一种基于QuEChRS方法的快速检验尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的检测方法

一种基于quechrs方法的快速检验尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的检测方法
技术领域
1.本发明属于尿液的处理及检测技术领域，具体是一种基于quechrs方法的快速检验尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的检测方法。


背景技术：

2.几种世界范围内使用的阻燃剂，如多溴二苯醚，包括五溴二苯醚、八溴二苯醚和十溴二苯醚，由于其持久性、生物累积性和毒性，逐渐被禁止作为消费品中的化学添加剂材料，在多溴二苯醚逐步淘汰后，替代性有机磷酸酯阻燃剂的应用迅速增加，有机阻燃剂作为主要的替代阻燃剂，主要添加在建筑材料、电子产品、软垫家具和纺织品中，以降低可燃材料的可燃性；由于opfrs不会化学键合到材料上，它们很容易通过磨损、浸出和挥发从处理过的商业和工业产品中迁移出来，最后释放到环境介质中，导致频繁被检出，而人类可能通过皮肤吸收接触的灰尘、吸入空气和摄入灰尘等途径而接触到opfrs，由于多项研究表明，某些opfrs在体内具有生殖危害、致癌性和对动物的内分泌干扰效应，人们对接触opfrs后的健康风险越来越担忧。
3.与多溴二苯醚相比，opfrs的持久性较低，生物累积潜力较低，但在生物体内的排泄率较高，半衰期较短，这导致尿液样本中有机磷酸酯阻燃剂代谢物（mopfrs）的高检测频率，由于室内微环境中opfrs的普遍存在，个人在日常生活中广泛接触opfrs，人体内相对恒定的接触表明，尿液样本中的mopfrs浓度相当稳定；因此，尿mopfrs是普通人群接触opfrs的合适生物标志物，迄今为止，尿液样本的主要预处理方法是固相萃取(spe)，然而spe过程复杂，操作繁琐，且成本较高，不适宜用于广泛推广用于快速检测，quechers（quick、easy、cheap、effective、rugged、safe），是近年来新发展起来的一种快速样品前处理技术，其原理与高效液相色谱（hplc）和固相萃取（spe）相似，样品经溶剂提取后，采取萃取盐盐析分层后，加入分散的吸附剂，利用吸附剂与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。
4.该前处理样品技术能快速简单地获得待检测样品，避免了固相萃取技术需要活化柱子、上样、洗脱待测物等的繁杂耗时操作，再结合高效液相色谱
‑
质谱联用仪检测，旨在能提供一种快速、高效地检测尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢含量的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对以上问题，本发明提供了一种基于quechrs方法的快速检验尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的检测方法，具有以改善现有处理方法的过程复杂，且成本较高的技术问题；同时该方法能同时检测13种有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物，检测快速、高效、低成本、高度自动化且便于产业化应用的优点。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于quechrs方法的快速检验尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的检测方法，该尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的
