高、重现性好，癸酸在0.261～10.457μg/ml范围内线性关系良好，平均回收率为98.76％，rsd为1.98％。
附图说明
[0029]
图1为实施例1检测条件下达托霉素样品溶液气相色谱图
[0030]
图2为实施例1检测条件下癸酸对照品溶液气相色谱图
[0031]
图3为实施例3检测条件下空白溶液的谱图
[0032]
图4为实施例3检测条件下对照品溶液的谱图
[0033]
图5为实施例3检测条件下供试品加标溶液的谱图
具体实施方式
[0034]
以下将结合具体实施方式详细说明本发明内容，但本发明的范围不限于此。
[0035]
以下具体实施例中，如无具体说明，使用的试剂和仪器都是本领域常用试剂和仪器，可以通过商购的方式获得；所使用的方法为本领域常规方法，本领域技术人员根据实施
例内容可以知道如何具体实现所述方法，并实现相应的结果。
[0036]
下述具体实施例中采用的高效液相色谱仪为agilent 1290(agilent，美国)，
[0037]
四极杆飞行时间质谱仪为agilent qtof 6545(agilent，美国)；
[0038]
甲醇和甲酸铵均为lcms级，商购可得；癸酸对照品为sigma供应，纯度99.5％；
[0039]
实验用水为milli-q超纯水；
[0040]
达托霉素原料药样品来源于杭州中美华东制药有限公司，批号：180601ytx，实施例中达托霉素原料药/样品如未特殊说明，皆为此来源。
[0041]
实施例1
[0042]
(1)配制对照溶液和样品溶液
[0043]
对照品溶液：称取癸酸对照品100mg于100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，移取5ml该溶液于50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得100μg/ml癸酸对照溶液。
[0044]
样品溶液：称取达托霉素原料药0.1g于5ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀即得。
[0045]
(2)按下列气相条件检测达托霉素中的癸酸含量
[0046]
气相检测方法条件为：
[0047]
色谱柱：hp-innowax(30m
×
0.32mm
×
0.5μm)
[0048]
进样量：1.0μl
[0049]
进样口温度：280℃
[0050]
分流比：10:1
[0051]
色谱柱流量：1ml/min
[0052]
升温程序：40℃保持3min，以20℃/min升至200℃保持12min，以20℃/min升至240℃保持2min
[0053]
检测器：fid
[0054]
检测器参数：温度：280℃，空气：400ml/min，氢气：30ml/min
[0055]
结果测得样品溶液中癸酸含量较高，约3000ppm。
[0056]
达托霉素样品溶液气相色谱图见附图1，癸酸对照溶液气相色谱图见附图2。
[0057]
实施例2
[0058]
称取达托霉素样品0.2g于离心管中，加水10ml溶解后，再加入乙酸乙酯10ml，加盖密封，振摇5min，在10000r/min下离心15min后，取上层乙酸乙酯层用实施例1的气相检测条件进行检测，试验结果显示，乙酸乙酯层未检测到癸酸。
[0059]
通过乙酸乙酯萃取，癸酸被萃取到乙酸乙酯层，而达托霉素水溶性较好，主要在水层，萃取实验证明实际使用的样品中不含癸酸或者癸酸含量很低，但直接使用气相色谱法检测时，测得样品溶液中癸酸含量较高(实施例1检测结果约3000ppm)，由此可见直接使用气相色谱法不利于实际发酵过程中癸酸含量的控制以及达托霉素的质量控制，因为此法无法确定癸酸是样品中含有还是检测高温使得达托霉素酰胺键发生水解产生。
[0060]
实施例3
[0061]
(1)配制试验中使用溶液
[0062]
稀释液和空白溶液：混匀等体积的水和甲醇，即得50％的甲醇水溶液。
[0063]
癸酸对照品储备液(50μg/ml)：精密称定癸酸对照品10mg，用稀释液稀释成每1ml
中含50μg癸酸，即得。
[0064]
癸酸对照品溶液(5μg/ml，系统适用性溶液)：精密移取癸酸对照品储备液1.0ml于10ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，即得。
[0065]
