用于记录样本中单个粒子的轨迹的方法和显微镜与流程

背景技术：

0、现有技术

1、对样本中单个粒子的观测和跟踪(英文：single particle tracking,spt—单粒子追踪)是研究生物系统中分子动力学的一项重要技术。为此，可以使用光散射粒子，例如金属纳米粒子；然而，通常使用荧光粒子或荧光染料的单个分子。有了荧光染料，还可以标记原本无法探测到的粒子，从而使其可用于粒子跟踪。生物应用领域包括酶催化反应、dna转录、离子通道的活性和囊泡转运的研究。

2、在此，所用方法的适用性在很大程度上取决于可实现的观测时段和观测单个粒子时的时间分辨率。为此，一方面是基于显微镜的成像方法，另一方面是基于点探测器的方法，这些在现有技术中都是已知的。前者允许在更大的图像范围内观测单个粒子，从而可以在相对较长的时段内跟踪自由扩散的粒子。然而，可实现的时间分辨率受到相机帧速率的限制，这就是为什么用这种方法不可能研究快速过程。

3、相反，用基于点探测器的方法，特别是在使用时间分辨的单光子计数时，可以实现小到皮秒范围的高时间分辨，然而在许多应用中，观测时段仅限于单个粒子在照射光焦点中的停留时间。如果粒子可以自由扩散，则观测时段就特别短。为了克服这种限制，待跟踪的粒子、特别是单分子，往往被固定住，即绑定在固定的载体上或借助于光学镊子保持在一个地方。然而，为了使用光学镊子，单个生物分子必须与(较大的)载体粒子耦合，这严重限制了在天然生命系统中的应用。

4、可替代地，借助于可调节的样本保持器和闭环调节主动将分子保持在焦点中这种方式，可以延长使用单点探测器对单个粒子的观测时段。n.p.wells等人在nano lett.10,4732(2010)发表的“time resolved 3dmolecular tracking in live cells”中首次实现了对单个荧光分子的跟踪，其中在92％的甘油(即非常粘稠的介质)中的cy5-dutp分子可以被实时跟踪约100ms。由于染料分子在粘度较小的介质中的扩散速度明显较高，使得单个染料分子不能再被足够快速地跟踪，并且快速地离开用于样本跟踪的调节装置的捕获范围，因此在该文章中使用的基于压电的调节器无法在粘度较小的(并因此与实践更相关的)介质中应用该方法。轨迹的最大时间长度也很短，约为100ms，这特别是由于光子预算有限，即染料分子在最终被漂白之前发出的荧光光子数量有限。

5、为了更快地跟踪单个粒子，特别是单个染料分子，现在有了快速光束偏转装置，特别是电光偏转器或声光偏转器，它们的定位时间达到了(亚)微秒范围，但定位范围仅限于几微米。为了能够在样本的更大范围内扫描单个粒子，这些快速非机械的扫描装置可以与振镜结合，振镜允许在样本的更大范围内对聚焦激发光进行(较慢的)预定位。

6、文献de 10 2011 055 367 a1描述了一种以缩写minflux著称的单粒子跟踪的变型，其中，用扫描光的具有强度最小值的光分布来照射粒子，并记录由粒子发射的光子。通过使强度分布相对于样本偏移，使粒子发射的光子速率保持最小，从而追踪到在样本中移动的粒子的最小值。随着定位置信度的增加，强度最小值的位置可以越来越靠近被跟踪的粒子周围，并且增加了扫描光的功率，由此实现了进一步精确的定位。

7、minflux方法的特殊优点在于其特殊的光子效率，其允许精确定位单个粒子到个位数纳米范围，即使光子数量相对较少。由于扫描是以光分布的强度最小值(理想情况下是零强度)进行的，并且强度最小值仅定位在粒子周围的附近区域内，因此只向粒子施加以低光强度。定量分析【参见k.gwosch等人在nat.methods 17,217(2020)中发表的“minfluxnanoscopy delivers 3d multicolor nanometer resolution in cells”】表明，minflux方法中的定位精度的标准偏差σ遵循σ∝1/nk/2的关系，其中n是探测到的光子的数量，k是迭代步骤的数量。因此，在四次迭代后，σ∝1/n2，即定位的不确定性随光子数量的平方而减小。与此相反，当根据粒子的宽视场图像(例如，在storm/palm显微术中或通过用高斯光聚焦扫描)确定单个粒子的位置时，标准偏差仅随探测到的光子数量n的平方根而减小由于这种特殊的光子效率，即使是单个荧光染料分子(它们在不可逆漂白之前只发射非常有限数量的荧光光子)，也可以用minflux方法进行比用其他方法更多的位置确定。

