一种脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂盒的制备及检测方法与流程

一种脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂盒的制备及检测方法
技术领域
1.本发明涉及体外诊断试剂技术领域，尤其涉及一种脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂盒的制备及检测方法。


背景技术：

2.脂蛋白相关磷脂酶a2(lp-pla2)由441个氨基酸组成，相对分子质量为45kda。由于能降解血小板活化因子的活性，所以也被称为血小板活化因子乙酰水解酶(paf-ah)。lp-pla2能将paf水解为无活性的溶血paf，减少炎症和血栓的形成，具有抗炎和抗动脉粥样硬化的作用。近年来经大量的临床及实验研究证实，人血浆lp-pla2主要由巨噬细胞、单核细胞、t淋巴细胞以及肥大细胞等分泌产生，并受γ干扰素、脂多糖、血小板活化因子等多种炎性因子的调节，血浆中的lp-pla2主要作用是水解氧化卵磷脂。lp-pla2能通过水解动脉内膜上氧化低密度脂蛋白(ldl)上的氧化磷脂而生成溶血磷脂酰胆碱和氧化型游离脂肪酸，这两种促炎介质能刺激黏附因子和细胞因子的产生，促进动脉粥样硬化的发生和发展，导致血栓形成和心血管事件的发生。因此lp-pla2可作为心血管疾病中一种新的炎症酶，是心血管疾病(cvd)、冠心病(chd)、以及缺血性脑卒中的独立危险因素。
3.lp-pla2的检测能直接准确的反应血管内炎症的程度，并且可以作为一个动态指标，与c-反应蛋白不同，lp-pla2是血管炎症高特异性标志物。检测lp-pla2水平的变化，可以了解发生粥样硬化相关的心脑血管栓塞性疾病的风险，能给临床医生提供预防和治疗心脑血管疾病的新靶点，及时的采取预防和治疗措施。
4.目前，应用于脂蛋白相关磷脂酶a2(lp-pla2)检测的方法包括酶联免疫吸附法、放射性免疫检测法、化学放光免疫分析法、胶乳增强免疫比浊法等等。酶联免疫吸附法操作繁琐，耗吋，自动化水平低。而放射性免疫分析法虽然具有特异性强灵敏度高的特点，但也存在潜在放射性污染，因此也逐渐不被接受。化学发光免疫分析法是利用化学发光物质经催化剂催化和氧化剂氧化，形成一个激发态的中间体，这种激发态的中间体回到稳定基态时，发出光子，利用发光信号测量仪测量光子数，从而间接测定lp_pla2的浓度。此法存在吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺直接标记抗体的发光效率低，标记物不稳定等问题，因这种直接标记法属于瞬间发光型，所以很难保证测试结果的稳定性和重复性，且需要特殊的检测仪器，不便于临床应用。胶乳增强免疫比浊法是一种灵敏、简洁、快速的检测方法，但受血脂浓度的影响较大，而心血管病人有很大一部分都存在血脂浓度高的情况，容易产生假阳性。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂盒的制备及检测方法，所述脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂盒在对脂蛋白相关磷脂酶a2进行检测时可直接采用生化分析仪按照分光光度法进行检测，该检测方法对检测设备的要求较低、原理简单，操作简易，同时缩短分析时间、试剂稳定性较高，可有效地提高脂蛋白相关磷脂酶a2检测结果的准确性。
6.为达到上述技术效果，本发明采用了以下技术方案：
7.一种脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂盒的制备及检测方法，1.一种脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂盒，其特征在于，包括r1试剂和r2试剂，所述r1试剂和r2试剂的组成如下：
8.r1试剂：缓冲液、电解质、表面活性剂、防腐剂以及水；
9.r2试剂：脂蛋白相关磷脂酶a底物、缓冲液、保护剂、助溶剂、防腐剂以及水。
10.进一步地，所述r1试剂和r2试剂的ph值均为6.9-7.1，优选为7.0。
11.进一步地，所述r1试剂中的缓冲液具体为pbs缓冲液、三羟甲基氨基甲烷tris缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲液中一种或多种混合；所述r2试剂中的缓冲液为pbs缓冲液、柠檬酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲液中的任意一种或多种混合。
12.进一步地，所述表面活性剂为曲拉通(triton)x100、曲拉通(triton)x405、吐温(tween)20、吐温(tween)80、brij-66中的一种或多种。
13.进一步地，所述r1试剂中的电解质为氯化钠或者氯化钾。