供试品溶液：精密称定达托霉素原料100mg，溶于20ml量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得5mg/ml的供试品溶液。
[0066]
供试品加标溶液：精密称定达托霉素原料药约100mg，溶于20ml量瓶中，加稀释液适量，并精密加入癸酸对照品储备溶液2.0ml，用稀释液稀释至刻度，摇匀即得。
[0067]
(2)将对照品溶液和供试品溶液按下列检测条件进样检测，
[0068]
液相条件设置：
[0069]
色谱柱：agilent zorbax xdb-c18(2.1mm
×
100mm，1.8μm)；
[0070]
柱温：30℃；
[0071]
流速：0.5ml/min；
[0072]
进样量：10μl；
[0073]
流动相：v(乙腈)︰v(10mm甲酸铵)＝50︰50；
[0074]
ms条件设置：
[0075]
质谱采用-esi扫描模式，
[0076]
扫描范围为：100m/z-1700m/z，
[0077]
质谱切换阀：0-1min：waste，1-6min：ms，
[0078]
干燥气温度：320℃；干燥气流速：8l/min；
[0079]
鞘气温度：350℃；鞘气流速：11l/min；
[0080]
毛细管电压：4000v；喷嘴电压：0v；毛细管出口电压：95v；
[0081]
采用提取eic模式，提取m/z：171.1390，进行定量分析，
[0082]
结果：样品中未检测到癸酸。
[0083]
实施例4
[0084]
系统适用性试验
[0085]
取癸酸对照品溶液(5μg/ml)作为系统适用性溶液，将系统适用性溶液按实施例3设置的检测条件连续进样6次，测得癸酸峰面积rsd为0.63％。
[0086]
取实施例3中的空白溶液、癸酸对照品溶液和供试品加标溶液在上述条件下进样，记录谱图(见附图3-5)，结果显示空白溶剂无干扰；对照品溶液和供试品溶液中无其他干扰峰，专属性良好。
[0087]
实施例5
[0088]
线性试验
[0089]
精密量取对照品储备液适量，用稀释液稀释，分别制备浓度约为0.2、0.5、2.5、5、7.5和10μg/ml的系列浓度癸酸溶液，摇匀，按实施例3设置的检测条件分别进样测定。
[0090]
以0.2μg/ml作为定量限(s/n大于10)，并逐级稀释进行检测，至s/n约为3时为检测限，浓度为0.05μg/ml。由癸酸峰面积(y)对癸酸溶液浓度(x)线性回归，回归方程为y＝0.3923x-0.0421，r＝0.9999。
[0091]
癸酸的线性范围为：0.261μg/ml～10.457μg/ml，相关系数r为0.9999，浓度与峰面积呈良好的线性关系。
[0092]
实施例6
[0093]
精密度试验
[0094]
重复性试验：精密称定达托霉素原料100mg，置于20ml量瓶中，加稀释液适量，精密加入2.0ml癸酸对照品储备液，用稀释液稀释至刻度，摇匀，平行制备6份，依实施例3的条件方法测定，扣除本底量，计算6份样品中癸酸平均回收率为100.91％，回收率rsd为0.78％，重复性较好。
[0095]
中间精密度：在不同时间，不同人员用同一色谱柱，进行重复性试验，计算6份样品平均回收率为99.37％，回收率的rsd为1.29％。
[0096]
对比重复性试验和中间精密度试验所得数据结果，12份供试品溶液癸酸平均回收率在100.14％，12份供试品溶液癸酸的回收率rsd为1.29％，所以精密度良好。
[0097]
实施例7
[0098]
回收率试验
[0099]
按2.5，5和7.5μg/ml三个浓度设计回收率试验：精密称定达托霉素原料约100mg，置于20ml量瓶中，加稀释液适量，并分别加入适量癸酸对照品储备液1ml、2ml和3ml，用稀释液稀释至刻度，摇匀即得，每个浓度平行制备3份。
[0100]
取对照品溶液、供试品溶液及各浓度回收率供试品溶液，依实施例3法测定，按外标法以峰面积计算癸酸回收率。癸酸各个浓度点回收率在96.14％～102.22％之间，平均回收率为98.76％，总回收率rsd为1.98％，表明方法准确度良好。
[0101]
实施例8
[0102]
定量限准确度精密称定达托霉素原料100mg，置于20ml量瓶中，加稀释液适量，精密加入1.0ml癸酸对照品溶液，用稀释液稀释至刻度，摇匀，平行制备6份，依实施例3的条件方法测定，扣除本底量，计算6份样品中癸酸平均回收率为95.31％，回收率rsd为5.5％，表明方法定量限准确度良好。