一种基于电化学发光能量转移选择性产生单线态氧的方法

1.本发明涉及一种基于电化学发光能量转移选择性产生单线态氧的方法，属于电化学发光技术领域。


背景技术：

2.由于单线态氧存在未被占据的π
*
轨道，是一种重要的活性氧物质，现已被广泛应用于光化学和光生物过程，包括光降解和老化过程，甚至光致癌作用(chem.rev.2003,103,1685-1757)。单线态氧的产生通常是由光敏化剂的激发三重态及氧分子的三线态基态之间的能量转移产生的。此外，价带或陷阱态空穴、羟基自由基、电生铁离子等也可通过电子转移过程氧化超氧阴离子产生单线态氧。由于单线态氧的产生通常伴随着其他活性氧物质的产生，如：过氧化氢、超氧阴离子、羟基自由基等，且单线态氧在有机合成、光漂白、癌症的光动力学治疗具有重要作用。因此，单线态氧的产生、鉴别和定量分析尤为重要。
3.在生物体系中，单线态氧的产生可以基于光激发和无光激发的过程，但是单线态氧大多是光敏剂在光激发条件下产生的。目前，一系列的发光物质，如：金属有机框架、镧系复合物、上转换纳米材料、贵金属纳米簇已经被用做光敏剂来实现单线态氧的生成。
4.众所周知，单线态氧发光的特征辐射带分别位于1270、703、634和478纳米(chem.rev.2005,105,3371-3387)。单线态氧的荧光与化学发光的相关研究已经趋近成熟，而其电化学发光的相关研究相对甚少，且目前报道单线态氧的电化学发光大多处于634纳米。因此，单线态氧的电化学发光特征发射带有待进一步拓宽。另一方面，基于电化学激发选择性产生单线态氧并伴随着单线态氧的电化学发光现象，可为基于电化学发光技术实现免疫分析及核酸检测奠定基础。但是，关于电化学激发产生单线态氧，还鲜有报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供一种基于电化学发光能量转移选择性产生单线态氧的方法。本发明基于聚集诱导金簇可通过电化学发光能量转移选择性产生单线态氧，并伴随着单线态氧电化学发光的特征发射，发射波长位于703nm，有效拓宽了单线态氧的电化学发光特征发射带，在临床领域生物标记物的灵敏检测有着广阔的应用前景。
6.术语说明：
7.室温：本发明所述的室温具有常规含义，温度范围在25
±
5℃。
8.本发明的技术方案如下：
9.一种基于电化学发光能量转移选择性产生单线态氧的方法，包括步骤如下：
10.以碳酸盐作为缓冲溶液，三乙胺作为共反应剂，聚集诱导金簇作为发光试剂，在溶解氧参与下，电激发条件下选择性产生单线态氧及其特征发射。
11.根据本发明，优选的，单线态氧特征发射的发射波长位于703nm。
12.根据本发明，优选的，所述的碳酸盐ph＝9-10，最优选ph＝9.7；优选的，所述的碳酸盐的摩尔浓度为0.05-0.5m，最优选0.1m。
13.根据本发明，优选的，所述的三乙胺的摩尔浓度为1-20mm，进一步优选5-15mm，最优选10mm。
14.根据本发明，优选的，所述的聚集诱导金簇的质量浓度为0.1-0.5mg/ml，进一步优选0.12-0.25mg/ml，最优选0.15mg/ml。
15.根据本发明，优选的，所述的聚集诱导金簇按如下方法制备得到：
16.以氯金酸为金源，巯基己酸为稳定剂，乙酸锌为聚集诱导体，制备得到聚集诱导的金簇；
17.优选的，氯金酸与巯基己酸的摩尔比为1:32，氯金酸与乙酸锌的摩尔比为1:41；反应温度为室温，反应时间为24h；
18.优选的，反应完成后，采用异丙醇洗涤纯化后，将产物溶于去离子水，得到聚集诱导金簇溶液。
19.根据本发明，聚集诱导金簇的制备，一种优选的实施方案，包括步骤如下：
20.(1)取71μl50mg/ml haucl4·
3h2o，加入2.5ml去离子水；
21.(2)向步骤(1)中加入50μl巯基己酸，搅拌15min；
22.(3)向步骤(2)中加入430μl 1m氢氧化钠，调节ph至9.5；
23.(4)向步骤(3)中加入0.5ml 0.1m乙酸锌，室温搅拌反应24h，反应完成后，采用异丙醇洗涤纯化后，将产物溶于去离子水，得到聚集诱导金簇单分散溶液。
