用于肺腺癌诊断的标志物及其应用的制作方法

1.本发明涉及检测诊断技术领域，具体涉及一种用于肺腺癌诊断的标志物及其筛选方法和应用。


背景技术：

2.根据组织病理学，肺癌主要分为非小细胞肺癌(nsclc)和小细胞肺癌(sclc)两类，非小细胞肺癌占比高达85％～90％。nsclc进一步包括肺腺癌、肺鳞癌和大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚，而其中最常见的肺癌亚型是肺腺癌。临床上，非小细胞肺癌在诊断时常常已进入为晚期。超过半数的非小细胞肺癌患者在确诊后1年内死亡，5年生存率不到20％。但是，早期肺癌患者5年生存率可高达90％以上。因此，对肺癌的早期诊断是肺癌患者获得良好预后以及减少死亡率的重要方法。
3.临床上确诊肺癌的手段主要依靠超声影像和肺穿刺。其中，超声诊断的灵敏度较低，而肺穿刺对患者的肺部有损伤，存在风险，不易推广，导致很多患者直到肺癌失代偿期才被确诊。有研究发现：基因分子可以作为肺癌诊断的标志物，但是单个基因诊断的敏感度与特异性亟待提高。
4.另外，美国国家肺部筛查试验(nlst)的数据表明，利用低剂量计算机断层扫描(ldct)对高危人群进行早期肺癌筛查，可将肺癌死亡率降低20％，总死亡率降低7％(bethesda,et al.reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening.n engl j med.2011；365:395-409.)。但是，ldct存在辐射暴露和假阳性率高等问题，影响基于ldct筛查在全球范围内的实用性。
5.代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后的一门新兴学科，是系统生物学的重要组成部分。代谢组学已经发展并迅速渗透到许多领域，其目的是通过监测生物液或组织中小分子代谢物的水平来研究生物系统中的整体代谢差异，并寻找代谢物与病理生理变化的相对关系。肿瘤的发生必然伴随有代谢的改变，但是在早期阶段，小分子代谢物的变化非常微弱，不容易被发现(pei-hsuan,c.,ling,c.,kenneth,h.et al.metabolic diversity in human non-small cell lung cancer cells.molecular cell.2019,76,1-14.brandon,f.,ashley,s.,ralph,j.d.metabolic reprogramming and cancer progression.science.2020,april 10；368.)。大量研究表明，肿瘤的发生和发展与能量代谢密切相关，比如瓦博格效应(warburg effect)、三羧酸循环(tca)、糖酵解途径等，为满足癌细胞增殖提供能量需求(vander heiden,mg.,cantley,lc.,thompson,cb.understanding the warburg effect:the metabolic requirements of cell proliferation.science 2009；324(5930):1029-33.)。因此，基于血液或尿液的生物标记物或多重标记物组合可以补充ldct筛查的缺陷，可能能够在实施肺癌筛查方面作出重大贡献。
6.在过去十年中，也有一些科学家尝试在肺癌筛查、诊断、预后等领域应用代谢组学，研究发现了一些在肺癌发生和发展过程中发生改变的代谢物和代谢通路，获得了一些
可靠的肺癌诊断生物标志物，例如mathe,e.a.,patterson,a.d.,haznadar,m.et al.noninvasive urinary metabolomic profiling identifies diagnostic and prognostic markers in lung cancer.cancer res.2014,74:3259-3270.william,r.w.,samir,h.,brian,d.et al.diacetylspermine is a novel prediagnostic