一种磁微粒化学发光检测试剂盒及其检测方法与流程

1.本发明属于医学检测领域，主要涉及一种磁微粒化学发光检测试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.化学发光免疫测定(chemiluminescence immunoassay,cia)根据发光物质的不同，可以分为直接化学发光免疫分析和化学发光酶免疫分析，以及电化学发光三大类型。其中直接化学发光免疫分析过程中不需要酶的催化作用，直接参与发光反应。
3.直接发光免疫分析过程使用的化学发光剂的化学结构上有发光基团，所以该过程不需要酶的催化作用，直接进行发光反应。其中，化学发光剂直接标记检测抗体，与待测样本、磁珠包被的捕获抗体反应，通过磁场把“磁珠包被的捕获抗体-待测样本-标记的检测抗体”形成的复合物分离出来，然后向复合物中加入发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的检测进行定量或定性检测。最常使用的化学发光剂是吖啶酯。
4.吖啶酯是吖啶盐的一个总称，指的是一类用作化学发光标记物的化学物质，吖啶酯有不同的系列，通常这类物质本底发光少，在反应中能用于检测低浓度或微量浓度的样品，是一类发光效率很高的发光剂，具有发光迅速、发光值高、检测灵敏等特点，所以受到免疫检测领域的广泛认可，正越来越多的被应用于免疫检测试剂中。
5.但是，吖啶酯在化学发光免疫检测中存在一个应用的难点，该难点是吖啶酯存在一定的非特异性吸附，这种非特异性吸附主要来源于吖啶酯标记检测抗体溶液中未与检测抗体结合的游离吖啶酯，游离的吖啶酯会吸附在磁珠或者反应内壁上，会使本底升高，检测准确度降低。
6.目前还没有能够降低吖啶酯非特异吸附的方法，本领域迫切需要开发一种降低吖啶酯非特异性吸附的方法。


技术实现要素：

7.当待测样本与包被捕获抗体的磁珠工作液、标记有吖啶酯的检测抗体工作液一起孵育时，形成了“包被捕获抗体的磁珠-待测样本-标记有吖啶酯的检测抗体”这样的复合物，但由于在标记了吖啶酯的检测抗体的工作液中，存在未与检测抗体相结合的游离吖啶酯，将吖啶酯抗体加入上述复合物中后，吖啶酯抗体可以与磁珠或者容器内壁竞争性结合游离吖啶酯，降低了游离吖啶酯与磁珠或者容器内壁的非特异性结合的发生率，从而降低了本底，提升了检测过程中的灵敏度，且吖啶酯抗体的加入并不影响试剂的线性性能。
8.本发明提供了一种磁微粒化学发光检测试剂盒，包括吖啶酯标记抗体、捕获抗体、磁珠，其特征在于，还包括吖啶酯抗体。
9.在一些实施方案中，所述吖啶酯标记抗体是吖啶酯标记的pct检测抗体，捕获抗体是pct捕获抗体。
10.本发明还提供了一种磁微粒化学发光检测方法，包括在样本检测过程中，在反应
杯中加待测样本，并向反应杯中加入捕获抗体、磁珠、吖啶酯抗体、吖啶酯标记抗体。
11.在一些实施方案中，所述捕获抗体是包被生物素标记pct捕获抗体，所述的磁珠是链霉亲和素磁珠工作液，所述的吖啶酯标记抗体是吖啶酯标记pct检测抗体。
12.在一些实施方案中，所述吖啶酯标记抗体中吖啶酯的结构如下：
[0013][0014]
在一些实施方案中，所述吖啶酯抗体选自单克隆抗体或多克隆抗体，优选单克隆抗体。
[0015]
在一些实施方案中，所述吖啶酯抗体为单克隆抗体，其vl cdr1、cdr2和cdr3分别具有seq id no:1-3的氨基酸序列，且其vh cdr1、cdr2和cdr3分别具有seq id no:4-6的氨基酸序列。
[0016]
在一些实施方案中，所述吖啶酯抗体与用于标记的吖啶酯的摩尔比选自0.1～5:1，优选0.5～4:1，更优选1～3:1，更优选1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1，最优选2:1。本发明还提供了一种吖啶酯抗体，其特征在于，其vl cdr1、cdr2和cdr3分别具有seq id no:1-3的氨基酸序列，且其vh cdr1、cdr2和cdr3分别具有seq id no:4-6的氨基酸序列。