24.根据本发明，优选的，所采用的电激发条件为，以玻碳电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，对包含缓冲溶液、共反应剂、发光试剂和溶解氧的单分散溶液进行电化学循环伏安驱动。可产生发射波长位于703nm的单线态氧特征发射，可以实现电化学发光强度/光谱的采集，以及单线态氧的捕获。
25.根据本发明，优选的，在包含缓冲溶液、共反应剂、发光试剂和溶解氧的单分散溶液中加入促进剂，可促进在电激发条件下增强单线态氧特征发射强度。优选的，促进剂为d2o。
26.本发明还提供了聚集诱导金簇在基于电化学发光能量转移选择性产生单线态氧的应用。
27.根据本发明，聚集诱导金簇可在溶解氧、三乙胺及碳酸盐缓冲溶液共存、且电激发条件下选择性产生发射波长位于703nm的单线态氧特征发射，拓宽了单线态氧的电化学发光的特征发射带，有望助力于临床领域生物标记物的灵敏检测。本发明单线态氧的产生，是基于能量转移单线态氧的选择性产生，缓冲溶液为碳酸盐缓冲溶液，优选的碳酸盐为碳酸钠、碳酸钾，其它缓冲溶液无法产生单线态氧。共反应剂为三乙胺，其它共反应剂无法产生单线态氧。目前，基于电激发产生单线态氧大部分是在阴极产生，因为在阴极容易产生超氧阴离子，但是在阴极产生单线态氧的情形通常需要超氧阴离子参与的电子转移过程才能实现，此情形可能会抑制单线态氧的发射。本发明的方法单线态氧可以在阳极选择性产生，不受超氧阴离子的干扰，且伴随单线态氧的电化学发光现象。
28.本发明的有益效果：
29.1、本发明发现电化学发光能量转移可选择性产生单线态氧，打破了电激发条件下通常需要经过电子转移产生单线态氧的限制。
30.2、本发明可基于电化学发光能量转移选择性产生单线态氧特征发射，所采用的聚
集诱导金簇可在溶解氧、三乙胺及碳酸盐缓冲溶液共存、且在电激发条件下产生发射波长位于703nm的单线态氧特征发射，拓宽了单线态氧的电化学发光特征发射带，有望助力于临床领域生物标记物的灵敏检测。
31.3、本发明单线态氧是在阳极通过聚集诱导金簇的三线态激发态与基态氧之间的电化学发光能量转移过程产生，其不受超氧阴离子的影响，并伴随单线态氧的电化学发光发射现象，有利于电化学发光机理的研究。
附图说明
32.图1为实施例1中所制的聚集诱导金簇分别在空气饱和(a)、氮气饱和(b)、氧气饱和(c)下的差分脉冲伏安曲线(电势窗口为0～1.6伏，横坐标为电压，纵坐标为电流强度)。
33.图2为实施例2中所制的聚集诱导金簇分别在空气饱和(a)、氮气饱和(b)、氧气饱和(c)下的电化学发光强度-电压(时间)曲线图(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为电压，纵坐标为电化学发光强度)。
34.图3为实施例2中所制的聚集诱导金簇分别在空气饱和(a)、氮气饱和(b)、氧气饱和(c)下的循环伏安驱动的电化学发光光谱图(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
35.图4为实施例3中所制的聚集诱导金簇在(a)黑暗和(b)光照条件下通过电子自旋共振捕获单线态氧的光谱图(横坐标为磁场，纵坐标为强度)。
36.图5为实施例4中所制的聚集诱导金簇在d2o/h2o体积比为(a)0,(b)10％,(c)20％,(d)30％的碳酸盐缓冲溶液的循环伏安驱动的电化学发光光谱图(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
37.图6为实施例5中所制的聚集诱导金簇在分别加入l-组氨酸(a)0,(b)10μm,(c)20μm,(d)30μm的循环伏安驱动的电化学发光光谱图(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
38.图7为实施例6中所制的聚集诱导金簇在(a)黑暗和(b)光照条件下通过电子自旋共振捕获超氧阴离子的光谱图(横坐标为磁场，纵坐标为强度)。
