用于提取嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶以及治疗二肽基肽酶1介导的病症的方法与流程

背景技术：

1、嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶(nsp)位于嗜中性粒细胞的嗜天青颗粒内。nsp具有宽底物特异性，对嗜中性粒细胞发挥作用很重要，在针对细菌感染的免疫保护以及对炎性病症的调节方面发挥着关键作用。已知的nsp包括嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(ne)、蛋白酶3(pr3)、组织蛋白酶g(catg)以及嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶4(nsp4)。典型的nsp(即ne、pr3和catg)在嗜中性粒细胞分化的早幼粒细胞阶段合成为无活性酶原，其由半胱氨酸蛋白酶二肽基肽酶1(dpp1；还称为组织蛋白酶c)通过在氨基末端处的蛋白水解加工激活。近来发现，nsp4与ne和pr3具有39％的同一性，并且在嗜中性粒细胞和骨髓前体细胞中展现出限制的表达。类似于ne、pr3和catg，nsp4由dpp1通过在氨基末端处的蛋白水解加工转化成活性蛋白酶。参见pham等人,nature reviews immunology,6:541–550(2006)；perera等人,pnas,109:6229-6234(2012)，出于所有目的，各自通过引用以其整体并入本文。

2、因为nsp牵涉于各种疾病途径中，有效测量来自血液样品的活性nsp的浓度的能力可以帮助深入了解疾病进展并且充当生物标记物。本发明满足这种和其他需要。

技术实现思路

1、在一方面，本技术涉及一种从获自受试者的包含白细胞(wbc)的样品中提取一种或多种嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶(nsp)的方法。所述方法包括：

2、使所述样品与包含至少0.01％(v/v)的第一非离子表面活性剂的第一水性介质接触，以获得包含第一nsp提取物的第一细胞裂解物以及第一wbc残余物，其中所述第一nsp提取物包含所述一种或多种nsp，

3、将所述第一细胞裂解物与所述第一wbc残余物分离，以提供包含所述第一nsp提取物的第一分离的细胞裂解物，

4、使所述第一wbc残余物与包含至少0.01％(v/v)的第二非离子表面活性剂的第二水性介质接触，以获得包含第二nsp提取物的第二细胞裂解物以及第二wbc残余物，其中所述第二nsp提取物包含所述一种或多种nsp，以及

5、将所述第二细胞裂解物与所述第二wbc残余物分离，以提供包含所述第二nsp提取物的第二分离的细胞裂解物。

6、在所述方法的一些实施方案中，进行了另外的重复裂解步骤。在一个实施方案中，所述方法还包括使所述第二wbc残余物与包含至少0.01％(v/v)的第三非离子表面活性剂的第三水性介质接触，以获得包含第三nsp提取物的第三细胞裂解物以及第三wbc残余物，其中所述第三nsp提取物包含所述一种或多种nsp；以及将所述第三细胞裂解物与所述第三wbc残余物分离，以提供包含所述第三nsp提取物的第三分离的细胞裂解物。在另外的实施方案中，所述方法包括使所述第三wbc残余物与包含至少0.01％(v/v)的第四非离子表面活性剂的第四水性介质接触，以获得包含第四nsp提取物的第四细胞裂解物以及第四wbc残余物，其中所述第四nsp提取物包含所述一种或多种nsp；以及将所述第四细胞裂解物与所述第四wbc残余物分离，以提供包含所述第四nsp提取物的第四分离的细胞裂解物。在甚至另外的实施方案中，所述方法包括使所述第四wbc残余物与包含至少0.01％(v/v)的第五非离子表面活性剂的第五水性介质接触，以获得包含第五nsp提取物的第五细胞裂解物以及第五wbc残余物，其中所述第五nsp提取物包含所述一种或多种nsp；以及将所述第五细胞裂解物与所述第五wbc残余物分离，以提供包含所述第五nsp提取物的第五分离的细胞裂解物。在再另外的实施方案中，所述方法包括使所述第五wbc残余物与包含至少0.01％(v/v)的第六非离子表面活性剂的第六水性介质接触，以获得包含第六nsp提取物的第六细胞裂解物以及第六wbc残余物，其中所述第六nsp提取物包含所述一种或多种nsp；以及将所述第六细胞裂解物与所述第六wbc残余物分离，以提供包含所述第六nsp提取物的第六分离的细胞裂解物。