[0017]
本发明还提供了吖啶酯抗体在制备磁微粒化学发光检测试剂盒或在磁微粒化学发光检测方法中的用途。
[0018]
在一些实施方案中，所述试剂盒中还包括缓冲液。在一些实施方案中，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液(pbs)、2-吗啉乙磺酸缓冲液(mes)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(tris-hcl)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液缓冲液(hepes)。在一些实施方案中，所述缓冲液的浓度选自0.01mol/l-0.1mol/l，优选自0.01mol/l～0.05mol/l，更优选自0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.04mol/l、0.05mol/l。在一些实施方案中，所述缓冲液的ph选自6.0-7.5，更优选自7.0-7.5，更优选自7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5。在一些实施方案中，所述缓冲液的ph为7.4。
[0019]
在一些实施方案中，所述吖啶酯抗体是单克隆抗体，其vl cdr1、cdr2和cdr3分别具有seq id no:1-3的氨基酸序列，且其vh cdr1、cdr2和cdr3分别具有seq id no:4-6的氨基酸序列；所述缓冲液为pbs缓冲液，其浓度为0.01mol/l，ph为7.4。
[0020]
定义：
[0021]
本发明使用的术语“捕获抗体”是指能够从待测物中特异性识别并结合待测抗原的抗体。术语“检测抗体”是指另一种能够特异性识别待测抗原的抗体，其与捕获抗体分别特异性识别同一待测抗原分子上的不同抗原表位，且检测抗体标记了吖啶酯，从而实现待测抗原的定量或定性的检测。
[0022]
本发明使用的术语“用于标记的吖啶酯”是指用于标记检测抗体的吖啶酯，其包括游离的吖啶酯、与检测抗体结合的吖啶酯。“游离的吖啶酯”是指未与检测抗体结合的吖啶
酯。
[0023]
本发明使用的术语“容器内壁”是指与化学发光免疫分析仪配套使用的反应杯的内壁。“反应杯”是指与化学发光免疫分析仪配套使用的反应容器。
[0024]
本发明使用的术语“proteina亲和层析柱”是指一种亲和层析柱，proteina亲和层析柱已成为应用广泛的纯化抗体的亲和柱，可从腹水、血清和细胞培养上清或细胞抽提物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体fc片段的基因工程重组蛋白。
[0025]
有益效果：
[0026]
1：有效降低吖啶酯非特异吸附信号值60％以上；
[0027]
2：提升了化学发光反应灵敏度并具有实用性。
具体实施方式
[0028]
材料：
[0029]
nacl、na2hpo4·
12h2o、nahpo4·
2h2o、盐酸(均来自中国国药集团)
[0030]
牛血清蛋白(来自merck，货号是a1933-25g)
[0031]
载体蛋白钥孔血蓝蛋白(klh)(来自merck，货号f5881-6x)
[0032]
弗氏完全佐剂(来自sigma，货号f5881-6x)
[0033]
底物液(thermofisher scientific，货号34021)
[0034]
骨髓瘤细胞(来自普诺赛，货号cl-0217)
[0035]
吖啶酯(来自赫利森，货号hs-12000002)
[0036]
链霉亲和素磁珠试剂盒(来自thermofisher scientific，货号88817)
[0037]