39.图8为实施例7中所制的聚集诱导金簇在加入25mm山梨酸后的循环伏安驱动的电化学发光光谱图(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
40.图9为对比例1中将碳酸盐缓冲溶液替换为其它不同缓冲液后，循环伏安驱动的电化学发光光谱图(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
41.图10为对比例2中将三乙胺替换为其它不同共反应剂后，循环伏安驱动的电化学发光光谱图(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
具体实施方式
42.下面通过实施例进一步说明本发明，但不限于此。
43.实施例中制备的聚集诱导金簇的差分脉冲伏安曲线由上海辰华的chi 1040采集
获得。电化学发光由西安瑞迈的mpi-ii电化学发光分析仪采集获得。电化学发光光谱由美国普林斯顿仪器有限公司的ccd光栅光谱仪采集获得，该仪器由液氮制冷型面阵ccd(pylon400brx)探测器和焦长为300mm的acton sp2300单色器检测器构成。活性氧物质的采集由德国bruker a300电子自选共振光谱仪获得(λ》420nm)。循环伏安驱动由美国普林斯顿有限公司的versastat 3完成，循环伏安驱动的电化学发光光谱的采集时间为64秒。
44.实施例1
45.一种基于电化学发光能量转移选择性产生单线态氧的方法，步骤如下：
46.(1)取71μl 50mg/ml haucl4·
3h2o，加入2.5ml去离子水；
47.(2)向步骤(1)中加入50μl巯基己酸，搅拌15min；
48.(3)向步骤(2)中加入430μl 1m氢氧化钠，调节ph至9.5；
49.(4)向步骤(3)中加入0.5ml 0.1m乙酸锌，室温搅拌反应24h，反应完成后，采用异丙醇洗涤纯化后，将产物溶于去离子水；
50.(5)将步骤(4)提纯好的聚集诱导的金纳米团簇稀释为0.15mg/ml的单分散溶液；
51.(6)取4ml 0.1m ph 9.7的碳酸盐加入电解池；
52.(7)向步骤(2)中加入0.15mg/ml聚集诱导的金纳米团簇，混合均匀；
53.(8)以玻碳电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，0.1m ph 9.7的碳酸盐作为缓冲溶液，0.15mg/ml聚集诱导金簇作为发光试剂。
54.分别在空气饱和(a)、氮气饱和(b)、氧气饱和(c)下得到的差分脉冲伏安曲线如图1所示(电势窗口为0～1.6伏)。
55.本实施例得到的空气饱和条件下的差分脉冲伏安曲线如图1(a)所示，如图可知，聚集诱导金簇在0.1m ph＝9.7含溶解氧的碳酸盐中产生2个明显的聚集诱导金簇的氧化峰，分别位于0.69v和1.12v(第3个氧化峰来自于碳酸盐缓冲液)。
56.本实施例得到的氮气饱和条件下的差分脉冲伏安曲线如图1(b)所示，如图可知，聚集诱导金簇在0.1m ph＝9.7不含溶解氧的碳酸盐中无聚集诱导金簇的氧化峰，仅有碳酸盐缓冲液自身的氧化峰。
57.本实施例得到的氧气饱和条件下的差分脉冲伏安曲线如图1(c)所示，如图可知，聚集诱导金簇在0.1m ph＝9.7含饱和氧的碳酸盐中依然保持2个明显的聚集诱导金簇的氧化峰。
58.综上说明，氧的参与是电化学发光能量转移产生单线态氧及其特征发射的必要条件。
59.实施例2
60.步骤同实施例1，所不同的是步骤(6)后加入10mm三乙胺。以玻碳电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，0.1m ph＝9.7的碳酸盐作为缓冲溶液，10mm三乙胺作为共反应剂，0.15mg/ml聚集诱导金簇作为发光试剂。
61.分别在空气饱和(a)、氮气饱和(b)、氧气饱和(c)下采用循环伏安法驱动(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初扫向正)得到的电化学发光强度-(电压)时间曲线如图2所示。