检测具体操作步骤如下：(a)将冷冻保存的尿液解冻，并取适量于玻璃离心管中，加酶过夜酶解；(b)向步骤(a)的尿液中加入萃取液涡旋混匀，制备得到初步混合液；(c)向(b)步骤初步混合液中加入无水硫酸镁和无水硫酸钠混合盐，快速震荡混匀后，初次取上清液；(d)向步骤（c）中上清液加入吸附剂进行净化，再次离心混匀操作，二次取上清液；(e)将步骤(d)得到的二次取出的上清液氮吹干，再用溶剂定容，得到待检测的样品，该样品中含从尿液中提取的有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物；(f)该待检测的样品采用高效液相色谱
‑
质谱联用仪对尿液中的有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物进行检测，得到尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的含量；利用该手段进行待测样品的制取，一方面能够保证材料的快速稳定制取，更为重要的是该手段相较于传统的方法更加简洁与容易，降低了操作难度，保证了实验的成功率；同时该操作手段简单容易，所用设备都是相较于与原料都比较常规，整体成本大大降低；该检测方法相较于传统的单一量检测，本专利通过采用高效液相色谱
‑
质谱联用仪同步检测，能够快速地完成实验数据的产出，并且二者生成的数据可以互相配合使用，以此快速的完成实验结果数据的生成，同时该操作手段回收率高，既能够节约成本，也能够提高其产能。
7.作为本发明的一种优选技术方案，步骤（a）中所加的酶为100μl β
‑
葡萄糖醛苷酸酶（1000units/ml）和芳基硫酸酯酶（200units/ml）的混合酶。
8.作为本发明的一种优选技术方案，步骤（b）中尿液和萃取液的体积比为1：2，经过对七种萃取液（包括乙腈、含5%甲酸的乙腈、乙酸乙酯、含5%甲酸的乙酸乙酯、乙腈和乙酸乙酯3:1的混合物、乙腈和乙酸乙酯1:3的混合物以及乙腈和二氯甲烷1:3的混合物）及其用量进行优化，最终认为加入的萃取液为4ml含5%甲酸的乙腈混合溶液是最佳。
9.作为本发明的一种优选技术方案，步骤（c）中加入的无水硫酸镁和无水乙酸钠质量比例为4：1，经过优化认为加入总质量为1.5g的无水硫酸镁和无水乙酸钠混合盐最佳。
10.作为本发明的一种优选技术方案，步骤（d）中离心速度为2500转/min，离心时间5min；经过对四种吸附剂（包括n
‑
丙基乙二胺（psa）、石墨碳化黑（gcb）、氧化铝（al2o3）、弗洛里（florisil））及其用量进行优化，最终认为加入的吸附剂为100mg的psa是最佳。
11.作为本发明的一种优选技术方案，步骤（e）中所用溶剂为甲醇溶液。
12.作为本发明的一种优选技术方案，步骤（f）中高效液相色谱工作条件设定如下：色谱柱选用waters的uplc柱子beh c18柱，规格为2.1
×
50mm，1.7μm；电离方式：电喷雾离子源，正负离子模式(esi
±
)；esi+流动相为：a液为含2.5mm乙酸铵的水溶液；b液为甲醇溶液，采用梯度洗脱；梯度洗脱条件为：0~1.25min，5%~95%b；1.25~2min，95%b；2~2.5min，95%~5%b；2.5min~4min，5%b；esi
‑
流动相为：a液为含2.5mm乙酸铵及0.1%乙酸的水溶液；b液为甲醇溶液，采用梯度洗脱；梯度洗脱条件为：0~2.5min，5%~95%b；2.5~3min，95%b；3~3.5min，95%~5%b；3.5min~5min，5%b；检测时间：4
‑
5min。
13.作为本发明的一种优选技术方案，步骤（f）中质谱联用仪工作条件设定如下：检测模式：多反应检测模式；离子源电压：1.49
‑
3kv；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流速：650l/h；三重四级杆质谱（qqq）的优点：能快速、可靠地筛查、识别和定量复杂基质样品中的化合物，灵敏度高。除一般子离子扫描功能外，qqq还具有选择反应检测扫描（srm）、多反应监测扫描（mrm）、母离子扫描、中性丢失等功能；多反应监测是对复杂混合物中目标蛋白质进行准确定量的重要技术手段。作为一种质谱检测的分析方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度高、重现性好、线性动态范围宽、自动化高通量的突出优点，是最灵敏的质谱检测模式。