7、在所述方法的一个实施方案中，存在于任何一种所述水性介质中的非离子表面活性剂是非离子聚氧乙烯表面活性剂，例如，辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、2-[4-(2,4,4-三甲基戊-2-基)苯氧基]乙醇、聚氧乙烯(9)壬基苯基醚(支链)或聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯。在另外的实施方案中，存在于任何一种所述水性介质中的表面活性剂是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。

8、在其中进行两个或更多个重复裂解步骤的方法的一个实施方案中，存在于针对每个裂解步骤使用的水性介质中的非离子表面活性剂是相同的。在另一个实施方案中，存在于至少两种使用的水性介质中的非离子表面活性剂是不同的。在一个实施方案中，无论存在于水性介质中的表面活性剂是何身份，存在于针对每个裂解步骤使用的水性介质中的非离子表面活性剂的浓度是相同的。在另一个实施方案中，在至少两种使用的水性介质中的非离子表面活性剂的浓度是不同的。

9、在所述方法的一个实施方案中，使用的所有水性介质(例如，所有所述第一水性介质、所述第二水性介质、所述第三水性介质等，取决于进行的重复裂解步骤的数量)是相同的水性介质。在另一个实施方案中，至少两种水性介质是不同的。

10、在所述方法的一个实施方案中，所述第一、第二、第三、第四、第五或第六水性介质或其组合包含至少0.02％(v/v)的对应的第一、第二、第三、第四、第五或第六非离子表面活性剂。在另一个实施方案中，所述第一、第二、第三、第四、第五或第六水性介质或其组合包含至少0.05％(v/v)的对应的第一、第二、第三、第四、第五或第六非离子表面活性剂。在另一个实施方案中，所述第一、第二、第三、第四、第五或第六水性介质或其组合包含约0.02％(v/v)至约1.5％(v/v)的对应的第一、第二、第三、第四、第五或第六非离子表面活性剂。在另一个实施方案中，所述第一、第二、第三、第四、第五或第六水性介质或其组合包含约0.03％(v/v)至约1％(v/v)的对应的第一、第二、第三、第四、第五或第六非离子表面活性剂。在另一个实施方案中，所述第一、第二、第三、第四、第五或第六水性介质或其组合包含约0.04％(v/v)至约0.8％(v/v)的对应的第一、第二、第三、第四、第五或第六非离子表面活性剂。在另一个实施方案中，所述第一、第二、第三、第四、第五或第六水性介质或其组合包含约0.05％(v/v)至约0.6％(v/v)的对应的第一、第二、第三、第四、第五或第六非离子表面活性剂。在另一个实施方案中，所述第一、第二、第三、第四、第五或第六水性介质或其组合包含约0.05％(v/v)的对应的第一、第二、第三、第四、第五或第六非离子表面活性剂。在另外的实施方案中，所述对应的第一、第二、第三、第四、第五或第六非离子表面活性剂或其组合是非离子聚氧乙烯表面活性剂。在另外的实施方案中，所述非离子聚氧乙烯表面活性剂是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。在另外的实施方案中，所述第一、第二、第三、第四、第五或第六水性介质或其组合包含约0.05％(v/v)的辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、约0.75m nacl以及约50mm hepes。

11、在所述方法的一个实施方案中，使包含wbc的样品与所述第一水性介质在约0℃至约10℃的温度下接触。在另一个实施方案中，使wbc残余物(例如，第一、第二、第三、第四或第五wbc残余物)与相应的水性介质在约0℃至约10℃的温度下接触。