serum biomarker for non-small-cell lung cancer and has additive performance with pro-surfactant protein b.j clin oncol.2015,nov 20；33(33):3880-6.agnieszka,k.,szymon,p.,mariusz,k.et al.serum lipidome screening in patients with stage i non-small cell lung cancer.clin exp med.2019；19(4):505-513.)。但这些研究基本上都是利用公共数据库的代谢物信息，大多数研究样本量不大，并且样本来源单一，筛选得到的代谢物针对早期肺癌筛查特异性不强，在实际临床应用中价值不大。


技术实现要素：

7.基于此，有必要提供一种用于肺腺癌诊断的标志物及其筛选方法和应用，筛选得到的代谢标志物临床应用价值大，尤其能够适用于早期肺癌预测诊断。
8.本发明采用如下技术方案：
9.本发明提供一种用于诊断或监测肺腺癌的标志物，所述代谢标志物至少选自d-半乳糖、高瓜氨酸、n6-乙酰-l-赖氨酸、4-羟基-l-脯氨酸、十六烷二酸、鸟嘌呤、谷氨酸、肌酸、丙氨酸、犬尿酸中的至少一种。
10.本发明提供一种用于诊断或监测肺腺癌的标志物，所述代谢标志物组合至少选自d-半乳糖、高瓜氨酸、n6-乙酰-l-赖氨酸、4-羟基-l-脯氨酸、十六烷二酸、鸟嘌呤中的至少一种。进一步地，所述标志物组合还选自谷氨酸、肌酸、丙氨酸、犬尿酸中的至少一种。
11.在roc曲线评价方法中，本发明中单个代谢标志物在roc曲线下的面积auc值为0.7～0.9。多个代谢物组的性能明显优于单个代谢物，roc曲线下的面积auc值为0.86～0.99，能够对早期肺腺癌患者进行有效诊断。
12.上述所述用于诊断或监测肺腺癌的代谢标志物在制备诊断或监测肺腺癌的代谢物数据库、试剂产品或者试剂盒中的应用。
13.本发明还提供一种试剂产品或者试剂盒，包括上述所述的用于早期诊断或监测肺腺癌的代谢标志物的标准品。
14.进一步地，所述试剂产品或者试剂盒还包括提取富集所述代谢标志物的溶剂和/或内标物。
15.本发明还提供一种用于诊断或监测肺腺癌的代谢标志物的筛选方法，包括如下步骤：
16.分别采集肺腺癌组样本和健康组血清样本，肺腺癌组样本的患者的tnm分期包括为i期、ii期、iii期、iv期；
17.随机挑选肺腺癌组和健康组各20％的样本，采用增强离子扫描质谱和飞行时间质谱结合多反应监测采集模式的代谢组学方法，以及整合本地标准品数据库进行肺腺癌血清代谢物数据库构建；采用构建肺腺癌血清代谢物数据库和lc-ms检测对采集的血清样本进行分析，得到各血清样本的原始质谱数据；使用multiquant软件，根据质荷比、保留时间对原始质谱数据进行预处理和校正；根据质谱峰强度计算峰面积得到代谢物相对含量信息；
将代谢物相对含量信息进行多元统计正交-偏最小二乘法判别分析，并根据变量权重值大于1及单变量统计分析的p值小于0.05的筛选标准，得到候选差异代谢物；将候选差异代谢物进行二元逻辑回归建模，筛选优异代谢物及其组合对肺腺癌患者进行诊断，对筛选的优异代谢物及其组合进行受试者工作特征曲线分析，确定用于诊断或监测肺腺癌的代谢标志物。
18.与现有技术相比，本发明筛选的10种代谢标志物能够对肺腺癌患者进行有效诊断。本发明仅通过取血检测就能实现肺腺癌诊断，无需额外采集组织样本，能够很好地替代现有的组织活检及影像学诊断模式，减少创伤和辐射风险。
附图说明
19.图1为本发明实施例1所提供的代谢物opls-da的s-plot图。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
21.以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
22.在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。关键仪器信息分别见下表1：
23.表1实验仪器信息
