快速检测肝素的试剂及检测方法

1.本发明涉及识别结合和用于光学检测肝素的分子检测技术领域，具体涉及一种快速检测肝素的试剂及检测方法。


背景技术：

2.肝素属于生物相关的粘多糖，在调节血液凝固、细胞生长和免疫反应中起着关键作用 (soc. rev. 2013, 42, 9184
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9195; angew. chem., int. ed. 2002, 41, 390
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412; carbohydrate biosensors. chem. rev. 2004, 104, 5987
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6016; nat. prod. rep. 2002, 19, 312
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331)。它可以通过静电相互作用与抗凝血酶、成纤维细胞生长因子、细胞外超氧化物歧化酶、脂蛋白等多种蛋白质相互作用，从而调节不同的功能生理和病理过程，如细胞生长分化、炎症、凝血、脂质转运和代谢等 (angew. chem. int. ed., 2002, 41, 390)。此外，肝素作为为数不多的碳水化合物药物之一，已被临床用作抗凝剂。然而，肝素过量会导致出血和肝素诱导的血小板减少。 因此，在肝素抗凝治疗中，监测人体内的肝素水平是非常重要的。此外，通过排泄，这些药物可以到达地下水，并可能对微生物种群产生毒性影响，进而造成公共健康危害。因此，迫切需要开发一种简便的检测生物液体中肝素的方法。
3.用于肝素检测的传统方法包括高效液相色谱法(hplc)、质谱法(ms)、核磁、比色法、荧光等方法( chem. commun., 2017,53, 1486-1489; sensors & actuators: b. chemical 301 (2019) 127089; polymer 53 (2012) 490
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494; anal. chem. 86 (2014) 6580
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6586; chembiochem 8 (2007) 391
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394 )。荧光法是一种易操作、低成本、灵敏度高、样品无需复杂预处理的方法。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种快速检测肝素的试剂及检测方法，将色酮基引入到氨基化石墨烯量子点上，制备了一种色酮基席夫碱，利用色酮基席夫碱醇水溶液与一定量的米托蒽醌或阿霉素混合，合成了一种色酮基席夫碱/米托蒽醌或阿霉素复合物，该复合物合成简单，又具有对肝素的选择性。采用此复合物使用荧光法可以实现快速检测水中肝素，方便易行，灵敏度高。
5.本发明采用的技术解决方案是：一种快速检测肝素的试剂，所述的试剂包括色酮基席夫碱/米托蒽醌复合物或的色酮基席夫碱/阿霉素复合物溶液，所述的色酮基席夫碱/米托蒽醌复合物或的色酮基席夫碱/阿霉素复合物通过以下步骤制备：首先将浓度为0.1 mg/ml-20 mg/ml的石墨烯量子点水溶液置于三颈瓶中，溶液匀速搅拌，加入一定量的催化剂后逐滴加入色酮基化合物的醇溶液，在45-80℃加热2h-24h，制得产物用分子量为1000da的透析袋于醇水混合溶液中透析三天，得到色酮基席夫碱,将色酮基席夫碱与米托蒽醌或阿霉素混合，得到所述的色酮基席夫碱/米托蒽醌复合物或的色酮基席夫碱/阿霉素复合物。
6.所述的石墨烯量子点为氨基化石墨烯量子点。
7.所述的醇溶液为甲醇或乙醇。
8.所述的催化剂为三乙胺或冰醋酸。
9.所述的醇水溶剂中水和醇的体积比在10:1-1:10。
10.所述的醇水溶剂体积与催化剂的体积比为1:1-100:1。
11.所述的氨基化石墨烯量子点与色酮基化合物的质量比为5:1-1:5。
