一种达托霉素含量的检测方法与流程

1.本发明属于有机物分析技术领域，特别涉及一种达托霉素含量的检测方法。


背景技术：

2.达托霉素是玫瑰孢链霉菌发酵产物脂肽类化合物a21978c的n-癸酰基衍生物，含有13个氨基酸，其中10个氨基酸形成环十脂肽，另外3个氨基酸与癸酰基相连形成侧链，是继万古霉素之后第二代糖肽类抗生素药。现有达托霉素的含量标准检测方法为东南大学附属中大医院医学部与中国药科大学医学部联合发布的达托霉素血浆浓度uplc-ms/ms法测定，检测条件如下：
3.检测仪器：nexera x2液相色谱仪-api140000质谱联用仪；
4.色谱条件如下：
5.色谱柱：phenomenex kinetex xb-c18(50mm
×
2.1mm，1.7μm)；
6.流动相:含0.1％甲酸水溶液-乙腈(75:25)；
7.流速：0.4ml/mim；
8.检测波长：223nm；
9.柱温：45℃；
10.进样体积：3ul；
11.质谱条件如下：
12.离子检测方式：多重反应检测(mrm)；
13.离子化方式：气动辅助点喷雾离子化(esi)；
14.离子极性：正离子；
15.检测对象：达托霉素，(m+2h)2+m/z811.4
→
159.1；
16.内标(来曲唑)(m+h)+m/z286.2
→
217.2；
17.去簇电压：35v；
18.碰撞能量：25v；
19.入口电势：8v；
20.碰撞池出口电势：10v；
21.碰撞气压力：6pai(1pai＝6.895kpa)；
22.气帘气压力：30pai；
23.离子源气体1压力：70pai；
24.离子源气体2压力：70pai；
25.离子喷射电压力为4500v；
26.辅助加热温度：400℃。
27.该方法所用到的液相色谱质谱联用仪在有机物分析市场中属于高端仪器，仪器价格以及后期维护成本昂贵，对操作人员的专业素质要求相对较高，在医药企业中lc/ms还处于发展阶段，应用还无法普及。