24.名称型号品牌lc-ms/msqtrap 6500+sciex离心机5424reppendorf离心浓缩仪centrivaplabconco涡旋混合器vortex-5kyllin-be11
25.术语说明
26.本发明所述“本地标准品数据库”是指本发明将大量相关代谢物分子标准品进行质谱检测后，收集这些代谢物的质谱信息，由此形成一个本地化的标准品数据库。
27.实施例1
28.本实施例提供一种肺腺癌诊断代谢标志物的筛选方法，包括如下步骤：
29.s1，采集样品
30.本研究在取得患者同意后，收集上海市胸科医院的242例肺腺癌患者(肺腺癌组，其中包括172例早期肺腺癌患者)和150例健康人(健康组)样本的外周静脉血血清。其中，包括肺腺癌患者的诊断标准是经术后病理确诊。根据tnm分期，将i期和ii期肺腺癌患者定义为早期肺腺癌患者。所有肺腺癌患者和非肺腺癌组样本均无其它恶性肿瘤病史，无其他全身性重大疾病，无长期用药的慢性病史。采血时间均为清晨空腹状态。所有血清样本离心后置于-80℃冰箱内保存，研究时分别取出血清样品解冻后进行后续分析。
31.s2，血清广泛靶向代谢组学分析
32.(1)样品预处理
33.从-80℃冰箱中取出步骤s1采集的样品，于冰上解冻至样本中没有冰块(后续操作都要求在冰上进行)；样本解冻后，涡旋10s混匀，取样本50μl加入到对应编号的离心管中；加入300μl纯甲醇内标提取液(含100ppm浓度的l-苯基丙氨酸内标)；涡旋5min，静置24h，再于12000r/min、4℃条件下离心10min；吸取上清液270μl浓缩24h；再加入100μl由乙腈和水按照体积比1:1组成的复溶液中，用于lc-ms/ms分析。每个样本各取20μl混合成质控样本(qc)，每间隔15个样本采集一次。
34.(2)样品代谢物检测分析
35.表3实验试剂
36.化合物cas编号品牌甲醇67-56-1merck乙腈75-05-8merck乙酸64-19-7aladdinl-苯基丙氨酸63-91-2isoreag
37.确定液相色谱条件如下：
38.色谱柱：waters acquity uplc hss t3 c18 1.8μm，2.1mm*100mm；柱温为40℃；进样量为2μl。
39.流动相：a相为含0.1％乙酸水溶液，b相为含0.1％乙酸的乙腈溶液。洗脱梯度程序为：0min，a相与b相的体积比为95:5；11.0min，a相与b相的体积比为10:90；12.0min，a相与b相的体积比为10:90；12.1min，a相与b相的体积比为95:5；14.0min，a相与b相的体积比为95:5v/v。流速0.4ml/min。
40.确定质谱条件：电喷雾离子源(electrospray ionization，esi)温度500℃，质谱电压5500v(positive)或者-4500v(negative)，离子源气体i(gs i)55psi，气体ii(gs ii)60psi，气帘气(curtain gas,cur)25psi，碰撞诱导电离(collision-activated dissociation，cad)参数设置为高。
41.在三重四极杆(qtrap)中，每个离子对是根据优化的去簇电压(declustering potential，dp)和碰撞能(collision energy，ce)进行mrm模式扫描检测。
42.按照确定的液相色谱条件和质谱条件分别对样本进行分析检测：随机挑选肺腺癌组和健康组中各20％的样本，采用增强离子扫描质谱(mim-epi)和飞行时间质谱(tof)结合多反应监测采集模式的代谢组学方法，整合本地标准品数据库进行肺腺癌血清代谢物数据库构建，用液相色谱-质谱联用代谢组学方法和构建的肺腺癌血清代谢物数据库对采集的血清样本进行分析，得到各血清样本的原始质谱数据。
43.(3)图谱峰面积预处理和积分
44.基于肺腺癌血清代谢物数据库，对样本的代谢物进行质谱定性定量分析。通过液相色谱能够分离不同分子量的代谢物。通过三重四极杆的多反应监测模式(mrm)筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度(cps)。用multiquant软件打开样本下机质谱文件，根据质荷比、保留时间对原始质谱数据进行预处理和校正，进行色谱峰的积分和校正工作，每个色谱峰的峰面积(area)代表对应物质的相对含量，设置s/n》5，保留