8、特别是当使用快速扫描装置时，可以在非常短的间隔内重复确定单个粒子的位置，目前可用的现有技术为约每100μs一次。由于光子效率高并且定位速度快，因此，minflux方法特别适用于样本中单个荧光染料分子的实时跟踪。在此，在低粘度介质中也可以跟踪单个染料分子。从现有技术中已知，根据minflux方法记录的单个染料分子的轨迹有超过25000次单位置确定。

9、在de 10 2017 104 736 b3中描述了一种minflux方法的变型，其中孤立存在的荧光染料分子的扫描不是通过用激发光的具有局部强度最小值的强度分布的照射来进行的，而是用激发光和荧光阻抑光的两个基本上互补的强度分布的照射来进行的。在此，激发光的强度分布具有局部强度最大值，而荧光阻抑光的强度分布在同一位置具有局部强度最小值。具体来说，荧光阻抑光可以是sted光，其通过触发受激发射来防止被激发的荧光染料分子在激发光的强度分布的边缘区域中发出荧光光子。同样，在minflux方法的该实施方式中，染料分子发射的荧光强度取决于与荧光阻抑光的局部强度最小值的距离，但这里的荧光不是随着到强度最小值的距离的增加而增加，而是减小。m.weber等人在biorxiv，doi：10.1101/2020.10.31.363424(2020)发表的“minsted fluorescence localization andnanoscopy”中提出了这一概念的实验性实现。

10、虽然具有许多位置确定的单个粒子的长轨迹原则上是可取的，但问题是轨迹在其整个长度上是否包含对给定问题有意义的信息。例如，如果粒子与结合位点之间的距离过大，则对样本中被跟踪的粒子与结合位点之间可能的相互作用的研究就不能提供相关信息。此外，如果在记录轨迹期间细胞进入非代表性状态(例如，由于细胞分裂或凋亡)，则从轨迹中推导得到的信息可能是不相关的，甚至是误导性的。此外，过度的扫描还会导致可避免地向样本施加以扫描光，并导致不必要的长的测量持续时间。

11、发明任务

12、因此，本发明的任务在于展示用于跟踪样本中单个粒子的运动的方法和光学显微镜，其中，当对粒子的跟踪不再提供与给定问题相关的信息时，对粒子的跟踪中断(unterbrecehn)或中止(abbrechen)。因此，根据本发明的方法和光学显微镜的任务在于展示方法，该方法定义了用于跟踪粒子的适当的中止标准。

13、解决方案

14、本发明的任务通过根据独立权利要求1的方法和根据独立权利要求21的光学显微镜来解决。从属权利要求2至20涉及该方法的优选实施方式，以及从属权利要求22至26涉及光学显微镜的优选实施方式。

15、发明描述

16、本发明基于以下构思：当跟踪样本中粒子的运动时，通常不能仅从轨迹的数据点来决定记录的轨迹中哪些部分包含回答给定问题的相关信息，而是需要进一步了解样品中的背景信息。这种背景可以是关于刚刚跟踪的粒子的(直接)周围环境的空间信息，也可以是表征例如细胞器的功能状态(例如，离子通道的开放状态)或整个细胞的功能状态的功能信息。

17、为此，本发明包括用于记录轨迹(即，样本中单个粒子的时间分辨位置曲线)的方法，其中在样本中检测第二测量变量，并且当第二测量变量或根据第二测量变量计算的控制值满足中止标准时，中断或终止对轨迹的记录。这样及时终止对轨迹的记录，既节省时间，又节省光子。

