一种简便高效的同时提取和纯化制备河豚毒素检测样品的方法及其试剂盒与流程

1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种简便高效的同时提取和纯化制备河豚毒素检测样品的方法及其试剂盒，尤其涉及一种将柱色谱萃取和固相分离技术结合，可以一步将样品中的ttx完全提取并纯化，可直接用于高效液相色谱仪等检测含量。


背景技术：

2.河豚毒素(tetrodotoxin,ttx)是河豚鱼及其它生物体内含有的一种小分子生物碱。其分子式为c
11h17
o8n3，分子量为319。该物质化学性质稳定，对热、酶类、盐类及酸相对稳定，易溶于稀醋酸水溶液中。河豚毒素是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一，其毒性比剧毒氰化钠还要高1250多倍，0.5mg即可致死。河豚毒素通过与钠离子通道受体结合，从而阻滞动作电位导致与之相关的生理活动障碍，使人感觉神经麻痹，四肢瘫痪，呼吸困难，最后因呼吸抑制而死亡。随着渔业的发展，河豚鱼中毒事件屡次发生。河豚鱼作为“长江三鲜”之一，河豚及其相关加工产品的需求不断增加，为确保消费者的食用安全，河豚毒素的检测越来越为人们所重视，各检测机构有必要建立一种简便、高效、准确的检测河豚毒素的方法。
3.ttx的检测技术研究始自20世纪60年代，常用的检测技术包括：（1）生物检测法，其中小鼠生物法是最常见、直观的检测方法，国标中定义20g的小鼠经腹腔注射ttx后，其死亡时间的倒数与注射ttx剂量之间存在着线性关系，因此可根据小鼠死亡时间推断ttx的含量，具有症状典型、易于判断等优点，但检测结果与小鼠的个体差异显著相关，且有假阳性现象，重复性差，需有一定规模才能客观反映实验结果，因此该方法的应用受到限制；（2）免疫学检测法，常用的如酶联免疫吸附法，它是抗原抗体的免疫反应与酶的高效催化作用原理的有机结合，具有灵敏度高、快速、专一性好等优点。但ttx抗体尤其是单克隆抗体很难制备，且操作步骤较为繁琐。
4.（3）理化检测法，常用的如荧光分光光度法、液相色谱-串联质谱法，检测过程简单、快速，同时配有高灵敏度的检测器，比较灵敏。但样品前处理复杂，对纯度要求很高，目前国内外ttx的提取纯化过程主要结合浸泡提取、过滤、蒸馏、吸附、层析等技术实现，工艺流程长、过程复杂、高成本，提取率较低且纯化过程中会损失大量的ttx，无法对样品进行准确定量。
5.综上所述，本领域急需建立一种简便、高效提取和纯化河豚毒素用于准确检测、定量的方法。


技术实现要素：

6.本发明为了解决ttx检测过程中前处理复杂、提取率低、定量不准确、检测成本高昂等问题，研发出了一种简便高效的同时提取和纯化制备河豚毒素检测样品的方法及其试
剂盒。上述方法将柱色谱萃取和固相分离技术结合在一起，可以一步将样品中的ttx完全提取并纯化，直接用于高效液相色谱等检测ttx含量。该方法非常简便、提取和纯化效率高，定量准确、可靠，同时，样品制备的成本很低。
7.本发明有以下技术方案实现：一种简便高效的同时提取和纯化制备河豚毒素检测样品的方法及其试剂盒，所述方法包括以下步骤：（1）制备固相萃取小柱。在固相萃取空柱中装入2ml能高效吸附和分离河豚毒素的吸附剂，在吸附剂上下各加一片滤膜（300目）。
8.（2）若待测样品为固体或生物组织器官，将待测样品捣碎、匀浆，加入少量的助滤剂（如硅藻土等）和提取溶剂，混和均匀后，转入上述（1）中制备好的固相萃取小柱上，用提取溶剂将匀浆器中残留的样品全部洗下、转入固相萃取小柱上。在样品顶部加一片滤膜（300目）。若待测样品为液体，将待测样品溶液ph调至9.0，直接加到固相萃取小柱上。
9.（3）上述（2）中的固相萃取小柱，用洗脱溶剂i洗脱，将其中的杂质洗脱干净，弃洗脱液。