12、在所述方法的一个实施方案中，使包含wbc的样品与所述第一水性介质接触包括使样品与所述第一水性介质混合。在另外的实施方案中，使所述样品与所述第一水性介质混合包括将所述样品与所述第一水性介质一起进行搅拌。在另一个实施方案中，使wbc残余物(例如，第一、第二、第三、第四或第五wbc残余物)与相应的水性介质接触包括使所述wbc残余物与相应的水性介质混合。在另外的实施方案中，使所述wbc残余物与所述相应的水性介质混合包括将所述wbc残余物与所述相应的水性介质一起进行搅拌。以上所述的搅拌可以通过吸移、涡旋、振荡、搅动或使用桨(如美国药典(usp)装置2)进行。

13、在所述方法的一个实施方案中，使所述样品与第一水性介质接触包括向所述样品中添加水性洗涤溶液以形成所述水性洗涤溶液与所述样品的混合物、将所述水性洗涤溶液与所述样品的混合物进行离心以提供上清液(即洗涤级分)和包含wbc的沉淀物、收集上清液以及使所述沉淀物与所述第一水性介质接触。在一个实施方案中，所述水性洗涤溶液是磷酸盐缓冲盐水溶液。在另一个实施方案中，所述水性洗涤溶液是包含约0.9％nacl的盐水溶液。在另一个实施方案中，所述水性洗涤溶液包含基于tris的碱性缓冲液和nacl。在另外的实施方案中，所述水性洗涤溶液包含ph为约7.5的约100mm tris和约100mm nacl。在另外的实施方案中，所述上清液(即洗涤级分)包含所述一种或多种nsp，并且所述方法还包括测量所述上清液中一种或多种nsp的活性形式的浓度。

14、在所述方法的一个实施方案中，所述方法还包括测量单独分离的细胞裂解物(例如，第一、第二、第三、第四、第五或第六分离的细胞裂解物)中一种或多种nsp的活性形式的浓度。可替代地或另外地，所述方法包括将两种或更多种分离的细胞裂解物组合以提供包含含有所述一种或多种nsp的合并nsp提取物的合并细胞裂解物，任选地随后测量包含所述合并nsp提取物的合并细胞裂解物中所述一种或多种nsp的活性形式的浓度。在示例性实施方案中，所述方法包括将所有分离的细胞裂解物组合，以提供单个合并细胞裂解物。在另外的实施方案中，测量单个合并细胞裂解物中所述一种或多种nsp的活性形式的浓度。

15、在所述方法的一个实施方案中，所述一种或多种nsp包括嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(ne)、蛋白酶3(pr3)、组织蛋白酶g(catg)、嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶4(nsp4)或其组合。在另一个实施方案中，所述一种或多种nsp包括ne。在另一个实施方案中，所述一种或多种nsp包括pr3。在另一个实施方案中，所述一种或多种nsp包括catg。在另一个实施方案中，所述一种或多种nsp包括nsp4。

16、在所述方法的一个实施方案中，所述受试者是人受试者。

17、在另一方面，本公开文本涉及一种治疗有需要的患者的dpp1介导的病症的方法。所述方法包括：

18、(a)测量从获自所述患者的包含白细胞的第一样品中提取的一种或多种nsp的活性形式的基线浓度，

19、(b)在约2周至约16周的第一施用期内每日给所述患者口服施用包含约10mg至约40mg的第一每日剂量的式(i)的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，

20、

21、其中，

22、r1是

23、r2是氢、f、cl、br、oso2c1-3烷基或c1-3烷基；

24、r3是氢、f、cl、br、cn、cf3、so2c1-3烷基、conh2或so2nr4r5，

25、其中r4和r5连同它们所附接的氮原子一起形成氮杂环丁烷、吡咯烷或哌啶环；

26、x是o、s或cf2；

27、y是o或s；

28、q是ch或n；

29、r6是c1-3烷基，其中所述c1-3烷基任选地被1、2或3个f取代并且任选地被一个选自以下的取代基取代：oh、oc1-3烷基、n(c1-3烷基)2、环丙基或四氢吡喃；并且

30、r7是氢、f、cl或ch3；

31、(c)测量从包含白细胞的第二样品中提取的所述一种或多种nsp的活性形式的浓度，其中所述第二样品是在所述第一施用期期间或所述第一施用期后约一周或更短时间从所述患者获得的，