18、在此，光散射粒子(例如，金属纳米粒子、二氧化硅或乳胶纳米粒子、或者在许多应用中优选为荧光粒子)可以用作待跟踪的粒子。术语荧光粒子在这里应从广义上理解；例如，荧光粒子包括用荧光染料标记的试剂、配体、活性物质或生物分子(如蛋白质、dna、脂质)的单分子，也包括荧光标记的超分子结构、聚集体或分子复合物，如胶束、囊泡或脂筏。特别地，荧光粒子还包括分子荧光团，即荧光染料的单个分子和荧光量子点(英文：quantumdots,qdots)。决定性的因素是，粒子以离散和大致相同的单位的形式出现。

19、为了实施根据本发明的方法，要确保粒子孤立存在，即相邻粒子的间距高于光学衍射极限，以便相邻粒子可以在光学成像中被识别为分离的对象。由此，例如可以通过使用如此低浓度的粒子，使得这些粒子在统计平均值上彼此间有足够的间距，来满足间距要求。如果荧光染料可以被光诱导在至少一个方向上在荧光状态和非荧光态之间进行转换，则也可以通过光活化和/或光失活来产生荧光染料的空间上孤立的荧光分子。通过光活化极少数荧光染料分子或光失活大部分荧光染料分子，可以准备出少量处于荧光状态且彼此之间具有所需间距的染料分子。在此，该间距要求也适用于不同荧光染料的分子，这些荧光燃料分子可以用相同波长的激发光激发出相同荧光波长范围内的荧光。关于分离样本中荧光染料分子的适当方法，技术人员可以参考定位显微术(palm、storm和相关方法)的综合现有技术。

20、为了根据本发明的方法记录单个粒子的轨迹，需要至少近似地知道在测量开始时单个粒子的初始位置。例如，可以通过在常规激光扫描中用聚焦光扫描样本或从先前记录的宽视场图像中来获得初始坐标；这方面的具体方法也可以在palm显微术、storm显微术和minflux显微术的现有技术中找到。

21、从初始确定的粒子坐标开始，在一个或更多个扫描位置处用扫描光扫描粒子，其中扫描光在样本中的强度分布具有局部强度最小值，理想情况下是强度零点。如果在下文中提到扫描位置，是指该局部最小值的位置。当用扫描光照射时，待跟踪的粒子产生可探测的光信号，例如在光散射粒子情况下产生散射光信号或者在荧光粒子情况下产生荧光信号。

22、当用扫描光扫描粒子时，在每个扫描位置处探测数量或强度形式的光信号作为第一测量变量。根据粒子是否位于扫描位置的中心并因此位于扫描光的强度最小值或强度最小值附近，或者是否远离强度最小值并因此暴露于更高强度的扫描光下，探测到的光信号会变低或变高。在这方面，探测到的光子数量或光强度代表粒子与强度最小值的距离的度量，并用于确定随后的扫描位置和被扫描粒子的更新坐标。在此，粒子的更新坐标的确定可以在固定或可变(即，在扫描过程中调整)数量的扫描位置之后、在每个单独的扫描位置之后或甚至在每个探测到的光子之后进行。通过重复定位粒子并重新设定后续的扫描位置，扫描会跟随粒子在样本中的运动，从而再现粒子的轨迹。

23、上述的方法步骤基本上对应于现有技术中已知的根据minflux方法进行单分子跟踪的方法，例如f.balzarotti等人在science 355,606(2017)中发表的“nanometerresolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photonfluxes”所描述的。

24、现在，根据本发明的方法与现有技术的不同之处在于，在记录粒子的轨迹期间检测样本中的第二测量变量，并且当第二测量变量或根据第二测量变量计算的控制值满足中止标准时，中断或终止对轨迹的记录。在最简单的情况下，中止标准是第二测量变量或控制值低于最小值或超过最大值。可选地，如果第二测量变量或控制值再次超过最小值或者再次低于最大值，则可以继续扫描，其中，在实践中可能会出现滞后。也可以将更复杂的标准设定为中止标准，特别是还考虑到第二测量变量的历史。

25、根据本发明，第二测量变量是在记录轨迹期间在样本中的某个位置探测到的，其中探测可以连续进行，即与粒子的扫描异步进行，或并入到粒子的扫描过程中。虽然不是强制性的，但第二测量变量优选地在每次更新粒子坐标时至少检测一次。第二测量变量的探测可以在粒子的当前坐标处或在当前扫描位置处以点状形式进行，但是也可以在样本中的扩展区域中检测第二测量变量并在该区域内对其求平均，例如在上一次确定的粒子坐标的周围环境中或在样本中先前设定的固定区域中进行。例如，这个区域可以由细胞或细胞器(例如，细胞核)的轮廓来设定。

