基于核酸适配体探针的PDGF-BB识别方法及检测PDGF-BB的试剂盒与流程

基于核酸适配体探针的pdgf-bb识别方法及检测pdgf-bb的试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种基于核酸适配体探针的 pdgf-bb识别方法及检测pdgf-bb的试剂盒。


背景技术：

2.血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，pdgf)是一种强效的丝裂原和重要的促肿瘤血管生成生长因子，可由多种血细胞、组织细胞和一些肿瘤细胞产生。目前对肿瘤细胞中pdgf表达与检测的研究已成为生物医学研究领域的热点之一。
3.pdgf-bb为pdgf家族中活性最强的亚型血小板衍生生长因子。目前， pdgf-bb的常用识别方法为酶联免疫分析技术(elisa)，这一方法的基本原理是：
①
使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②
使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。
4.核酸适配体是能够和靶标分子特异性结合的人工合成的核酸，具有稳定的二级结构。核酸适配体识别分子的模式与抗体类似，但与蛋白质类抗体相比，核酸适配体具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫原性限制，可体外人工合成，制备简单快捷，变性与复性可逆，可修饰并易于长期保存和室温运输等。更重要的是，核酸适配体的靶分子更为广泛，可以是蛋白质、核酸、小肽、氨基酸、有机物甚至金属离子等。此外，核酸适配体还具有以下优势，如：化学性质稳定、至今未见报道存在免疫原性或毒性、亲和力高、特异性强、易于进行改造修饰。这些特性使得核酸适配体在生物医药研究领域得到广泛应用，成为不可缺少的有力工具。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种基于核酸适配体探针的pdgf-bb识别方法及检测pdgf-bb的试剂盒，以提高pdgf-bb检测的灵敏度和准确度。
6.根据本发明的一个方面，提供一种基于核酸适配体探针的pdgf-bb识别方法，：使样本中的pdgf-bb与核酸适配体探针发生免疫反应，核酸适配体探针的核苷酸序列包括seq id no.1所示序列。
7.优选地，使样本中的pdgf-bb分别依次与抗体、核酸适配体探针发生免疫反应，形成抗体-蛋白-核酸适配体的夹心结构。
8.优选地，在形成夹心结构后，洗去未与pdgf-bb结合的过量核酸适配体探针，对参
与构建夹心结构的核酸适配体探针进行pcr扩增，利用pcr扩增结果表征样本中的pdgf-bb。
9.根据本发明的另一个方面，提供一种检测pdgf-bb的试剂盒，其配备的物料包括固相载体和核酸适配体探针，固相载体的表面包被了靶向pdgf-bb的捕获抗体，核酸适配体探针的核苷酸序列包括seqidno.1所示序列。
10.优选地，其配备的物料还包括洗涤液，洗涤液为含0.5％吐温20、0.1mol/l的磷酸盐缓冲液。
11.优选地，洗涤液含有0.05％叠氮化钠。
12.优选地，洗涤液的ph＝7.2。
13.优选地，其配备的物料还包括taq-dna聚合酶、pcr反应缓冲液、dntp和引物，引物与核酸适配体的部分核苷酸序列互补。
14.本发明采用核酸适配体作为探针应用于pdgf-bb的识别检测，与靶向pdgf-bb的蛋白质类抗体相比，上述核酸适配体探针基于dna的结构特征：具有的制备简单快捷、分子量小、化学性质稳定、易于进行改造修饰的优异性能；适用于pcr扩增，通过使其进行pcr扩增从而对抗原蛋白进行定性定量检测，由此使得检测方案比传统的采用蛋白质类检测抗体更为多样、便捷。在研发过程中，发现靶向pdgf-bb的相当一部分核酸适配体不仅会与抗原蛋白结合，还会与捕获抗体或用于固定捕获抗体的固相载体向结合，出现假阳性的情况。然而，在筛选得到的核酸适配体中，核苷酸序列包括seqidno.1所示序列的核酸适配体对pdgf-bb展现出突出的特异性和亲和力，以包括了seqidno.1所示序列的核酸适配体作为靶向pdgf-bb的核酸适配体探针，能够灵敏、准确、快速地识别pdgf-bb抗原蛋白并与其稳定地结合，能够避免假阳性的情况出现。
15.优选地，引物包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如seqidno.2所示，下游引物的序列如seqidno.3所示
16.可选地，其配备的物料还包括pdgf-bb蛋白标准品、底物显色液、终止液和显色底物标记的链霉亲和素，核酸适配体探针为被生物素标记的核苷酸序列。
附图说明
17.图1为实施例1获得的核酸适配体的二级结构图；
18.图2为实施例2中构建标准曲线的实验图示；
19.图3为实施例2中梯度浓度标准样品和对照样品所对应的ct值；
20.图4为实施例2所构建的标准曲线图。
具体实施方式
21.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
22.实施例1
23.pdgf-b核酸适配体的获取
24.核酸适配体的的筛选过程采用毛细管电泳selex技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)进行核酸适配体的筛选：
25.使核酸与pdgf-b抗原混合，由此形成的混合溶液在ce(高效毛细管电泳