32、(d)将来自所述第二样品的浓度与来自所述第一样品的基线浓度进行比较；并且

33、如果来自所述第二样品的浓度相比于来自所述第一样品的基线浓度降低约10％或更多，则在第二施用期内每日给所述患者口服施用与所述第一每日剂量相同的每日剂量的式(i)的化合物或其药学上可接受的盐，或

34、如果来自所述第二样品的浓度相比于来自所述第一样品的基线浓度未降低约10％或更多，则在第二施用期内每日给所述患者口服施用第二每日剂量的式(i)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述第二每日剂量是所述第一每日剂量的约1.5倍至约7倍。

35、在所述方法的一些实施方案中，式(i)的化合物或其药学上可接受的盐的第一每日剂量是约10mg至约25mg、约10mg至约15mg、约10mg至约12mg、约16mg至约25mg或约20mg至约25mg。

36、在所述方法的一些实施方案中，所述第二每日剂量是所述第一每日剂量的约1.5倍至约6倍、约1.5倍至约5倍、约1.5倍至约4倍、约1.5倍至约3倍或约1.5倍至约2倍。

37、在所述方法的一些实施方案中，所述第一施用期是约2周至约12周、约2周至约8周、约3周至约6周、约3周至约5周，例如约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周。

38、在所述方法的一些实施方案中，所述第二样品是在所述第一施用期期间从所述患者获得的。例如，所述第二样品可以在所述第一施用期结束时或在所述第一施用期结束前约1、2、3、4、5、6或7天从所述患者获得。在一个实施方案中，所述第一施用期是约4周，并且所述第二样品是在所述第一施用期期间在约4周从所述患者获得的。

39、在所述方法的一些实施方案中，所述第二样品是在所述第一施用期后约一周从所述患者获得的。在其他实施方案中，所述第二样品是在所述第一施用期后约1、2、3、4、5、6或7天从所述患者获得的。

40、在所述方法的一个实施方案中，所述一种或多种nsp包括ne。在另外的实施方案中，如果来自所述第二样品的ne的活性形式的浓度相比于来自所述第一样品的ne的活性形式的基线浓度降低约19％或更多，则在所述第二施用期内每日口服施用与所述第一每日剂量相同的每日剂量的式(i)的化合物或其药学上可接受的盐，或如果来自所述第二样品的ne的活性形式的浓度相比于来自所述第一样品的ne的活性形式的基线浓度未降低约19％或更多，则在所述第二施用期内每日口服施用所述第二每日剂量的式(i)的化合物或其药学上可接受的盐。

41、在所述方法的一些实施方案中，所述第二施用期是至少1个月，例如，约1个月至约24个月、约1个月至约12个月、约5个月至约24个月、约5个月至约18个月或约5个月至约15个月、约3个月至约6个月、约6个月至约12个月、约12个月至约18个月或约12个月至约24个月。

42、在所述方法的一个实施方案中，式(i)的化合物是(2s)-n-{(1s)-1-氰基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并噁唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺(在本文中称为其国际非专有药名(inn)布伦索替布(brensocatib)(并且以前称为ins1007和azd7986))或其药学上可接受的盐。

43、在所述方法的一个实施方案中，dpp1介导的病症是气道阻塞性疾病。在一个实施方案中，所述气道阻塞性疾病是支气管扩张。在另外的实施方案中，所述支气管扩张是非囊性纤维化支气管扩张。在另一个实施方案中，所述气道阻塞性疾病是囊性纤维化。在另一个实施方案中，所述气道阻塞性疾病是α-1抗胰蛋白酶缺乏症。

44、在所述方法的一个实施方案中，dpp1介导的病症是癌症，例如，乳腺癌、膀胱癌、肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌、肝癌、肝细胞癌、肾癌、胃癌、皮肤癌、纤维瘤癌症(fibroid cancer)、淋巴瘤、病毒诱导的癌症、口咽癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤和骨癌。在另外的实施方案中，所述癌症是转移癌，例如转移性乳腺癌。在另外的实施方案中，所述癌症是转移性乳腺癌，包括乳腺癌向肺、脑、骨、胰、淋巴结和/或肝的转移。