26、中止标准的目的在于，例如，如果观测到的粒子的进一步定位不再提供与给定问题相关的信息，或者如果样本的变化使得从进一步定位推导得到的信息不再与从先前定位推导得到的信息具有可比性，即对实验不再有意义，甚至可能导致错误的结论，则终止或至少暂时中断对轨迹的记录。通过并行探测第二测量变量和应用中止标准，可以避免多余的扫描，从而避免样本不必要地暴露在扫描光下。同时，可以减少测量持续时间，或在给定的时间内记录更多粒子的轨迹。对于许多需要对大量轨迹进行统计分析的问题，这种时间优势可以记录和分析更大的数据集，而无需延长总的测量持续时间。

27、在根据本发明的方法的优选实施方式中，针对每个位置确定，在围绕上一次确定的粒子坐标的通常≤250nm的附近区域内的多个扫描位置处扫描粒子，其中由扫描位置形成的多边形(在二维情况下)的或者多面体(在三维情况下)包括上一次确定的粒子坐标。由此，确保了粒子的明确定位是可能的。在扫描位置处由粒子发射的光子数或光强度允许计算出粒子的更新坐标；对此，技术人员可以参考现有技术中已知的(特别是关于minflux技术的)方法和算法。重复执行所述步骤，即：在各自当前坐标周围的附近区域内设定进一步的扫描位置，在新设定的扫描位置处用扫描光扫描粒子，记录在每个扫描位置处由粒子发射的光，并确定更新坐标。在此，在每个定位步骤之后，各自后续的扫描位置的设置是基于上一次确定的粒子坐标。可选地，也可以增加扫描光的光功率。通过对粒子的反复定位和扫描位置的重新设定，扫描跟随染料分子在样本中的运动，从而映射出粒子的轨迹。

28、在一可替代实施方式中，每次在扫描位置处扫描粒子之后，确定粒子的更新坐标和后续的扫描位置。仅从在单个扫描位置处探测到的光子来完全定位粒子是不可能的；然而，基于扫描历史、强度最小值与假定的粒子当前位置的相对位置以及在当前扫描位置处探测到的光子数量或光强度，可以推断出扫描位置必须向哪个方向移动。

29、扫描位置的设定和扫描光的强度在很大程度上取决于粒子在样本中的扩散速度或传输速度以及粒子可以被定位的频率。虽然扫描位置尽可能密集地围绕各个粒子的当前位置排列并且扫描光的高光功率允许精确定位，并且因此是可取的，但同时增加了粒子在连续定位之间离开定位的捕获区域的风险。虽然在静态的、不运动的染料分子的定位中，扫描位置逐渐靠近染料分子的位置，扫描光的光功率可以增加，从而提高定位精度，但在跟踪运动中的粒子时，这并不总是可行的。相反，必须调整扫描位置和扫描光的光功率，使得粒子在连续定位之间保持在捕获半径内。在此，定位频率越高并且粒子的运动速度越低，扫描位置就可以在粒子周围排列得越密集，并且扫描光的光功率可以调整得越高。这两个参数的调整也可以在连续的定位之间进行，即在记录轨迹期间进行。

30、在根据本发明方法的优选实施方式中，第二测量变量是光学测量变量，特别是在第二探测通道中探测到的荧光信号。这种荧光信号可以来自样本中的(另一)荧光染料，并且特别是用于标记样本中结构。然而，它也可以是自发荧光信号，即细胞的内在荧光信号。例如，如果样本中的细胞核、细胞膜、细胞器、结构蛋白、离子通道、脂筏或其他结构用(另一)荧光染料染色，则它们的荧光在跟踪样本中单个粒子时提供了背景信息。在被扫描粒子的位置处，没有这种染色或者低于这种染色的最小荧光信号例如可以表明，被扫描粒子位于细胞或细胞中感兴趣区域之外(或者已经离开该区域)，因此可以用作跟踪粒子的中止标准。例如，为了研究配体-受体相互作用，可以用不同的荧光染料对配体和受体进行染色，并且可以根据本发明的方法在样本中跟踪荧光标记的配体的单个分子。在此，跟踪单个荧光标记的配体分子可以被限制在配体紧邻受体并可以与受体相互作用的时段内，如受体的荧光(控制)信号所示。如果控制值表明配体分子已经离开相应的受体，则可以停止跟踪。