10.（4）上述（3）中的固相萃取小柱，用洗脱溶剂ⅱ洗脱残留杂质并中和小柱，弃洗脱液。
11.（5）上述（4）中的固相萃取小柱，用洗脱溶剂ⅲ洗脱河豚毒素，得到纯化的河豚毒素洗脱液。可用各种不同方法检测其中的河豚毒素含量。
12.（6）上述（5）中所得的河豚毒素洗脱液，用0.22
µ
m滤膜过滤后，用高效液相色谱测定其中的河豚毒素含量。
13.（7）基于以上方法制备的河豚毒素分析样品快速制备试剂盒，包括上述（1）中的制备好的固相萃取小柱、河豚毒素提取溶剂、洗脱溶剂i、洗脱溶剂ii和洗脱溶剂iii。用此“河豚毒素分析样品快速制备试剂盒”可简单快速制备各种材料的河豚毒素分析样品，用于准确测定河豚毒素含量。
14.所述步骤（1）中固相萃取空柱规格为大小尺寸φ12.9
×
67.6mm、体积6ml的小柱。
15.所述步骤（1）中的吸附剂为阳离子交换树脂等可选择吸附和分离河豚毒素的合成树脂 (如d152离子交换树脂）。树脂使用前需经过活化处理，活化处理的步骤为：1）用80%乙醇浸泡12h，将乙醇除去后用纯水洗至无醇味。2）用与树脂体积比1:1的2% hcl水溶液洗涤树脂4次，用纯水洗到中性。3）用与树脂体积比1:1的含4% naoh的水溶液洗涤树脂4次，用纯水洗到中性。4）用含0.5%氨水的水溶液洗涤树脂，用纯水洗到ph在9-10之间，备用。
16.所述步骤（2）中所用的河豚毒素提取溶剂和步骤（3）中所用的洗脱溶剂i均为低级脂肪醇（如甲醇、乙醇等）的水溶液，其中醇的含量不低于75%，并用氨水调ph至9.0。
17.所述步骤（4）和（5）中所用的洗脱溶剂ii和iii为低级脂肪醇（如甲醇、乙醇等）的酸水溶液。其中低级脂肪醇（如甲醇、乙醇等）的含量不低于75%，酸可为有机酸（醋酸、马来酸等）或无机酸（如磷酸、盐酸等），含量为1%-10%（一般为4%）。
18.所述步骤（2）、（3）、（4）和（5）中，固相小柱的洗脱流速控制在每小时3倍柱体积或以下。
19.所述步骤（6）中所用的河豚毒素检测方法可用各厂家的高效液相色谱仪或高效液相色谱-质谱联用仪器等。分离柱可用岛津shim-pack gist c18-aq 5
µ
m 4.6
×
250mm色谱柱或其他类似的色谱柱。用高效液相色谱仪分析时，流动相需用离子对试剂，如5mmol/l庚
烷磺酸钠+25mmol/l磷酸盐的水溶液；可在195-200nm波长下的检测。
20.相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果：将柱色谱萃取和固相分离技术相结合，省去复杂的样品制备前处理，操作简单。提取和分离纯化效率高，可对各种材料中的河豚毒素进行准确定量测定，可用于实际生物样品的检测，具有潜在的应用价值。
21.附图说明
22.图1本发明研发的固相萃取小柱的示意图图2 ttx标椎曲线图图3河豚鱼卵巢中ttx经固相萃取小柱分离纯化后的液相色谱检测图4河豚鱼肝脏中ttx经固相萃取小柱分离纯化后的液相色谱检测图5为河豚鱼人工养殖池水中ttx经固相萃取小柱分离纯化后的液相色谱检测图6为河豚鱼人工养殖池水加标品后ttx经固相萃取小柱分离纯化后的液相色谱检测图7为海水中ttx经固相萃取小柱分离纯化后的液相色谱检测图8为海水加标准品后ttx经固相萃取小柱分离纯化后的液相色谱检测
具体实施方式
23.下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
24.各实施例中所用的检测方法及其标准曲线如下：高效液相色谱采用岛津shim-pack gist c18-aq 5
µ
m 4.6
×
250mm色谱柱；流动相为5mmol/l庚烷磺酸钠+25mmol/l磷酸盐的水溶液；流速1.0ml/min，紫外检测波长为196nm。
25.准确配置浓度为10mg/l的ttx溶液，用高效液相色谱进行检测分析。分别进样2