14.作为本发明的一种优选技术方案，有机磷酸酯及其代谢物的含量计算公式为：；其中c为尿液中有机磷酸酯及其代谢物的含量，ng/ml；c
测
为仪器检测的有机磷酸酯及其代谢物的浓度，ng/ml；v
定
为氮吹后溶剂定容的体积，ml；v
尿
为尿液取样量，ml。
15.作为本发明的一种优选技术方案，待检测的样品经过高效液相色谱
‑
质谱联用仪分析处理得出：待检测的样品成分具体为有机磷酸酯阻燃剂opfrs中的磷酸三（1,3
‑
二氯
‑2‑
丙基）酯（tdcipp）、磷酸三（1
‑
氯
‑2‑
丙基）酯（tcipp）、磷酸三（2
‑
氯乙基）酯（tcep）、磷酸三甲苯酯（tcrp）、磷酸2
‑
乙基己基二苯酯（ehdphp）、磷酸三苯酯（tphp）、磷酸三乙酯（tep），以及其代谢物mopfrs中的：磷酸双（2
‑
氯乙基）酯（bcep）、磷酸双（1
‑
氯
‑2‑
丙基）酯（bcipp）、磷酸双（1,3
‑
二氯
‑2‑
丙基）酯（bdcipp）、磷酸二苯酯（dphp）、4
‑
羟基苯基磷酸(二苯基)酯（4
‑
oh
‑
tphp）、磷酸二对甲酚酯（dpcp）。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明所述的一种基于quechers方法的快速检验尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的检测方法分为材料制备与检测两个阶段：本发明提出的基于quechers方法的快速检验尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的制备方法，操作方便，步骤简单，提取效果好，处理效率高，能快速处理得到适于高效液相色谱
‑
质谱联用仪检测的样品，样品杂质较少，有利于准确灵敏的检测有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物；此外本发明方法的处理成本低，不需要复杂的仪器设备，利用实验室常见的耗材就能完成，因此检测成本投入低，能在各类前处理实验室内完成，费用低廉；本发明提出的有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的检测方法能够同时对13种有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物进行快速高效地检测，检测速度快，自动化程度高，响应灵敏，该检测方法基本上能在4小时内制得16个待测样品，并且能在5分钟内利用高效液相色谱
‑
质谱联用仪同时检测13种有机磷酸酯及其代谢物，大部分物质相对回收率能达到60
‑
120%，便于
产业化应用，能够对采用本发明处理方法处理的尿液样品中的有机磷酸酯及其代谢物进行快速检测，是一种简便，快捷，准确的定性定量检测方法。
附图说明
17.图1为本发明质谱仪器内标法采用的被检测离子条件示意图；图2为本发明三因素四水平的正交实验设计示意图；图3为本发明以florisil作为吸附剂的正交实验结果示意图；图4为本发明以psa作为吸附剂的正交实验结果示意图；图5为本发明极差分析法分析以psa为吸附剂的正交实验结果（相对回收率%）示意图；图6为本发明极差分析法分析以psa为吸附剂的正交实验结果（绝对回收率%）示意图；图7为本发明尿液样品中加标回收率及相对标准偏差示意图；图8为本发明萃取剂种类对提取效果的影响图；图9为本发明吸附剂种类对提取效果的影响图；图10为本发明真实尿液样品中正模式下可检出物质的多反应监测色谱图；图11为本发明真实尿液样品中负模式下可检出物质的多反应监测色谱图。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.如图1至图11所示，本发明提供一种基于quechrs方法的快速检验尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的检测方法，该尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的检测具体操作步骤如下：(a)将冷冻保存的尿液解冻，并取适量于玻璃离心管中，加酶过夜酶解；(b)向步骤(a)的尿液中加入萃取液涡旋混匀，制备得到初步混合液；(c)向(b)步骤初步混合液中加入无水硫酸镁和无水硫酸钠混合盐，快速震荡混匀后，初次取上清液；(d)向步骤（c）中上清液加入吸附剂进行净化，再次离心混匀操作，二次取上清液；(e)将步骤(d)得到的二次取出的上清液氮吹干，再用溶剂定容，得到待检测的样品，该样品中含从尿液中提取的有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物；(f)该待检测的样品采用高效液相色谱