时间偏移不超过0.2min的峰保留；根据质谱峰强度计算峰面积得到代谢物相对含量信息，最后导出所有色谱峰面积积分数据保存，用于下一步统计分析。
45.(4)实验质量控制
46.通过对不同质控qc样本质谱检测分析的总离子流图(tic图)进行重叠展示分析，可以判断代谢物提取和检测的重复性，即技术重复。仪器的高稳定性为数据的重复性和可靠性提供了重要的保障。cv值即变异系数(coefficient of variation)，是原始数据标准差与原始数据平均数的比，可反映数据离散程度。使用经验累积分布函数(empirical cumulative distribution function,ecdf)可以分析小于参考值的物质cv出现的频率，qc样本的cv值较低的物质占比越高，代表实验数据越稳定：qc样本cv值小于0.5的物质占比高于85％，表明实验数据较稳定；qc样本cv值小于0.3的物质占比高于75％，表明实验数据非常稳定。同时监测检测过程中l-苯基丙氨酸内标cv值变化情况，内标cv值的变化小于20％，表明检测过程中仪器稳定性好。
47.(5)数据处理、分析及标志物筛选
48.将峰面积积分数据导入simca软件(version 14.1，sweden)进行多元统计分析。通过建立正交-偏最小二乘法判别(opls-da)模型，寻找健康人与肺腺癌患者之间贡献较大的代谢物(vip》1.0)。如图1中，黑色标记的点为vip》1.0的代谢物，浅灰色标记的点为vip《1.0的代谢物。然后通过t-test检验，设置p《0.05为差异显著性标准。最终筛选出vip》1.0且p《0.05的差异代谢物。
49.上述分析筛选的潜在肺腺癌代谢标志物，根据其保留时间，一级和二级质谱推测标志物的分子质量和分子式，并且与代谢物谱图数据库中的谱图信息进行比对，从而对代谢物进行定性鉴定。最终通过购买标准品，用标准品的分子量、色谱保留时间和相应的多级ms裂解谱比对，验证代谢标志物的结构。
50.利用二元逻辑回归向前逐步法筛选到10种差异代谢物能够诊断区分肺腺癌患者和健康人：d-半乳糖、高瓜氨酸、n6-乙酰-l-赖氨酸、4-羟基-l-脯氨酸、十六烷二酸、鸟嘌呤、谷氨酸、肌酸、丙氨酸、犬尿酸。代谢物具体信息见表3至表5：
51.表3 10种血清代谢标志物
52.53.表4肺腺癌患者vs健康人代谢物
54.中文名称差异倍数vipp valued-半乳糖1.312.062.71e-05高瓜氨酸1.251.855.06e-04n6-乙酰-l-赖氨酸0.871.883.03e-024-羟基-l-脯氨酸1.151.356.77e-03十六烷二酸0.841.413.88e-02鸟嘌呤0.921.222.11e-02谷氨酸0.861.054.50e-02肌酸1.181.163.04e-02丙氨酸1.021.084.63e-02犬尿酸0.941.043.48e-02
55.表5早期肺腺癌患者vs健康人代谢物
[0056][0057][0058]
采用受试者工作特征曲线(roc)分析代谢物对肺腺癌患者的诊断性能。结果表明，d-半乳糖、高瓜氨酸、n6-乙酰-l-赖氨酸、4-羟基-l-脯氨酸、十六烷二酸、鸟嘌呤、谷氨酸、肌酸、丙氨酸、犬尿酸这10个差异代谢物单个用于诊断区分肺腺癌能力较强，roc曲线下面积(auc)均大于0.7，具有临床诊断意义。
[0059]
这10个差异代谢物联合用于诊断时，auc进一步提高，10个联合起来诊断肺腺癌的auc值达到0.988，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为97.7％和94.0％；诊断早期肺腺癌的auc达0.995，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为98.2％和95.7％。具体数据统计见下表6至表9：
[0060]
表6单个代谢物用于肺腺癌诊断的auc值
[0061][0062][0063]
表7任意差异代谢物联合用于肺腺癌诊断的auc值
[0064]