µ
l、5
µ
l、10
µ
l、20
µ
l、40
µ
l。以ttx的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线及线性回归方程。ttx标准曲线图见图2。
26.实施例1. 河豚鱼卵巢中ttx含量的测定（1）制备固相萃取小柱。在固相萃取空柱中装入2ml活化过的d152树脂，在树脂上下各加一片滤膜（300目）。
27.（2）准确称取0.5g卵巢样品，将其捣碎、匀浆，加入1g硅藻土和5ml 提取溶剂，充分混匀后，转入固相萃取小柱中，用提取溶剂将匀浆器中残留的样品全部洗下，转入固相萃取小柱中。在样品顶部加滤板。收集上样时的流出液。
28.（3）将固相萃取小柱用15ml 洗脱溶剂i洗脱杂质，得洗脱液i。然后用2ml 洗脱溶剂ii洗脱残留杂质并中和小柱，得洗脱液ii。最后用40ml 洗脱溶剂iii洗脱ttx，收集洗脱液iii。固相小柱的洗脱流速控制在每小时6ml。
29.各洗脱液各取1ml，过0.22
µ
m滤膜后用高效液相色谱检测分析。检测结果见图3。ttx出峰时间在22-22.5分钟之间。
30.洗脱效果：从图3中可以看出，样品上样流出液、洗脱液i和洗脱液ii中都检测不到ttx，ttx全部集中在洗脱液iii中。洗脱液iii后，再继续用ttx洗脱液洗柱，洗脱液中完全没有ttx。
31.纯化效果：从图3中也可以看出，样品中的杂质在洗脱液i中即被全部被洗脱出来。洗脱液iii中的ttx纯度高，可用各种不同的检测方法检测。
32.检测结果：经高效液相色谱仪测定洗脱液iii的ttx含量，计算所测河豚鱼卵巢样品的ttx含量为103.8
µ
g/g。取同一卵巢样品，按ttx国标检测法gb 5009.206-2016小鼠生物检测法进行检测，所测ttx含量为95.5
µ
g/g。
33.实施例2. 河豚鱼肝脏中ttx含量的测定（1）制备固相萃取小柱。在固相萃取空柱中装入2ml活化过的d152树脂，在树脂上下各加一片滤膜（300目）。
34.（2）准确称取0.5g肝脏样品，将其捣碎、匀浆，加入1g硅藻土和5ml 提取溶剂，充分混匀后，转入固相萃取小柱中，然后用提取溶剂将匀浆器中残留的样品全部洗下，转入固相萃取小柱中。在样品顶部加滤板。收集上样时的流出液。
35.（3）将固相萃取小柱用15ml 洗脱溶剂i洗脱杂质，得洗脱液i。然后用2ml 洗脱溶剂ii洗脱残留杂质及中和小柱，得洗脱液ii。最后用40ml 洗脱溶剂iii洗脱ttx，收集洗脱液iii。固相小柱的洗脱流速控制在每小时6ml。
36.各洗脱液各取1ml，过0.22
µ
m滤膜后用高效液相色谱检测分析。检测结果见图4。ttx出峰时间在22-22.5分钟之间。
37.洗脱效果：从图4中可以看出，样品上样流出液、洗脱液i和洗脱液ii中都检测不到ttx，ttx全部集中在洗脱液iii中洗脱出来。洗脱液iii后，再继续用ttx洗脱试剂洗柱，洗脱液中完全没有ttx。
38.纯化效果：从图4中也可以看出，样品中的杂质在洗脱液i中即被全部被洗脱出来。洗脱液iii中的ttx纯度高，可用各种不同的检测方法检测。
39.检测结果：经高效液相色谱仪测定洗脱液iii的ttx含量，计算所测河豚鱼肝脏样品的ttx含量为249.2
µ
g/g。另取相同肝脏样品，按ttx国标检测法gb 5009.206-2016小鼠生物检测法进行检测，所测ttx含量为212.9
µ
g/g。
40.实施例3. 河豚鱼人工养殖池水中ttx含量的测定河豚鱼人工养殖池水样品取自南通龙洋水产有限公司。
41.（1）制备两个固相萃取小柱。在固相萃取空柱中装入2ml活化过的d152树脂，在树脂上下各加一片滤膜（300目）。
42.（2）将河豚鱼人工养殖池水样品离心，取两份上清液各10ml，用氨水调节ph至9。取其中一份加入100
µ