12.所述的快速检测肝素的试剂中色酮基席夫碱/米托蒽醌复合物或的色酮基席夫碱/阿霉素复合物溶液的浓度为5 mg/l-500 mg/l。
13.所述的色酮基席夫碱与米托蒽醌的质量比为大于0，小于等于1:4，所述的色酮基席夫碱与阿霉素的质量比为大于0，小于等于5:19。
14.一种快速检测肝素的方法，包括以下步骤：取所述的快速检测肝素的试剂，加入10-7 m~10-3 m的待测物质，采用荧光光度法进行测试，测试溶液在em 409 nm
的荧光光谱。
15.本发明的原理是：(1) 采用的是氨基化石墨烯量子点纳米材料，表面具有大量氨基基团，能通过化学键键合具有酮基的化合物；(2) 其荧光强度在一定浓度范围内呈浓度依赖性；(3) 滴加米托蒽醌或阿霉素到溶液中，色酮基席夫碱的荧光强度明显降低；（4）滴加肝素后，色酮基席夫碱的荧光强度上升。
16.本发明的有益效果是：本发明提供了一种快速检测肝素的试剂及检测方法，将色酮基引入到氨基化石墨烯量子点上，制备了一种色酮基席夫碱，利用色酮基席夫碱醇水溶液与一定量的米托蒽醌或阿霉素混合，合成了一种色酮基席夫碱/米托蒽醌或阿霉素复合物，该复合物合成简单，又具有对肝素的选择性。采用此复合物使用荧光法可以实现快速检测水中肝素，方便易行，灵敏度高，可以在常温水溶液环境中快速检测肝素，该方法工艺简单、操作方便；具有实用性强及广阔的应用前景。
附图说明
17.图1：实施例1为色酮基席夫碱/米托蒽醌复合物对不同浓度的肝素的荧光响应。
18.图2：实施例2为色酮基席夫碱/米托蒽醌复合物在4倍干扰物质浓度存在下对肝素的荧光响应。图中每组中，左边柱为干扰物质的响应，右边柱为在干扰物质存在下加入肝素后的响应。（1，heparin； 2 ，cysteine； 3， galactose； 4， alanine； 5， ribose； 6， methionine； 7， arginine ；8， leucine； 9， maltose ；10， urea； 11， proline； 12， glucose ；13， lactose； 14， melamine； 15， threonine； 16， valine； 17， isoleucine； 18， sucrose； 19， histidine）图3：氨基化石墨烯量子点及色酮基席夫碱的xps表征；(a) 氨基化石墨烯量子点的c1s分峰；(b) 氨基化石墨烯量子点的n1s分峰；(c) 色酮基席夫碱的c1s分峰；(d) 色酮基席夫碱的n1s分峰。
具体实施方式
19.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获的的所有其
他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.实施例1（对肝素的选择性实验）荧光实验中将一种色酮基席夫碱/米托蒽醌复合物配成1.0 mg/ml的储备液，生物分子选用肝素、氨基葡萄糖、半胱氨酸、半乳糖、丙氨酸、核糖、蛋氨酸、精氨酸、亮氨酸、麦芽糖、尿素、脯氨酸、葡萄糖、乳糖、三聚氰胺、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蔗糖、组氨酸等物质，所有实验用的溶液均为新配置，并立即实验。在298 nm处激发，在409 nm处发射。取一定浓度的色酮基席夫碱/米托蒽醌2.5 ml，分别加入10-5 m 的待测物质。测试其荧光光谱。结果见附图1。
21.实施例2 干扰物质共存检测肝素的实验荧光实验中色酮基席夫碱/米托蒽醌复合物配成浓度为0.025 mg/ml的醇水溶液。肝素浓度为5.0*10-3 m的标准储备液。作为干扰的生物分子选用肝素、氨基葡萄糖、半胱氨酸、半乳糖、丙氨酸、核糖、蛋氨酸、精氨酸、亮氨酸、麦芽糖、尿素、脯氨酸、葡萄糖、乳糖、三聚氰胺、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蔗糖、组氨酸等物质所有实验用的溶液均为新配置，并立即实验。干扰物质实验中，先在0.025 mg/ml的色酮基席夫碱/米托蒽醌复合物中加入4倍浓度的干扰物质，测其荧光，再加入肝素, 测其荧光变化。结果见附图2。
22.各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
23.以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。