联合个数auc灵敏度特异性任意二个≥0.752≥74.2％≥73.3％任意三个≥0.775≥76.4％≥75.0％任意四个≥0.794≥78.1％≥76.5％任意五个≥0.835≥81.9％≥80.2％任意六个≥0.877≥86.2％≥85.1％任意七个≥0.903≥88.9％≥87.2％任意八个≥0.934≥92.0％≥90.1％任意九个≥0.951≥93.6％≥92.3％
[0065]
示例代谢标志物组合如下：
[0066]
进一步优选代谢标志物组合为：d-半乳糖、高瓜氨酸、n6-乙酰-l-赖氨酸，构建诊断肺腺癌模型。这3个代谢物联合起来诊断肺腺癌的auc值达到0.925，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为90.8％和90.3％。
[0067]
进一步优选代谢标志物组合为：d-半乳糖、高瓜氨酸、n6-乙酰-l-赖氨酸、4-羟基-l-脯氨酸、十六烷二酸、鸟嘌呤构建诊断肺腺癌模型。这6个代谢物联合起来诊断肺部良恶性结节的auc值达到0.956，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为94.1％和93.3％。
[0068]
表8单个代谢物用于早期肺腺癌诊断的auc值
[0069][0070][0071]
表9任意差异代谢物联合用于早期肺腺癌诊断的auc值
[0072]
联合个数auc灵敏度特异性任意二个≥0.766≥75.6％≥74.8％任意三个≥0.790≥77.8％≥76.5％任意四个≥0.818≥80.3％≥79.5％任意五个≥0.841≥83.1％≥81.8％任意六个≥0.885≥86.2％≥85.1％任意七个≥0.916≥90.2％≥89.3％任意八个≥0.947≥93.0％≥92.1％任意九个≥0.971≥95.6％≥94.3％
[0073]
示例代谢标志物组合如下：
[0074]
进一步优选代谢标志物组合为：d-半乳糖、高瓜氨酸、n6-乙酰-l-赖氨酸，构建诊断早期肺腺癌模型。这3个代谢物联合起来诊断早期肺腺癌的auc值达到0.925，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为90.8％和90.3％。
[0075]
进一步优选代谢标志物组合为：d-半乳糖、高瓜氨酸、n6-乙酰-l-赖氨酸、4-羟基-l-脯氨酸、十六烷二酸、鸟嘌呤，构建诊断早期肺腺癌模型。这6个代谢物联合起来诊断早期肺腺癌的auc值达到0.956，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为94.1％和93.3％。
[0076]
实施例2：肺腺癌诊断标志物验证
[0077]
本研究对象共包含来自于2个独立医学中心的266例肺腺癌患者血清样本，其中包括118例早期肺腺癌患者；以及149例健康人血清样本，与特征筛选样本(150例)同一来源。
其中肺腺癌的诊断标准是经术后病理确诊的肺腺癌；健康人为体检后无肺部疾病的健康人群。所有肺腺癌患者和健康人样本均无其它任何恶性肿瘤病史，无其他全身性重大疾病，无长期用药的慢性病史。根据tnm分期，将i期和ii期肺腺癌患者定义为早期肺腺癌患者。
[0078]
采血时间均为清晨空腹状态。所有血清样本离心后置于-80℃冰箱内保存，研究时取出血清样本解冻后进行后续分析。
[0079]
本实施例与实施例1的检测和数据分析方法相同，检测和分析的差异代谢物为以下10种：d-半乳糖、高瓜氨酸、n6-乙酰-l-赖氨酸、4-羟基-l-脯氨酸、十六烷二酸、鸟嘌呤、谷氨酸、肌酸、丙氨酸、犬尿酸，用于肺腺癌诊断。这10个差异代谢物单个用于诊断区分肺腺癌患者和健康人，早期肺腺癌患者和健康人能力较强，roc曲线下面积(auc)均大于0.7，具有临床诊断意义；这10个差异代谢物联合用于诊断时，auc进一步提高，10个联合起来诊断肺腺癌的auc值达到0.955，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为91.5％和93.6％；诊断早期肺腺癌的auc达0.983，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为93.2％和96.0％。单个及任意2～9个代谢物联合用于诊断时的auc见表11至表14：