g河豚毒素标品。将两份样品分别转入固相萃取小柱中。分别收集上样时的流出液。
43.（3）将固相萃取小柱用15ml 洗脱溶剂i洗脱杂质，得洗脱液i。然后用2ml 洗脱溶剂ii洗脱残留杂质并中和小柱，得洗脱液ii。最后用40ml 洗脱溶剂iii洗脱ttx，收集洗脱液iii。固相小柱的洗脱流速控制在每小时6ml。
44.各洗脱液各取1ml，过0.22
µ
m滤膜后用高效液相色谱检测分析。人工养殖池水ttx检测结果见图5，人工养殖池水加标品后ttx检测结果见图6。ttx出峰时间在22-22.5分钟之间。
45.洗脱效果：从图5中可以看出，河豚鱼人工养殖池水中各洗脱液均检测不到ttx。从图6中可以看出，加ttx标品的河豚鱼人工养殖池水样品上样流出液、洗脱液i和洗脱液ii中
都检测不到ttx，ttx全部集中在洗脱液iii中洗脱出来。洗脱液iii后，再继续用ttx洗脱试剂洗柱，洗脱液中完全没有ttx。
46.纯化效果：从图6中可以看出，加ttx标品的河豚鱼人工养殖池水洗脱液iii中的ttx纯度高，可用各种不同的检测方法检测。
47.检测结果：经高效液相色谱仪测定，不加ttx标品的河豚鱼人工养殖池水中检测不到ttx。加ttx标品的河豚鱼人工养殖池水中ttx含量为95.2
µ
g。取同样加ttx标品后的河豚鱼人工养殖池水按ttx国标检测法gb 5009.206-2016小鼠生物检测法检测，ttx含量为90.9
µ
g。
48.实施例4. 海水中ttx的检测海水样品取自江苏省南通市如东县，黄海。坐标：北纬32
°
61’、东经120
°
96’。
49.（1）制备两个固相萃取小柱。在固相萃取空柱中装入2ml活化过的d152树脂，在树脂上下各加一片滤膜（300目）。
50.（2）将海水样品离心，取两份上清液各10ml，用氨水调节ph至9。取其中一份加入100
µ
g河豚毒素标品。将两份样品分别转入固相萃取小柱中。收集上样时的流出液。
51.（3）将固相萃取小柱用15ml 洗脱溶剂i洗脱杂质，得洗脱液i。然后用2ml 洗脱溶剂ii洗脱残留杂质及中和小柱，得洗脱液ii。最后用40ml 洗脱溶剂iii洗脱ttx，收集洗脱液iii。固相小柱的洗脱流速控制在每小时6ml。
52.各洗脱液各取1ml，过0.22
µ
m滤膜后用高效液相色谱检测分析。海水中ttx检测结果见图7，海水加ttx标品后的检测结果见图8。ttx出峰时间在22-22.5分钟之间。
53.洗脱效果：从图7中可以看出，海水样品中各洗脱液均未检测到ttx峰。从图8中可以看出，加ttx标品的海水上样流出液、洗脱液i和洗脱液ii中都检测不到ttx，ttx全部集中在洗脱液iii中洗脱出来。洗脱液iii后，再继续用ttx洗脱试剂洗柱，洗脱液中完全没有ttx。
54.纯化效果：从图8中可以看出，加ttx标品的海水洗脱液iii中的ttx纯度高，可用各种不同的检测方法检测。
55.检测结果：经高效液相色谱仪测定，不加ttx标品的海水样品中检测不到ttx。加ttx标品的海水样品中ttx含量为94.6
µ
g。取同样加ttx标品的海水样品，按ttx国标检测法gb 5009.206-2016小鼠生物检测法检测，所测得的ttx含量为91.3
µ
g。
56.本发明与传统检测方法的不同之处在于，该方法将柱色谱萃取和固相分离技术结合，可以一步将样品中的ttx完全提取并同时纯化，省去复杂的样品制备前处理，操作简单。提取和分离纯化效率高，可对各种材料中的河豚毒素进行准确定量测定。
57.以上所述为本发明的优选实施方案，但并不限制于上述详细方法。对本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，对本发明方法中各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等做出的若干改进和变型，也应视为本发明的保护范围。