‑
质谱联用仪对尿液中的有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物进行检测，得到尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的含量；利用该手段进行待测样品的制取，一方面能够保证材料的快速稳定制取，更为重要的是该手段相较于传统的方法更加简洁与容易，降低了操作难度，保证了实验的成功率；同时该操作手段简单容易，所用设备都是相较于与原料都比较常规，整体成本大大降低；该检测方法相较于传统的单一量检测，本专利通过采用高效液相色谱
‑
质谱联用
仪同步检测，能够快速地完成实验数据的产出，并且二者生成的数据可以互相配合使用，以此快速的完成实验结果数据的生成，同时该操作手段回收率高，既能够节约成本，也能够提高其产能。
20.其中，步骤（a）中所加的酶为100μl β
‑
葡萄糖醛苷酸酶（1000units/ml）和芳基硫酸酯酶（200units/ml）的混合酶。
21.其中，步骤（b）中尿液和萃取液的体积比为1：2，经过对七种萃取液（包括乙腈、含5%甲酸的乙腈、乙酸乙酯、含5%甲酸的乙酸乙酯、乙腈和乙酸乙酯3:1的混合物、乙腈和乙酸乙酯1:3的混合物以及乙腈和二氯甲烷1:3的混合物）及其用量进行优化，最终认为加入的萃取液为4ml含5%甲酸的乙腈混合溶液是最佳。
22.其中，步骤（c）中加入的无水硫酸镁和无水乙酸钠质量比例为4：1，经过优化认为加入总质量为1.5g的无水硫酸镁和无水乙酸钠混合盐最佳。
23.其中，步骤（d）中离心速度为2500转/min，离心时间5min；经过对四种吸附剂（包括n
‑
丙基乙二胺（psa）、石墨碳化黑（gcb）、氧化铝（al2o3）、弗洛里（florisil））及其用量进行优化，最终认为加入的吸附剂为100mg的psa是最佳。
24.其中，步骤（e）中所用溶剂为甲醇溶液。
25.其中，步骤（f）中高效液相色谱工作条件设定如下：色谱柱选用waters的uplc柱子beh c18柱，规格为2.1
×
50mm，1.7μm；电离方式：电喷雾离子源，正负离子模式(esi
±
)；esi+流动相为：a液为含2.5mm乙酸铵的水溶液；b液为甲醇溶液，采用梯度洗脱；梯度洗脱条件为：0~1.25min，5%~95%b；1.25~2min，95%b；2~2.5min，95%~5%b；2.5min~4min，5%b；esi
‑
流动相为：a液为含2.5mm乙酸铵及0.1%乙酸的水溶液；b液为甲醇溶液，采用梯度洗脱；梯度洗脱条件为：0~2.5min，5%~95%b；2.5~3min，95%b；3~3.5min，95%~5%b；3.5min~5min，5%b；检测时间：4
‑
5min。
26.其中，步骤（f）中质谱联用仪工作条件设定如下：检测模式：多反应检测模式；离子源电压：1.49
‑
3kv；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流速：650l/h。
27.其中，有机磷酸酯及其代谢物的含量计算公式为：；其中c为尿液中有机磷酸酯及其代谢物的含量，ng/ml；c
测
为仪器检测的有机磷酸酯及其代谢物的浓度，ng/ml；v
定
为氮吹后溶剂定容的体积，ml；v
尿
为尿液取样量，ml。
28.其中，待检测的样品经过高效液相色谱
‑
质谱联用仪分析处理得出：待检测的样品成分具体为有机磷酸酯阻燃剂opfrs中的磷酸三（1,3
‑
二氯
‑2‑
丙基）酯（tdcipp）、磷酸三
（1
‑
氯
‑2‑