生物素偶联试剂盒(来自thermofisher scientific，货号21425)
[0038]
吖啶酯化学发光标记试剂盒(来自赫利森，货号hs-12000002)
[0039]
pct捕获抗体(来自诺唯赞，货号rm3321)
[0040]
pct检测抗体(来自诺唯赞，货号rm3322)
[0041]
酸碱激发液：购买下述化学发光免疫分析仪随赠获得
[0042]
样本:降钙素原(pct)(来自含有pct的血浆样本)
[0043]
仪器：
[0044]
多功能酶标仪(来自tecan)
[0045]
化学发光免疫分析仪(来自科斯迈，仪器型号为smart500)
[0046]
实施例1：获取吖啶酯抗体
[0047]
实施例1.1：吖啶酯人工抗原制备
[0048]
(1)配置0.01mol/l的pbs溶液：取一个洁净的烧杯，向其中加入500ml的纯水，再向其中加入8.78g的nacl、5.8g的na2hpo4·
12h2o及0.59g的nahpo4·
2h2o，用适量的盐酸调节ph至7.4，然后定容至1000ml。
[0049]
(2)取步骤(1)中的pbs溶液200μl进试管，再向试管中依次顺序加入200μg载体蛋白钥孔血蓝蛋白(klh)、100μm吖啶酯，混匀，室温反应1h，经过50kd超滤管纯化5次，将纯化物收集到1.5ml的ep管中，吖啶酯-载体蛋白钥孔血蓝蛋白偶联完成，并储存在4℃条件下待用。
[0050]
实施例1.2：用制备的吖啶酯-载体蛋白钥孔血蓝蛋白偶联物免疫小鼠
[0051]
(1)用制备的吖啶酯-载体蛋白钥孔血蓝蛋白偶联物与弗氏完全佐剂等量混合，漩涡震荡30min使其完全乳化。通过皮下多点注射的方式，按照80μg/只的剂量将乳化物注射进健康的balb/c小鼠，即完成初次免疫。
[0052]
(2)一个月后，将吖啶酯-载体蛋白钥孔血蓝蛋白偶联物与弗氏不完全佐剂等量混合混合，漩涡震荡30min使其完全乳化，通过皮下多点注射的方式，按照50μg/只的剂量将乳化物注射进健康的balb/c小鼠。即完成二次免疫。
[0053]
(3)二次免疫后第三周进行第三次加强免疫，加强免疫的步骤同第二次免疫。
[0054]
实施例1.3:细胞融合与筛选
[0055]
无菌取小鼠脾脏，提取脾细胞，然后采用电融合方法与骨髓瘤细胞融合。采用hat/ht选择培养基筛选出杂交瘤细胞进行培养。培养后取细胞上清，然后采用间接elisa法筛选阳性细胞株，经过多次亚克隆筛选培养，获得可稳定分泌吖啶酯抗体的杂交瘤细胞株。
[0056]
实施例1.4:抗体制备纯化
[0057]
采用体内诱生法将实施例1.3中获得的杂交瘤细胞株注射到小鼠体内制备腹水，采集腹水后用间接elisa法测定效价。用proteina抗体纯化柱进行抗体纯化，获得吖啶酯抗体，并通过多肽序列测定方法测定单抗序列，经鉴定，吖啶酯抗体的轻链与重链cdr区序列如下表所示：
[0058]
表1吖啶酯抗体的轻链与重链cdr
[0059]
cdr对应的seq id no.序列vl cdr11eniytnvl cdr22gatvl cdr33qhfwgtpftvh cdr14gysitsdyavh cdr25isysgrtvh cdr36asawdy
[0060]
实施例2：配置链霉亲和素磁珠工作液
[0061]
按照链霉亲和素磁珠试剂盒的说明书操作，最终获得1mg/ml的链霉亲和素磁珠工作液，并储存于4℃冰箱待用。
[0062]
实施例3：配置生物素标记的pct捕获抗体工作液
[0063]
按照生物素偶联试剂盒的说明书操作，最终获得0.3ug/ml的标记了生物素的pct捕获抗体，并储存于4℃冰箱待用。
[0064]
实施例4：配置吖啶酯标记pct检测抗体工作液
[0065]
(1)按照吖啶酯化学发光标记试剂盒说明书操作，对pct检测抗体进行吖啶酯标记，其中用于标记检测抗体的吖啶酯浓度是0.5mmol/l，使用10μl的吖啶酯。
[0066]