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激光诱导荧光检测)上运行，分离并收集与pdgf-b抗原结合的核酸分子(dna
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蛋白质复合物)；使dna-蛋白质复合物以不同的速率通过毛细管，当dna-蛋白质复合物通过毛细管中的一个窗口时，利用荧光检测技术可以对dna-蛋白质复合物进行识别，通过复合峰收集dna并pcr扩增；然后我们使用lambda核酸外切酶生成ssdna；将上述过程重复3-10次。使用非特异性蛋白质以类似方式进行阴性选择，但收集的是没有与抗原结合的dna。选择后，使用ngs对 dna进行测序以识别单个序列。最终找到结合pdgf-b的核酸适配体。
26.本实施例所得到的核酸适配体的序列为：
27.tcccacgcattctccacatcataagctgagcatcttagatccccgtcaa gggcagcgtaa cct ttctgtccttccgtcac(seq id no.1)，
28.其二级机构如图1所示。
29.实施例2
30.1.组建检测pdgf-bb的试剂盒
31.检测pdgf-bb的试剂盒配置以下物料：
32.酶标板：表面包被有捕获抗体，捕获抗体为抗pdgf-bb单抗，利用ph＝7.2、含5％脱脂奶粉的0.1mol/l的磷酸盐缓冲液作封闭液封闭；
33.核酸适配体探针：核酸适配体探针的核苷酸序列为seq id no.1；
34.捕获抗体稀释液：含有0.5％酪蛋白、2～4％蔗糖、150mmnacl、0.2％吐温 20的15mm磷酸盐缓冲液，ph＝7.4；
35.样本稀释液：含有2～4％蔗糖、150mmnacl、0.2％吐温20的15mm磷酸盐缓冲液，ph＝6.5；
36.洗涤液：含0.5％吐温20，0.05％叠氮化钠，的0.1m磷酸盐缓冲液，ph＝7.2。
37.taq-dna聚合酶；
38.pcr反应缓冲液；
39.dntp；
40.引物：上游引物的序列为tcccacgcattctccacatcata(seq id no.2)，下游引物的序列为gtgacggaaggacagaaaggtt(seq id no.2)；
41.sybr green mix
42.pdgf-bb蛋白标准品溶液。
43.2.检测pdgf-bb的试剂盒的使用
44.利用本实施提供的检测pdgf-bb的试剂盒进行pdgf-bb的定量检测，按照以下步骤进行：
45.步骤一：向酶标板的微孔中分别加入梯度稀释的pdgf-bb蛋白标准品与待检测样品，每孔加样100μl，每个样品做两个重复，于37℃反应40分钟，洗涤酶标板。
46.步骤二：向酶标板的微孔中加入核酸适配体探针，孵育40分钟，洗涤酶标板。
47.上述步骤一和步骤二过程中所涉及的洗涤酶标板的操作均为利用所配置的洗涤液于洗板机上洗涤酶标板5次，共10分钟。在其他实施例中，也可以根据实际情况利用酶联免疫试剂盒所配置的洗涤液实施本领域内通用的洗板操作，而不限于采用洗板机洗板。
48.步骤三：标准品的pcr扩增
49.(1)取5μl与pdgf-bb蛋白标准品结合的核酸适配体探针进行pcr扩增,反应体系总体积50μl，扩增条件为：先94℃3mins,再循环扩增30次94℃ 10s，55℃25s，；
50.(2)取第1次扩增完成的pcr反应液5μl，加入到新的体系中，重复第1 次的pcr扩增操作；
51.(3)回收核酸适配体探针。
52.步骤四：样品的pcr扩增
53.(1)取5μl与样品中的pdgf-bb蛋白结合的核酸适配体探针进行pcr 扩增,反应体系总体积50μl，扩增条件为：先94℃3mins,再循环扩增30次 94℃10s，55℃25s，；
54.(2)取第1次扩增完成的pcr反应液5μl，加入到新的体系中，重复第1 次的pcr扩增操作；
55.(3)回收核酸适配体探针。
56.标准曲线的构建方式如下：
57.(1)设置含有浓度梯度抗原的标准样品以及不含有抗原的对照样品，标准样品的设置方式为将40μl vegf标准品添加到含有360μl稀释剂的洁净离心管中以制备1000pg/ml标准溶液，稀释1000pg/ml标准溶液以进一步配制其他浓度的标准样品，最后分别向标准样品和对照样品中加入等量的核算适配体 (seq id no.1)。
58.(2)使用qpcr收集数据，通过输出ct值以表征每个样本中包含的抗原量，其中，较低的ct值表示较高的抗原浓度；当dna被放大时，会产生额外的荧光信号，每个循环都会导致dna大约加倍，而ct值代表样品通过荧光阈值所需的循环数；因此，较高水平的dna(与样品中的抗原量直接相关)会导致较低的ct值。
59.(3)计算每组一式三份标准样品、对照样品的平均ct；从对照中减去每个样品的ct值，得到对照和样品之间的ct值差值；依据上述步骤得到分别对应梯度浓度的标准样品和对照样品的ct值如图3所示，在图3中，纵坐标的强度即为样品所对应的ct值。以浓度为x坐标，以ct值差值作为y坐标拟合标准曲线，由此拟合得到的线性关系如图4所示。
60.由此计算出pdgf-bb的最低检测限为0.2pg/ml，由此说明，本发明所提供的ifn-γ识别方法能够有效地提高pdgf-bb的检测灵敏性，而基于该识别方法所涉及的试剂盒能够达到相对于目前针对pdgf-bb检测的试剂盒明显更低的最低检测限。
61.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。