一种基于银沉积信号放大的口岸猪流行性腹泻病毒电化学检测方法与流程

1.一种基于银沉积信号放大的口岸猪流行性腹泻病毒电化学检测方法，属于生命科学技术领域。


背景技术：

2.口岸检疫检测能力是口岸公共卫生核心能力的重要组成部分，也是有效防控疫情输入的重要保障。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,pedv)也是冠状病毒科冠状病毒属的单股正链rna病毒，与sars-cov-2科属一致，该类病毒感染所致的猪流行性腹泻给动物健康带来严重威胁，同时给畜牧养殖造成巨大经济损失，可作为sars-cov-2等冠状病毒的模式病毒进行检测方法研发。目前针对pedv的检测方法主要有六种，即胶体金试纸条法、拉曼光谱法、病毒分离培养法、免疫电镜法、聚合酶链式反应技术(pcr)和酶联免疫吸附测定技术(elisa)。胶体金试纸条法是一种pedv的常见诊断方法，但通常情况下，它需要高浓度的标签才能使颜色可见，其检测灵敏度低于实验室仪器检测方法的1000倍；使用拉曼光谱仪读取试纸条信号时，试纸中的硝酸纤维素膜常常产生干扰信号，影响检测结果的准确度；分离手段检测病毒耗时长且成功率不高，只能作为一种辅助性检测方法；免疫电镜法设备要求高、报告结果时间长，限制了它的普及；pcr和elisa都会出现假阳性结果，同样不能在临床使用中推广。因而进一步研究一种灵敏度高、易于操作、选择性高的pedv检测新方法显得尤为重要。
3.在现有的核酸检测方法中，基于核酸外切酶iii(exo iii)辅助的核酸检测技术具有灵敏度高、操作简单、等温反应，特别是不需要特定的识别位点等优点，在生物传感技术领域受到广泛关注。exo iii最适合的底物是平齐或凹陷的3’末端的双链dna，从3’羟基末端逐步切去单核苷酸，对单链dna和3’末端凸出4个或更多碱基的双链dna的活性非常有限，甚至完全没有活性。exo iii为发展新型生物传感技术提供了一个优良的平台，如今，exo iii已经与多种信号检测技术相结合用于核酸检测。
4.与此同时，为了提高检测性能，各种信号放大技术，如杂交链式反应、滚环扩增反应、纳米材料、银沉积、聚合反应等被应用于生物传感领域。其中，利用银沉积反应进行信号放大具有操作简单、反应进程可控等优点，其在生物传感中的应用得到了广大科研工作者的青睐。