丙基）酯（tcipp）、磷酸三（2
‑
氯乙基）酯（tcep）、磷酸三甲苯酯（tcrp）、磷酸2
‑
乙基己基二苯酯（ehdphp）、磷酸三苯酯（tphp）、磷酸三乙酯（tep），以及其代谢物mopfrs中的：磷酸双（2
‑
氯乙基）酯（bcep）、磷酸双（1
‑
氯
‑2‑
丙基）酯（bcipp）、磷酸双（1,3
‑
二氯
‑2‑
丙基）酯（bdcipp）、磷酸二苯酯（dphp）、4
‑
羟基苯基磷酸(二苯基)酯（4
‑
oh
‑
tphp）、磷酸二对甲酚酯（dpcp）。
29.关于quechers常用的萃取液有乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷以及它们的混合物等，常用的吸附剂有n
‑
丙基乙二胺（psa）、c18、石墨碳化黑（gcb）等，psa可用于吸附提取液中的极性基质成分，如脂肪酸、有机酸、酚类以及少量色素等；c18可用于去除样品中的一些非极性干扰物；gcb具有片状结构，能较好的吸附具有平面结构的分子，对样品中的色素吸附效果非常显著；由于想要实现同时检测13种opfrs和mopfrs，因此在萃取液、吸附剂等的选择上，需要满足达到净化效果的同时，保证目标物的回收率，这对于本领域技术人员来说仍然是未知的，需要进一步探索才能找到最佳组合。
30.实施例1提取过程的条件优化（1）萃取剂种类的优化为了找到最佳萃取剂种类，本实验使用乙腈（ace）、含5%甲酸的乙腈（0.5%fa/ace）、乙酸乙酯（ea）、含5%甲酸的乙酸乙酯（0.5%fa/ea）、乙腈和乙酸乙酯3:1的混合物（ace/ea （3:1, v/v））、乙腈和乙酸乙酯1:3的混合物（ace/ea （1:3, v/v））以及乙腈和二氯甲烷1:3的混合物（ace/dcm （1:3, v/v））作为萃取剂，其他条件不变（用1.5g 质量比为4:1的无水硫酸镁和无水乙酸钠quechers盐进行盐析分层，加入200mg psa吸附剂进行净化）进行试验，结果如图8所示；结果表明，含5%甲酸的乙腈提取效果最好，因此选择含5%甲酸的乙腈作为最佳萃取剂进行下一步实验；（2）吸附剂种类的优化为了找到最佳吸附剂种类，本实验使用psa、gcb、al2o3、florisil作为吸附剂，七人条件不变（加入2ml优化所得的最佳萃取剂：含5%甲酸的乙腈进行萃取，用1.5g 质量比为4:1的无水硫酸镁和无水乙酸钠quechers盐进行盐析分层）进行试验；结果如图9所示，psa和florisil的效果相当，故对这两种吸附剂均进行了正交实验设计，探究最佳萃取溶剂用量、吸附剂用量及盐用量；（3）最佳萃取溶剂用量、吸附剂用量及盐用量优化为了探究最佳萃取溶剂用量、吸附剂用量及盐用量，分别以psa和florisil作为吸附剂，进行了相同的三因素四水平的正交实验设计，如图2所示；对比两种吸附剂分别进行的正交实验结果可知，以florisil为吸附剂的正交实验存在部分条件下ehdphp、bcep、dphp、dpcp、4
‑
oh
‑
tphp的相对回收率不在60%
‑
120%范围内，而以psa为吸附剂的正交实验只有dphp、4
‑
oh
‑
tphp、bdcipp存在部分条件下相对回收率不在60%
‑
120%范围内，由图3和图4可知，psa比florisil更适合作为下一步实验的吸附剂，并且以下将用极差分析法仅讨论以psa为吸附剂的正交实验结果；用极差分析法分析正交实验结果，分析原则为：由表4计算得出每个因素各个水平的平均值（k1、k2、k3、k4分别代表4个水平的平均值），根据该因素所有水平的平均值的极差r大小判断因素主次顺序（极差越大，对结果影响越大，主次顺序越靠前）；根据每个水平的
平均值判断最优组合（平均值越大，效果越好，结果越优）；由图5和图6结果可知，因素a（最佳萃取剂用量）对结果影响最大，其次为因素b（吸附剂用量），因素c（盐用量）对结果影响最小；由相对回收率的分析结果可知，因素a水平1最佳，因素b水平1和水平2相当，因素c水平2最佳；结合绝对回收率，由于萃取剂用量为4ml（因素a的水平2）时，mopfrs的绝对回收率是萃取剂用量为2ml（因素a的水平1）时的绝对回收率的1
‑