[0080]
表11单个代谢物用于肺腺癌诊断的auc值
[0081][0082][0083]
表12任意差异代谢物联合用于肺腺癌诊断的auc值
[0084]
联合个数auc灵敏度特异性任意二个≥0.756≥71.8％≥73.6％任意三个≥0.780≥74.0％≥76.1％任意四个≥0.797≥76.1％≥77.5％任意五个≥0.825≥78.9％≥80.4％
任意六个≥0.857≥81.2％≥83.1％任意七个≥0.888≥84.9％≥86.2％任意八个≥0.913≥88.0％≥90.3％任意九个≥0.931≥90.6％≥91.5％
[0085]
进一步优选代谢标志物d-半乳糖、高瓜氨酸、n6-乙酰-l-赖氨酸，构建诊断肺腺癌模型。这3个代谢物联合起来诊断肺腺癌的auc值达到0.913，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为88.7％和89.6％。
[0086]
进一步优选代谢标志物d-半乳糖、高瓜氨酸、n6-乙酰-l-赖氨酸、4-羟基-l-脯氨酸、十六烷二酸、鸟嘌呤构建诊断肺腺癌模型。这6个代谢物联合起来诊断肺部良恶性结节的auc值达到0.931，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为90.2％和91.4％。
[0087]
表13单个代谢物用于早期肺腺癌诊断的auc值
[0088]
编号中文名称auc灵敏度特异性1d-半乳糖0.85883.2％85.1％2高瓜氨酸0.84282.5％84.8％34-羟基-l-脯氨酸0.82982.2％83.9％4n6-乙酰-l-赖氨酸0.81579.5％82.2％5鸟嘌呤0.78875.3％79.5％6十六烷二酸0.76174.4％77.6％7谷氨酸0.74572.5％75.8％8丙氨酸0.72871.1％74.0％9犬尿酸0.71570.7％73.2％10肌酸0.70870.1％72.5％
[0089]
表14任意差异代谢物联合用于早期肺腺癌诊断的auc值
[0090]
联合个数auc灵敏度特异性任意二个≥0.759≥72.6％≥74.5％任意三个≥0.781≥74.8％≥76.1％任意四个≥0.803≥76.4％≥78.7％任意五个≥0.832≥79.1％≥80.8％任意六个≥0.875≥82.2％≥84.4％任意七个≥0.906≥85.2％≥87.3％任意八个≥0.937≥88.5％≥91.1％任意九个≥0.951≥91.7％≥93.5％
[0091]
进一步优选代谢标志物d-半乳糖、高瓜氨酸、n6-乙酰-l-赖氨酸，构建诊断早期肺腺癌模型。这3个代谢物联合起来诊断早期肺腺癌的auc值达到0.916，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为89.3％和90.1％。
[0092]
进一步优选代谢标志物d-半乳糖、高瓜氨酸、n6-乙酰-l-赖氨酸、
[0093]
4-羟基-l-脯氨酸、十六烷二酸、鸟嘌呤构建诊断早期肺腺癌模型。这6个代谢物联合起来诊断早期肺腺癌的auc值达到0.951，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为91.8％和93.2％。
[0094]
实施例3检测试剂盒
[0095]
本实施例提供一种检测试剂盒，包括：
[0096]
(1)代谢标志物的标准品：d-半乳糖、高瓜氨酸、n6-乙酰-l-赖氨酸、4-羟基-l-脯氨酸、十六烷二酸、鸟嘌呤、谷氨酸、肌酸、丙氨酸、犬尿酸，各标准品分别封装或标准品混合溶液封装。
[0097]
(2)提取溶剂：
[0098]
100％纯甲醇和50％乙腈水溶液用于样品制备；
[0099]
50％乙腈水溶液可以用作溶解标准品的溶剂。
[0100]
(3)内标物：：l-苯基丙氨酸。
[0101]
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。