31、中止标准不一定要直接定义在第二测量变量上，而是也可以与根据第二测量变量计算出的控制值相关，该控制值的计算可以包括另外的测量变量。特别地，控制值可以从两个探测通道中的荧光比值来计算，其中荧光是在不同的探测波长范围内探测的。在此，当比例指示剂染料的荧光被用于控制值的计算时，会得到有利的实施方式。例如，这种指示剂染料在两个波长范围内的荧光信号的比值可以提供例如关于离子浓度(特别是钙离子、镁离子、锌离子和钠离子)、ph值或膜电位的信息。与这种控制值相关的中止标准使单个粒子的跟踪不仅限于样本中的空间有限的区域，而且还限于细胞或细胞器的某些功能状态，例如离子通道的开放状态或细胞膜的完整性。用合适的指示剂染料或者基于荧光的试剂(如荧光泛素细胞周期指示剂fucci)也可以评估细胞在细胞周期进展和分裂或者细胞活力或细胞生命力方面的状态(例如，live/dead化验，thermofisher scientific)。在此，荧光双重染色可用于同时证实细胞的凋亡和坏死，这样就可以根据一个或两个荧光通道中的荧光信号将细胞分类为死亡、坏死或凋亡。如果控制值从这些荧光细胞状态、活力或者生命力标记物中的一个或更多个的荧光中推导得到，那么可以根据本发明的方法将对单个荧光粒子的追踪限于完整的细胞或被观测的细胞可被归类为健康或处于细胞周期某个阶段的观测时段。通过这种方式，就可以避免因记录非代表性数据而产生的对测量数据的误解。

32、除荧光强度外，荧光发射的其他参数也可用于定义中止标准，特别是荧光寿命或荧光各向异性。由于流动性降低或荧光猝灭的可能反应路径的改变，这些参数通常对染料分子或用荧光染料标记的分子或粒子的结合状态或分子环境的变化敏感。

33、在使用荧光粒子时，还可以选择根据本发明方法的可替代实施方式，其中扫描光是由从sted显微术中已知的激发光和荧光阻抑光的具有局部强度最小值的分布的叠加形成，这样防止从聚焦边缘范围的荧光发射。荧光抑制光可以理解为阻止、减少或完全抑制荧光粒子的荧光发射的任何类型的光。特别地，荧光阻抑光可以是刺激光，其诱导电子激发的染料分子的受激发射，从而使染料分子转换(返回)到电子基态，从而阻止自发的荧光发射。同样在该配置中，对单个荧光粒子的扫描提供了荧光信号，该荧光信号取决于粒子与荧光阻抑光的强度最小值的间距。然而，信号强度与间距的关系是相反的，即荧光信号随着与荧光阻抑光的强度最小值的间距的增加而减小。

34、除荧光外，用于推导中止标准的第二测量变量也可以是另一个光学测量变量，特别是二次谐波生成信号(shg)、三次谐波生成信号(thg)、瑞利或拉曼散射光信号、相干反斯托克斯拉曼散射(cars)、反射光信号、微分干涉对比信号(dic)或偏振对比信号。使用这些光学测量变量中的一个来设定中止标准的优点在于，不需要用荧光标记物对样本进行(进一步)染色，并且这些信号不受光漂白的影响。虽然这些对比模式不能达到与定向荧光标记物相当的特异性，但一些对比模式仍然显示出一定的选择性。例如，shg信号不会出现在具有分子对称中心的结构上，而某些非中心对称结构(如胶原蛋白、肌球蛋白、微管蛋白)在shg对比中提供特别高的信号。