技术实现要素：

5.针对现存技术不足，本发明目的是提供一种基于银沉积信号放大的口岸猪流行性腹泻病毒电化学检测方法，具有高特异性、高灵敏度等特点。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
7.一种基于银沉积信号放大的口岸猪流行性腹泻病毒电化学检测方法，包括以下步骤：
8.(1)mbs-probe1的制备
9.取10μl10mg/ml链霉亲和素修饰的磁珠，用50mmtris-hcl缓冲液洗涤3次后将磁珠稀释5倍，然后将20μl10μm探针1、50μlmbs、230μltris-hcl混合，于37℃震荡90min，tris-hcl洗涤3次后加入500μl2％bsa进一步处理1h，最后重悬于3mltris-hcl中；
10.(2)aunps-probe2的制备
11.将20μl10μm探针2加热至95℃，持续5min，迅速冷却至室温，随后与500μlaunps混合，摇晃12h后，将不同浓度氯化钠溶液加入上述溶液中，每次间隔30min，静置24h后于4℃12000rpm30min离心三次，最后重新分散在1ml50mmtris-hcl中，4℃避光保存；
12.(3)信号元件aunps-probe4的获得
13.将300μl上述(1)得到的溶液mbs-probe1、200μl上述(2)得到的溶液aunps-probe2与20μl1μmpedv混合并于37℃下轻轻摇晃1h，进行三次磁性分离洗涤后加入2μl10u/μl核酸外切酶ⅲ，37℃轻轻摇晃30min，随后于70℃20min终止反应，最后，磁性分离并收集上清；
14.(4)丝网印刷电极的表面修饰
15.在激活的丝网印刷电极表面滴加100μl5mm的氯金酸溶液进行电沉积120s，沉积电位为-200mv，而后在上述镀金丝网印刷电极表面滴加10μl1μm探针3，37℃孵育1.5h，用蒸馏水冲洗后，再滴加100μl1.0mmmch溶液，37℃孵育30min以封闭非特异性吸附位点，蒸馏水冲洗后，取10μl进行权利要求4后得到的上清液滴加在电极表面并于37℃孵育1.5h；
16.(5)银沉积反应
17.取0.25mmagno3和0.25mm对苯二酚，按1：1混合，配置成银沉积溶液，将进行上述(4)后所得的丝网印刷电极用蒸馏水冲洗，而后滴加5μl上述银沉积溶液于电极表面，黑暗中沉积20min后用蒸馏水冲洗；
18.(6)电化学测定
19.将进行上述(5)后所得丝网印刷电极于1.0mkcl溶液中进行方波伏安法扫描，其设置为：初始电位-0.15v，终止电位0.35v，电位增量2.0mv，脉冲幅值25mv，频率10hz，静置时间1s。
20.本方法设计并基于银沉积信号放大原理实现对猪流行性腹泻病毒的便携式电化学检测，不同于胶体金试纸的低灵敏度以及电镜检测的耗时、设备要求高，该设计使信号得到成倍放大、灵敏度极大提高的同时，稳定性和重现性相对更高，建立了一种简单、灵敏、便携的猪流行性腹泻病毒检测方法，为今后的疾病防治提供了方便。
附图说明
21.图1为检测体系的构建原理示意图。
22.图2为检测体系的可行性验证图。
23.图3为不同浓度pedv的检测结果图：(a)不同浓度pedv检测的方波伏安图，(b)pedv与对应电流强度的线性关系图。
具体实施方式
24.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
25.实施例1.检测方法的构建
26.一种基于银沉积信号放大的口岸猪流行性腹泻病毒电化学检测方法，包括以下步骤：
27.(1)mbs-probe1的制备
28.取10μl10mg/ml链霉亲和素修饰的磁珠，用50mmtris-hcl缓冲液洗涤3次后将磁珠稀释5倍，然后将20μl10μm探针1、50μlmbs、230μltris-hcl混合，于37℃震荡90min，tris-hcl洗涤3次后加入500μl2％bsa进一步处理1h，最后重悬于3mltris-hcl中；
29.(2)aunps-probe2的制备
30.将20μl10μm探针2加热至95℃，持续5min，迅速冷却至室温，随后与500μlaunps混合，摇晃12h后，将不同浓度氯化钠溶液加入上述溶液中，每次间隔30min，静置24h后于4℃12000rpm30min离心三次，最后重新分散在1ml50mmtris-hcl中，4℃避光保存；
31.(3)信号元件aunps-probe4的获得
32.将300μl上述(1)得到的溶液mbs-probe1、200μl上述(2)得到的溶液aunps-probe2与20μl1μmpedv并于37℃下轻轻摇晃1h，进行三次磁性分离洗涤后加入2μl10u/μl核酸外切酶ⅲ，37℃轻轻摇晃30min，随后于70℃20min终止反应，最后，磁性分离并收集上清；
33.(4)丝网印刷电极的表面修饰
34.在激活的丝网印刷电极表面滴加100μl5mm的氯金酸溶液进行电沉积120s，沉积电位为-200mv，而后在上述镀金丝网印刷电极表面滴加10μl1μm探针3，37℃孵育1.5h，用蒸馏水冲洗后，再滴加100μl1.0mmmch溶液，37℃孵育30min以封闭非特异性吸附位点，蒸馏水冲洗后，取10μl进行权利要求4后得到的上清液滴加在电极表面并于37℃孵育1.5h；
35.(5)银沉积反应
36.取0.25mmagno3和0.25mm对苯二酚，按1：1混合，配置成银沉积溶液，将进行上述(4)后所得的丝网印刷电极用蒸馏水冲洗，而后滴加5μl上述银沉积溶液于电极表面，黑暗中沉积20min后用蒸馏水冲洗；
37.(6)电化学测定
38.将进行上述(5)后所得丝网印刷电极于1.0mkcl溶液中进行方波伏安法扫描，其设置为：初始电位-0.15v，终止电位0.35v，电位增量2.0mv，脉冲幅值25mv，频率10hz，静置时间1s。
39.实施例2.可行性验证
40.选取20μl1μmpedv标准溶液进行可行性验证，本实施例的检测方法包括的步骤同发明内容(1)-(6)。如图2所示，首先，在不添加pedv(曲线a)下进行检测，此时电流强度较弱，而对比添加了pedv(曲线b)时，能够发现电流明显增强，通过对比实验，充分证明了该pedv电化学检测方法的可行性。
41.实施例3.灵敏度实验
42.选取浓度分别为1、10、100、1000nm的pedv标准溶液进行检测，本实施例的检测方法包括的步骤同发明内容(1)-(6)。如图3(左)所示，随着溶液中pedv浓度的不断升高，电极表面的电流不断增大。如图3(右)所示，根据不同浓度pedv溶液产生的电流得到的线性结果图，该生物传感器的线性检测方程为：i＝2.53775+3.50079lgc(r2＝0.99999)，检测范围为1-1000nm，基于信噪比等于3的计算方法，得到该检测体系的最低检测限为0.4744nm。这表
明本发明方法能够有效、高灵敏检测溶液中的pedv含量。通过更换核酸探针，该传感体系亦能够实现对sars-cov-2的灵敏检测，在冠状病毒的实际检测应用中有巨大潜力。