2倍，故认为因素a的水平2更佳；绝大多数物质在因素b水平2时的绝对回收率比因素b水平1时的绝对回收率好，故认为因素b水平2更佳，因此，选择4ml的萃取剂用量、100mg的吸附剂用量、1.5g的盐用量进行后续实验。
31.实施例2按照上述实验步骤对尿液样品中有机磷酸酯及其代谢物进行分析；在2.5ng/ml、12.5ng/ml和25ng/ml三个添加水平下进行加标回收试验，每个水平平行做3个重复，计算回收率及相对标准偏差（rsd），结果如图7。结果可得，回收率在62.40~119.78%范围内，rsd＜11.46，表明建立的方法适用于13种有机磷酸酯及其代谢物的检测。
32.实施例3某22岁男性尿液采用的一种基于quechers方法的快速检验尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的检测方法如下：取2ml尿液加酶过夜酶解，进而加入4ml含5%甲酸的乙腈涡旋混匀，再加入1.5g无水硫酸镁和无水乙酸钠混合物（质量比为4:1），快速震荡混匀，离心后取上清液，然后加入100mg psa净化，再次离心取上清液，氮吹干后用甲醇溶剂定容，得到待检测的样品；色谱柱选用waters的uplc柱子beh c18柱，规格为2.1
×
50mm，1.7μm；电离方式：电喷雾离子源，正负离子模式(esi
±
)；esi+流动相为：a液为含2.5mm乙酸铵的水溶液；b液为甲醇溶液，采用梯度洗脱；梯度洗脱条件为：0~1.25min，5%~95%b；1.25~2min，95%b；2~2.5min95%~5%b；2.5min~4min，5%b；esi
‑
流动相为：a液为含2.5mm乙酸铵及0.1%乙酸的水溶液；b液为甲醇溶液，采用梯度洗脱；梯度洗脱条件为：0~2.5min，5%~95%b；2.5~3min，95%b；3~3.5min，95%~5%b；3.5min~5min，5%b；检测时间：4
‑
5min；质谱仪器工作条件设定如下：检测模式：多反应mrm模式；离子源电压：1.49
‑
3kv；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流速：650l/h；检测结果为：有3种opfrs及5种mopfrs检出，其检测得到的图谱如图10和图11所示，根据峰面积定量，最终计算结果为尿液中含有磷酸三（2
‑
氯乙基）酯（tcep）0.046 ng/ml、磷酸三（1
‑
氯
‑2‑
丙基）酯（tcipp）0.036 ng/ml、磷酸2
‑
乙基己基二苯酯（ehdphp）0.362 ng/ml；磷酸双（2
‑
氯乙基）酯（bcep）0.7 ng/ml、磷酸双（1
‑
氯
‑2‑
丙基）酯（bcipp）0.333 ng/
ml、、磷酸二苯酯（dphp）0.09 ng/ml、4
‑
羟基苯基磷酸(二苯基)酯（4
‑
oh
‑
tphp）0.086 ng/ml、磷酸二对甲酚酯（dpcp）0.068 ng/ml。
33.实施例4某21岁女性尿液采用的一种基于quechers方法的快速检验尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的检测方法同实施例3结果为有3种opfrs及5种mopfrs检出，其检测得到的图谱如图9所示，根据峰面积定量，最终计算结果为尿液中含有磷酸三（2
‑
氯乙基）酯（tcep）0.033 ng/ml、磷酸三（1
‑
氯
‑2‑
丙基）酯（tcipp）0.04 ng/ml、磷酸2
‑
乙基己基二苯酯（ehdphp）0.515 ng/ml；磷酸双（2
‑
氯乙基）酯（bcep）0.705 ng/ml、磷酸双（1
‑
氯
‑2‑
丙基）酯（bcipp）0.498ng/ml、、磷酸二苯酯（dphp）0.066 ng/ml、4
‑
羟基苯基磷酸(二苯基)酯（4
‑
oh
‑
tphp）0.009 ng/ml、磷酸二对甲酚酯（dpcp）0.099 ng/ml。
34.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
35.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。