(2)标记完成后，用酶标仪确定标记吖啶酯的pct检测抗体的浓度，然后用吖啶酯化学发光标记试剂盒中的缓冲液将标记了吖啶酯的检测抗体稀释至0.3ug/ml，储存于4℃冰箱待用。
[0067]
实施例5：检测样本
[0068]
(1)分别按照吖啶酯抗体与用于标记的吖啶酯的摩尔比为0.5∶1、1∶1、2∶1、4∶1进行实验。
[0069]
(2)在反应杯中先加待测样本50μl，按照以下顺序向反应杯中加入包被生物素标记pct捕获抗体50μl、链霉亲和素磁珠工作液50μl、吖啶酯抗体、吖啶酯标记pct检测抗体工作液50μl，37℃孵育10min，清洗。
[0070]
(3)将反应杯置于化学发光免疫分析仪上进行测试，测试波长是430nm。
[0071]
检测结果如表2、表3、表4、表5(分别对应吖啶酯抗体与用于标记的吖啶酯的摩尔比为0.5∶1、1∶1、2∶1、4∶1)所示。
[0072]
表2(0.5∶1)：
[0073] 对照组信号值实验组信号值相对变幅s050004901-2.0％s12187121035-3.8％s25894155981-5.0％s3286794281561-1.8％s4128694113054811.4％
[0074]
表3(1∶1)：
[0075] 对照组信号值实验组信号值相对变幅s050003038-39.2％s12187120632-5.7％s25894155678-5.5％s3286794279675-2.5％s412869411263872-1.8％
[0076]
表4(2∶1)：
[0077] 对照组信号值实验组信号值相对变幅s050001500-70.0％s12187120056-8.3％s25894156816-3.6％s3286794279613-2.5％s4128694113248722.9％
[0078]
表5(4∶1)：
[0079] 对照组信号值实验组信号值相对变幅s050001602-68.0％s12187118620-14.9％s25894148950-17.0％s3286794214586-25.2％s41286941996542-22.6％
[0080]
对照组表示未添加吖啶酯抗体，实验组表示添加了相应摩尔量的吖啶酯抗体。s0表示未添加pct抗原，s1表示添加0.5ng/ml的pct抗原，s2表示添加2ng/ml的pct抗原，s3表示添加10ng/ml的pct抗原，s4表示添加50ng/ml的pct抗原。
[0081]
结果分析
[0082]
在s0的条件下，此时产生的信号为非特异性吸附，实验组较对照组的非特异性吸附降低幅度通过表格中的“相对变幅”来体现。吖啶酯抗体与用于标记的吖啶酯的摩尔比分别为0.5:1、1:1、2:1、4:1时，非特异性吸附分别降低了2.0％、39.2％、70.0％、68.0％。
[0083]
同时，s1(或s2或s3或s4)/s0的值越大，灵敏度越好。当吖啶酯抗体与吖啶酯摩尔比例是0.5:1时，对照组的s1/s0＝4.37，实验组的s1/s0＝4.29；当吖啶酯抗体与用于标记的吖啶酯摩尔比例是1:1时，对照组的s1/s0＝4.37，实验组的s1/s0＝6.79；当吖啶酯抗体与用于标记的吖啶酯摩尔比是2:1时，对照组的s1/s0＝4.37，实验组的s1/s0＝13.37；当吖啶酯抗体与吖啶酯摩尔比是4:1时，对照组的s1/s0＝4.37，实验组的s1/s0＝11.62。可以从结果中看出，当摩尔比例为2:1的时候，实验组与对照组的灵敏度倍差最大，说明灵敏度得到了显著的提高。当吖啶酯抗体：用于标记的吖啶酯的摩尔比是0.5:1、1:1、2:1时，s1-s4对应的“相对变幅”均在10％以内，说明吖啶酯抗体在化学发光法检测抗原的实验中不会影响试剂的线性等性能，具有很好的实用性，但是当吖啶酯抗体：用于标记的吖啶酯的摩尔比例为4:1时，s1-s4对应的“相对变幅”均在10％以外，说明在此比例下，吖啶酯抗体在化学发光法检测抗原的实验中会影响试剂的线性功能。