技术实现要素：

28.为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种检测难度低，检测周期短的达托霉素含量的检测方法。
29.为了解决上述技术问题，本发明提供一种达托霉素含量的检测方法，包括如下步骤：
30.s1、按如下色谱条件获得达托霉素样品色谱峰峰面积的步骤：
31.固定相：c18色谱柱；
32.流动相a：磷酸二氢钾-乙腈溶液；
33.流动相b：乙腈；
34.流动相a和流动相b的开度比为65:35；
35.保留时间：6.0
±
0.5min；
36.进样量为5～50μl；
37.s2、将获得的达托霉素样品色谱峰峰面积代入公式y＝9.0319x+88.334中，获得达托霉素样品中达托霉素的浓度；
38.所述公式中，x指代达托霉素样品色谱峰峰面积；y指代达托霉素的浓度。
39.其中，所述达托霉素样品的浓度为8.341～1974μg/ml。
40.其中，所述磷酸二氢钾-乙腈溶液的ph＝2.5～3.2。
41.其中，所述c18色谱柱的柱温为23～30℃。
42.其中，所述c18色谱柱采用等度洗脱。
43.本发明的有益效果在于：本发明所提供的达托霉素含量的检测方法，可适配多种类型的色谱仪，在检测过程中只需将通过液相色谱测得的达托霉素样品的峰面积代入公式中，便可测得达托霉素样品中达托霉素含量，操作便捷，并且公式中达托霉素浓度与峰面积之间线性关系好，公式拟合优度r2≈1。同时，色谱检验周期短，一针运行时间仅10min，同时且每针仅消耗10ml流动相，检测成本低。
附图说明
44.图1所示为本发明在具体实施方式中达托霉素标准品的液相色谱图；
45.图2所示为本发明在具体实施方式中达托霉素浓度与色谱峰峰面积的线性图。
具体实施方式
46.为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
47.一种达托霉素含量的检测方法，包括如下步骤：
48.s1、按如下色谱条件获得达托霉素样品色谱峰峰面积的步骤：
49.固定相：c18色谱柱；
50.流动相a：磷酸二氢钾-乙腈溶液；
51.流动相b：乙腈；
52.流动相a和流动相b的开度比为65:35；
53.保留时间：6.0
±
0.5min；
54.进样量为5～50μl；
55.s2、将获得的达托霉素样品色谱峰峰面积代入公式y＝9.0319x+88.334中，获得达托霉素样品中达托霉素的浓度；
56.所述公式中，x指代达托霉素样品色谱峰峰面积；y指代达托霉素的浓度。
57.其中，所述公式由如下方法计算得到：
58.a、取达托霉素标准品(液相色谱图如图1所示，达托霉素含量为96.4％)25.61mg，在25ml容量瓶中定容，以获得987μg/ml达托霉素标准品溶液；
59.b、以1mg/ml为标准浓度，按s1方法分别配制浓度为20％、60％、100％、140％和200％的达托霉素样品，并分别进行液相色谱检测，统计各个达托霉素样品的色谱峰面积，统计结果如表1所示，并按表1绘制达托霉素浓度与峰面积的关系图，如图2所示。
60.表1
[0061][0062]
表1中，loq代表能被定量测定的最低量。
[0063]
根据图2获得达托霉素浓度与达托霉素样品色谱峰峰面积的回归方程y＝9.0319x+88.334，回归方程拟合优度r2≈1，r≥0.998，符合线性要求。
[0064]
需要说明的是，在未特别说明的情况下，本文中的各种试剂，如磷酸二氢钾、磷酸、乙腈等均为分析纯或纯度更高的优级纯，本文中的水指代去离子水或超纯水。
[0065]
进一步的，所述达托霉素样品的浓度为8.341～1974μg/ml。
[0066]
从图2可知，在8.341～1974μg/ml内，回归方程线性好，可用于预估达托霉素样品中达托霉素浓度。
[0067]
进一步的所述磷酸二氢钾-乙腈溶液的ph＝2.5～3.2。
[0068]
在一种实施方式中，取磷酸二氢钾3.2～3.6g溶液1000ml的水中，并用磷酸调节ph至3.0，过滤后继续加入300ml乙腈，超声脱气后获得磷酸二氢钾-乙腈溶液。
[0069]
进一步的，所述c18色谱柱的柱温为23～30℃。
[0070]
在此柱温下，达托霉素保留时间在6.0
±
0.5min，且各杂质与达托霉素的分离度好。
[0071]
进一步的，所述c18色谱柱采用等度洗脱。
[0072]
实施例1
[0073]
一种达托霉素含量的检测方法，包括如下步骤：
[0074]
s1、按如下色谱条件获得达托霉素样品色谱峰峰面积的步骤：
[0075]
检测仪器：agilent 1260infinityⅱ液相色谱仪；
[0076]