62.本实施例得到的空气饱和条件下的电化学发光强度-(电压)时间曲线如图2(a)所示，如图可知，聚集诱导金簇/三乙胺体系在0.1m ph＝9.7含溶解氧的碳酸盐中可在1.17v
和1.35v产生电化学发光。
63.本实施例得到的氮气饱和条件下的电化学发光强度-(电压)时间曲线如图2(b)所示，如图可知，聚集诱导金簇/三乙胺体系在0.1m ph＝9.7不含溶解氧的碳酸盐中无明显电化学发光信号。
64.本实施例得到的空气饱和条件下的电化学发光强度-(电压)时间曲线如图2(c)所示，如图可知，聚集诱导金簇/三乙胺体系在0.1m ph＝9.7含饱和氧的碳酸盐中可可在1.17v和1.35v产生更强的电化学发光。
65.分别在空气饱和(a)、氮气饱和(b)、氧气饱和(c)下采用循环伏安法驱动(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初扫向正)得到的电化学发光光谱如图3所示。
66.本实施例得到的空气饱和条件下的电化学发光光谱图如图3(a)所示，如图可知，聚集诱导金簇/三乙胺体系在0.1m ph＝9.7含溶解氧的碳酸盐中可产生最大发射波长位于703nm的电化学发光信号。
67.本实施例得到的氮气饱和条件下的电化学发光光谱图如图3(b)所示，如图可知，聚集诱导金簇/三乙胺体系在0.1m ph＝9.7不含溶解氧的碳酸盐中无明显电化学发光信号。
68.本实施例得到的空气饱和条件下的电化学发光光谱图如图3(c)所示，如图可知，聚集诱导金簇/三乙胺体系在0.1m ph＝9.7含饱和氧的碳酸盐中可产生信号更强的最大发射波长位于703nm的电化学发光信号。
69.由于该信号完全依赖于溶解氧氛围，其发射波长与单线态氧的发射波长完全一致，推测其为单线态氧的电化学发光发射。
70.实施例3
71.步骤同实施例1，所不同的是步骤(6)后加入10mm tea，25mm 2,2,6,6-四甲基哌啶捕获单线态氧。以玻碳电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，0.1mph＝9.7的碳酸盐作为缓冲溶液，10mm三乙胺作为共反应试剂，0.15mg/ml聚集诱导金簇作为发光试剂，以25mm 2,2,6,6-四甲基哌啶作为单线态氧捕获剂。
72.在空气饱和条件下，分别在不施加电压(a)和循环伏安驱动下(b)采用电子自选共振技术捕获取单线态氧。
73.本实施例得到的不施加电压的单线态氧的捕获结果，由图4(a)可知，实施例3在不施加电压条件下无单线态氧的特征信号。
74.本实施例得到的在循环伏安驱动条件下的单线态氧的捕获结果，由图4(b)可知，实施例3在循环伏安驱动条件下可产生特征的1：1：1的单线态氧的信号。
75.实施例4
76.步骤同实施例1，所不同的是步骤(6)中将碳酸盐分别溶于d2o/h2o体积比分别为0,10％,20％,30％的溶液中(单线态氧促进剂)，加入10mm三乙胺。以玻碳电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，0.1m ph＝9.7的碳酸盐作为缓冲溶液，10mm三乙胺作为共反应试剂，0.15mg/ml聚集诱导金簇作为发光试剂，d2o做单线态氧促进剂。
77.在空气饱和条件下，分别采用d2o/h2o体积比为0,10％,20％,30％的碳酸盐缓冲溶液，采用循环伏安法驱动(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初
扫向正)得到电化学发光光谱图如图5所示。
78.本实施例得到的d2o/h2o体积比为(a)0,(b)10％,(c)20％,(d)30％的碳酸盐缓冲溶液，以循环伏安驱动的电化学发光光谱图如图5所示，如图可知，随着d2o/h2o体积比的增加，该聚集诱导金簇/三乙胺体系在0.1m ph＝9.7碳酸盐中的电化学发光信号不断增强。
79.实施例5