35、为了生成第二光学测量变量，除了扫描光之外，通常还用另外的光照射样本，该另外的光的特性与相应的对比模式和/或扫描光相匹配。在此，另外的光应该选择性地激发第二光学测量变量的信号，而不是由跟踪的粒子发射光子。因此，在正常情况下，另外的光的波长不同于扫描光。当使用shg信号或thg信号作为第二测量变量时，激发这些信号的波长通常在红色光谱范围或者红外光谱范围内，这样就很轻松地与产生荧光或通过粒子的光散射的扫描光解耦。用于激发第二测量变量的光可以与扫描光一起通过单个物镜定向到样本中；然而，也可以用附加的激发光通过单独的光学器件照射样本。该单独的光学器件可以是第二物镜，该第二物镜面对用于用扫描光照射样本的物镜，或者与该物镜成一定角度布置，使得扫描光和用于产生第二测量变量的附加激发光在样本中相交。在此，光束相交的角度介于15°和165°之间，优选地介于45°和135°之间，特别优选地介于80°和100°之间。在样本的这种照射(例如该照射在光片显微镜中实现)中，可以减少将样本暴露在附加激发光下，提高第二测量变量的空间分辨率，并且可以减少在扫描样本时由附加的激发光产生的信号背景。

36、第二测量变量也可以是非光学变量。例如，该变量可以是电测量变量，特别是电压、电流、电阻、电容、电感或者电压、电流或交流电磁场的频率、相位或振幅。样本中的电流例如可以在膜片钳布置中测量，其中用微吸管将待研究细胞的细胞膜中的单个离子通道与周围介质电隔离，并用电极测量通过离子通道的电流。在用灵敏的测量放大器将探测到的电流放大并处理成控制值之后，可以基于该控制值设定用于执行根据本发明的方法的中止标准。

37、本发明还涉及光学显微镜，光学显微镜被设置用于执行根据本发明的方法。为此，光学显微镜包括物镜和扫描光的光源，利用该光源可以激发样本中的粒子发出光子。根据本发明，样本中的扫描光具有局部强度最小值，它是借助布置在扫描光的光束路径中的光束整形装置产生的。这种光束整形装置是技术人员从现有技术中已知的；这里的例子是相位滤波器或可编程相位调制器(英文：spatial light modulator，slm—空间光调制器)，它们例如也用于sted显微术。光学显微镜还包括扫描设备，该扫描设备可用于将扫描光定位在样本中，并在不同的扫描位置处扫描样本中的粒子。

38、光学显微镜具有探测通道，该探测通道从样本中检测第一光学测量变量。该光学测量变量是由于用扫描光进行照射而由待跟踪的粒子发射的光信号，因此通常是散射光信号或荧光信号。为此，在光子计数模式下操作的雪崩光电二极管特别适合作为探测器，它可以具有出特别高的灵敏度。然而，模拟光电倍增管也可以用作探测器，只要它有足够的灵敏度进行单分子探测。此外，根据本发明，光学显微镜具有用于检测样本中的第二测量变量的探测通道；该第二测量变量用于在实施根据本发明的方法时设定中止标准。

39、如果光学显微镜被设置用于记录荧光粒子的运动轨迹，则光学显微镜是荧光显微镜，那么扫描光至少包括荧光激发光，用该荧光激发光可以激发粒子发出荧光。如果扫描光由荧光激发光和来自另一光源的荧光阻抑光叠加而形成，其中(仅)荧光阻抑光在样本中具有局部强度最小值，则得到一个特殊实施方式。如前所述，荧光阻抑光可以理解为适合于阻止、减少或完全抑制荧光染料的荧光发射的任何类型的光。特别地，荧光阻抑光可以是诱导电子激发的染料分子的受激发射的刺激光。同样，在上一实施方式中，对单个荧光粒子的扫描提供荧光信号，该荧光信号取决于粒子与荧光阻抑光的强度最小值的间距；然而，信号强度与间距的关系是相反的，即荧光信号随着与荧光阻抑光的强度最小值的间距的增加而减小。

40、如果光学显微镜被设置用于记录光散射粒子的运动轨迹，则扫描光用于在粒子上产生散射光信号，其中散射光信号可以具有与扫描光相同的波长(瑞利散射)或相对于扫描光移位的波长(瑞利散射，相干反斯托克斯拉曼散射)。光学显微镜也可以具有多种对比模式，这些对比模式可以并行或交替使用。