14.进一步地，所述保护剂为山梨醇、甘露醇、乙醇中的一种或多种，所述助溶剂为甘油、丙二醇、异辛醇中的一种或多种。
15.进一步地，所述r1试剂的组成为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲液、吐温(tween)20、叠氮钠、氯化钠以及水，所述r2试剂的组成为柠檬酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、甘露醇、叠氮钠、甘油以及水。
16.进一步地，所述r1试剂和r2试剂的体积比是3:1。
17.第二方面，本发明还提供一种脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂盒的制备方法，具体包括以下步骤：
18.s1：r1试剂的配制：将缓冲液和水按照浓度要求配比加入到容器中，搅拌均匀；按照配比加入电解质、表面活性剂、防腐剂，继续搅拌至完全溶解，用缓冲液定容。
19.s2：r2试剂的配制：将缓冲液加入容器中，搅拌均匀；加入脂蛋白相关磷脂酶a底物，搅拌均匀；加入按一定配比的保护剂、助溶剂并搅拌均匀；加入防腐剂，搅拌至防腐剂完全溶解，用水定容。
20.第二方面，本发明还提供一种脂蛋白相关磷脂酶a2检测方法，该方法即是采用上述脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂盒对脂蛋白相关磷脂酶a2的活性进行检测。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
22.第一方面，本发明提供的一种脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂盒采用采用生化分析仪分光光度法来测定lp-pla2的活性，其原理是利用lp-pla2水解底物1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱在水溶液中不稳定，易游离出一种有颜色的产物4-对硝基苯酚，其吸光度的变化速率与lp-pla2活性成正比，通过在特定波长下可以检测到吸光度的变化，以此来测定lp-pla2的活性，其方法学原理简单，操作简易，具有分析时间短，结果准确，试剂稳定性高等特点。
23.第二方面，本发明提供的一种脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂盒通过在r2试剂组成中加入配比适量的保护剂和助溶剂，保护剂能保护lp-pla2底物不受干扰酶降解，助溶剂可以提高lp-pla2底物在水中的溶解性，从而可以有效解决lp-pla2底物酶法检测准确度和灵敏度不高的问题。
附图说明
24.图1为本发明的实施例1的准确性验证结果；
25.图2为本发明的实施例2的准确性验证结果；
26.图3为本发明的实施例3的准确性验证结果；
27.图4为本发明的实施例1的稳定性验证结果；
28.图5为本发明的实施例2的稳定性验证结果；
29.图6为本发明的实施例3的稳定性验证结果；
具体实施方式
30.下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
31.实施例1
32.本实施例所提供的脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，其中，所述r1试剂和r2试剂的组成如下：
33.r1试剂：
[0034][0035]
r2试剂：
[0036][0037]
按照以上配比对脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂盒进行制备，具体的制备步骤如下：
[0038]
s1：r1试剂的配制：将缓冲液和水按照浓度要求配比加入到容器中，搅拌均匀；按照配比加入电解质、表面活性剂、防腐剂，继续搅拌至完全溶解，用缓冲液定容。
[0039]
s2：r2试剂的配制：将缓冲液加入容器中，搅拌均匀；加入脂蛋白相关磷脂酶a底物，搅拌均匀；加入按一定配比的保护剂、助溶剂并搅拌均匀；加入防腐剂，搅拌至防腐剂完全溶解，用水定容。
[0040]
实施例2
[0041]
本实施例所提供的脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，其中，所述r1试剂和r2试剂的组成如下：
[0042]
r1试剂：
[0043][0044][0045]
r2试剂：
[0046][0047]
该脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂盒的制备方法与实施例1相同。
[0048]
实施例3
[0049]
本实施例所提供的脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，其中，所述r1试剂和r2试剂的组成如下：
[0050]
r1试剂：
[0051][0052]
r2试剂：
[0053][0054]
该脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂盒的制备方法与实施例1相同。
[0055]
实施例4
[0056]
本实施例4采用国家食品药品监督管理局认可的北京九强生物科技公司的脂蛋白相关磷脂酶a2(lp-pla2)检测试剂盒作为阳性对照品。
[0057]
实施例5
[0058]
采用本实施例1-3提供的脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂盒及实施例4提供的脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂盒进行准确度性能评价，评价方法及结果如下：
[0059]
比对试验：参照ep9a2的方法，收集新鲜的临床样本共40份，所选lp-pla2浓度在试剂线性范围内并均匀分布。用实施例1-3提供的脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂盒与实施例4提供的脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂盒分别对各临床样本中lp-pla2的浓度进行测定，具体的检测方法如下：
[0060]
在全自动生化分析仪(全自动贝克曼au480生化分析仪)上设定：测试主波长405nm，测试副波长505nm，比色杯光径为1.0cm；检测方法为速率法(rate)；反应方向为上升反应。
[0061]
具体的操作步骤如表1所示：
[0062]
表1测定脂蛋白相关磷脂酶a2活性的检测步骤
[0063][0064]
在测定样本前，需要进行校准和质控程序，使用配套的校准品作校准曲线，本发明的校准曲采用2点线性法定标。校准曲线每7天重新制作一次，当发生如下情形时，需要重新校准:试剂批号更换时，仪器更换零部件或者保养时，质控品或样本结果异常时。质控程序:采用配套的质控品，每天进行质控实验；每个浓度质控品重复测量10次，计算精密度cv，控制在质控品偏差范围内。
[0065]
根据校准曲线，计算样本的脂蛋白相关磷脂酶a2活性，计算方法如下：
[0066][0067]
采用上述方法，对脂蛋白相关磷脂酶a2活性进行测定，同时计算对比结果的相关系数(r)和直线回归方程，计算结果如表2所示：
[0068]
表2三种实施例试剂盒检测40例样本中的lp-pla2活性(u/l)
[0069][0070]
根据上述结果，对结果进行统计分析，分析结果如附图1-3所示，同时，根据分析结果得出如下结论：
[0071]
根据线性回归方程：y＝ax+b，从三组对比结果的r2可以看出，实施例3与实施例4的对比结果相关性要明显优于实施例1、实施例2，说明采用本发明方法实施例3制备的脂蛋白相关磷脂酶a2(lp-pla2)液体双试剂准确度较高，符合使用标准。
[0072]
同时，采用本实施例1-3提供的脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂盒及实施例4提供的脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂盒进行准稳定性能评价，评价方法及结果如下：
[0073]
将实施例1-实施例3提供的脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂盒每组平均分成两份，一份置于2-8℃保存，另一份置于37℃水浴中保存，每隔一天测定一次，连续监测一周，观察血清样本测定值(血清定值460u/l，允许误差范围
±
10％)，通过连续的测定结果比较试剂的稳定性，测试结果如表3-表5所示：
[0074]
表3采用实施例1的方法配制的试剂稳定性数据单位(u/l)
[0075][0076]
表4采用实施例2的方法配制的试剂稳定性数据单位(u/l)
[0077][0078]
表5采用实施例3的方法配制的试剂稳定性数据单位(u/l)
[0079]
[0080]
对上述结果进行统计分析，分析结果如附图4-附图6所示，由附图4、附图5及附图6可以看出，采用实施例1-3方法制得的试剂在2-8℃保存时稳定性相对良好。尤其是采用实施例3方法制得的试剂于37℃下水浴一周，虽然测定lp-pla2活性有一定程度下降，但是下降幅度不大，在允许范围内，而且明显优于实施例1、实施例2方法制得的试剂。说明加入配比合适的保护剂和助溶剂可以有效的提高试剂的稳定性，大大提高试剂盒稳定周期。
[0081]
综上性能评价可知，采用本发明实施例3方法配制的蛋白相关磷脂酶a2液体双试剂具有准确度高、稳定性好的优点，可以满足临床需求。检测lp-pla2活性的变化，可以了解发生粥样硬化相关的心脑血管栓塞性疾病的风险，能给临床医生提供预防和治疗心脑血管疾病的新靶点，及时的采取预防和治疗措施。
[0082]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。