色谱柱：c18柱(bds hypersil c18，4.6
×
250mm，5μm)；
[0077]
流动相a:磷酸二氢钾-乙腈溶液(取磷酸二氢钾3.2-3.6g，加水1000ml溶解，用磷酸调节ph值为3.0，过滤并加入300ml乙腈，超声脱气)；
[0078]
流动相b：乙腈；
[0079]
流动相a与流动相b的开度比为＝65:35；
[0080]
流速：1.0ml/mim；
[0081]
运行时间：10min；
[0082]
洗脱方式：等度；
[0083]
检测波长：223nm；
[0084]
柱温：25℃；
[0085]
自动进样器温度：5℃；
[0086]
进样量：5μl；
[0087]
目标条件是在6.0
±
0.5分钟时保留达托霉素。
[0088]
s2、将获得的达托霉素样品色谱峰峰面积代入公式y＝9.0319x+88.334中，获得达托霉素样品中达托霉素的浓度；
[0089]
所述公式中，x指代达托霉素样品色谱峰峰面积；y指代达托霉素的浓度。
[0090]
实施例2
[0091]
一种达托霉素含量的检测方法，包括如下步骤：
[0092]
s1、按如下色谱条件获得达托霉素样品色谱峰峰面积的步骤：
[0093]
检测仪器：agilent 1260infinityⅱ液相色谱仪；
[0094]
色谱柱：c18柱(bds hypersil c18，4.6
×
250mm，5μm)；
[0095]
流动相a:磷酸二氢钾-乙腈溶液(取磷酸二氢钾3.2-3.6g，加水1000ml溶解，用磷酸调节ph值为3.0，过滤并加入300ml乙腈，超声脱气)；
[0096]
流动相b：乙腈；
[0097]
流动相a与流动相b的开度比为＝65:35；
[0098]
流速：1.0ml/mim；
[0099]
运行时间：10min；
[0100]
洗脱方式：等度；
[0101]
检测波长：223nm；
[0102]
柱温：30℃；
[0103]
自动进样器温度：5℃；
[0104]
进样量：50μl；
[0105]
目标条件是在6.0
±
0.5分钟时保留达托霉素。
[0106]
s2、将获得的达托霉素样品色谱峰峰面积代入公式y＝9.0319x+88.334中，获得达托霉素样品中达托霉素的浓度；
[0107]
所述公式中，x指代达托霉素样品色谱峰峰面积；y指代达托霉素的浓度。
[0108]
实施例3
[0109]
一种达托霉素含量的检测方法，包括如下步骤：
[0110]
s1、按如下色谱条件获得达托霉素样品色谱峰峰面积的步骤：
[0111]
检测仪器：agilent 1260infinityⅱ液相色谱仪；
[0112]
色谱柱：c18柱(bds hypersil c18，4.6
×
250mm，5μm)；
[0113]
流动相a:磷酸二氢钾-乙腈溶液(取磷酸二氢钾3.2-3.6g，加水1000ml溶解，用磷酸调节ph值为3.0，过滤并加入300ml乙腈，超声脱气)；
[0114]
流动相b：乙腈；
[0115]
流动相a与流动相b的开度比为＝65:35；
[0116]
流速：1.0ml/mim；
[0117]
运行时间：10min；
[0118]
洗脱方式：等度；
[0119]
检测波长：223nm；
[0120]
柱温：23℃；
[0121]
自动进样器温度：5℃；
[0122]
进样量：5μl；
[0123]
目标条件是在6.0
±
0.5分钟时保留达托霉素；
[0124]
s2、将获得的达托霉素样品色谱峰峰面积代入公式y＝9.0319x+88.334中，获得达托霉素样品中达托霉素的浓度；
[0125]
所述公式中，x指代达托霉素样品色谱峰峰面积；y指代达托霉素的浓度。
[0126]
检测例
[0127]
重复性实验。按前述方法制备达托霉素标准品溶液，按实施例1所提供的达托霉素含量的检测方法分别进行6次液相色谱检测，并统计达托霉素色谱峰峰面积，结果如表2所示。
[0128]
表2
[0129][0130]
从表2可以看出，rsd(相对标准偏差)为0.24％小于2.0％，表明本发明所提供的达托霉素含量的检测方法满足重复性要求。
[0131]
综上所述，本发明所提供的达托霉素含量的检测方法，只需将通过液相色谱测得
的达托霉素样品的峰面积代入公式中，便可测得达托霉素样品中达托霉素含量，操作便捷，并且公式中达托霉素浓度与峰面积之间线性关系好，公式拟合优度r2≈1。同时，色谱检验周期短，一针运行时间仅10min，同时且每针仅消耗10ml流动相，检测成本低。
[0132]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。