41、为了能够发挥该方法在可实现的定位精度方面的潜力，通常要求扫描设备的定位精度为1nm或更小，并且具有相应的再现性。另一方面，定位时间优选在微秒范围内，以便能够实现粒子的快速扫描和快速定位序列。对根据本发明的光学显微镜的扫描设备的这些精度要求和速度要求仅靠如振镜之类的机械光束偏转单元是无法满足的或仅不充分地满足的。因此，不需要移动部件的光束偏转单元(例如，电光偏转器(eod)或电声偏转器)适用于扫描设备。有了这些光束偏转单元，就可以很轻松地实现所需的定位时间，但最大偏转角非常有限。出于这个原因，根据本发明的光学显微镜的优选实施方式在光束路径中既具有用于在更大的图像场上定位光束的振镜扫描器，也具有用于对单个粒子进行(快速)扫描的电光偏转器。可替代地，可以有将扫描仪和光束偏转装置的功能集成在一起的设备；例如，这种设备可以由可变形的反射镜构造而成。在进一步可替代的实施方式中，扫描仪的功能可以例如由可移动的样本台接管。

42、在光学显微镜的优选实施方式中，第二测量变量也是光学测量变量，例如样本中的(另一)荧光标记物的(另一)荧光。优选地，这种(另一)荧光的探测在不同于由于用扫描光进行照射而由粒子产生的发射的波长范围内进行，以便能够将这两个变量彼此分开。如果粒子的发射和(另一)荧光标记物的激发在时间上或光谱上是可以分开的，那么这两个探测通道也可以被设计成相同的或者不分开。除荧光外，还可以检测其他光学信号作为第二测量变量，特别是二次谐波生成信号(shg)、三次谐波生成信号(thg)、瑞利或拉曼散射光信号、相干反斯托克斯拉曼散射(cars)、反射光信号、微分干涉对比信号(dic)或偏振对比信号。

43、第二测量变量也是光学测量变量的大多数实施方案需要一个或更多个另外的光源，利用该光源在样本中生成检测信号作为第二测量变量。该一个/更多个另外的光源可以是例如用于激发荧光的激光器或用于产生shg信号或thg信号的超短脉冲激光器。另外的光源的光可以与扫描光一起通过单个物镜定向到样本中；然而，也可以用另外的光源的光通过单独的光学器件照射样本。该单独的光学器件可以是第二物镜，该第二物镜面对用于用扫描光照射样本的物镜，或者可以与该物镜成一定角度布置，使得扫描光和用于生成第二测量变量的光在样本中以介于15°和165°之间的角度、优选地以介于45°和135°之间的角度、特别优选地以介于80°和100°之间的角度相交。例如，在光片显微镜中实现了这样的配置。

44、在一可替代的实施方式中，第二测量变量是非光学测量变量。特别地，非光学测量变量优选是电测量变量，即电压、电流、电容、电感或者电压、电流或交变电磁场的频率、振幅或相位。例如，电流可以在膜片钳布置中测量，其中用微吸管将待研究的细胞的细胞膜中的单个离子通道与周围介质电隔离，并用电极测量通过离子通道的电流，并且在用灵敏的测量放大器处理后将其转换为用于执行根据本发明的方法的控制值。

45、本发明的有利的扩展方案从权利要求书、说明书、附图以及对附图的相关阐述中得出。本发明的特征和/或特征组合的所述优点仅是示例性的，并且可能具有可替代的或累积的效果。

46、对于原申请文件和专利申请的公开内容(但不包括保护范围)，适用以下内容：进一步的特征可以在附图中找到，特别是所示的相对排列和操作连接。本发明不同实施方式的特征或不同专利申请权利要求的特征的组合也可以偏离专利申请权利要求选择的引用关系，并特此提出。这也适用于那些在单独附图中示出的或在其描述中提到的特征。这些特征也可以与不同专利申请权利要求的特征组合起来。同样，对于本发明的进一步实施方式，专利申请权利要求书中列出的特征可能被省略，但这不适用于已授予的专利的独立专利权利要求。

47、专利申请权利要求中包含的参考标记并不构成对专利申请权利要求所保护的对象范围的限制。它们仅用于使专利申请权利要求更容易理解。

技术实现思路