80.步骤同实施例1，所不同的是步骤(8)后加入0,10μm,20μm,30μm的l-组氨酸(单线态氧猝灭剂)，加入10mm三乙胺。以玻碳电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，0.1m ph＝9.7的碳酸盐作为缓冲溶液，10mm三乙胺作为共反应试剂，0.15mg/ml聚集诱导金簇作为发光试剂，l-组氨酸做单线态氧猝灭剂。
81.在空气饱和条件下，当体系分别加入0,10μm,20μm,30μm的l-组氨酸时，采用循环伏安法驱动(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初扫向正)得到电化学发光光谱图如图6所示。
82.本实施例得到的l-组氨酸加入量分别为(a)0,(b)10μm,(c)20μm,(d)30μm后，以循环伏安驱动的电化学发光光谱图如图6所示，如图可知，随着l-组氨酸加入量的增加，该聚集诱导金簇/三乙胺体系在0.1m ph＝9.7碳酸盐中的ecl信号不断下降，最终完全猝灭。
83.综合实施例4和5，证明该703nm的ecl信号完全来源于单线态氧的发射。
84.实施例6
85.步骤同实施例1，所不同的是步骤(6)后加入25mm 5,5-二甲基-1-吡咯啉-n-氧化物捕获超氧阴离子和10mm三乙胺。以玻碳电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，0.1m ph＝9.7的碳酸盐作为缓冲溶液，10mm三乙胺作为共反应试剂，0.15mg/ml聚集诱导金簇作为发光试剂，以25mm temp作为超氧阴离子捕获剂。在空气饱和条件下，分别在不施加电压(a)和循环伏安驱动下(b)采用电子自选共振技术捕获取超氧阴离子。
86.本实施例得到的不施加电压的超氧阴离子的捕获结果，由图7(a)可知，实施例6在不施加电压条件下无超氧阴离子的特征信号。
87.本实施例得到的在循环伏安驱动条件下的超氧阴离子的捕获结果，由图7(b)可知，实施例6在循环伏安驱动条件下无超氧阴离子的特征信号。
88.单线态氧的产生并不依赖于超氧阴离子的产生，即不依赖于电子转移过程，推测其单线态氧的产生及电化学发光可能遵循能量转移过程。能量转移过程必然会通过系间窜越到达三线态。
89.实施例7
90.步骤同实施例2，所不同的是步骤(6)后加入25mm山梨酸和10mm三乙胺。以玻碳电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，0.1m ph＝9.7的碳酸盐作为缓冲溶液，10mm三乙胺作为共反应试剂，0.15mg/ml聚集诱导金簇作为发光试剂，山梨酸做三线态猝灭剂。
91.在空气饱和条件下采用循环伏安法驱动(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初扫向正)得到的电化学发光光谱如图8所示。
92.本实施例得到的空气饱和条件下的电化学发光光谱图如图8所示，如图可知，聚集诱导金簇/三乙胺体系在0.1m ph＝9.7含溶解氧的碳酸盐中，经三线态猝灭后最大发射波长位于703nm的电化学发光信号消失。
93.综合各实施例，聚集诱导金簇/三乙胺体系在0.1m ph＝9.7含溶解氧的碳酸盐中，单线态氧的产生基于电化学发光能量转移过程，且伴随着单线态氧的电化学发光发射。
94.对比例1
95.如实施例1所述，不同的是：
96.将碳酸盐缓冲溶液替换为磷酸盐、tris-hcl、硼酸盐、hepes。以玻碳电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，以0.1m磷酸盐、tris-hcl、硼酸盐、hepes作为缓冲溶液，10mm三乙胺作为共反应剂，0.15mg/ml聚集诱导金簇作为发光试剂。
97.分别在磷酸盐(a)、tris-hcl(b)、硼酸盐(c)、hepes(d)缓冲液中采用循环伏安法驱动(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初扫向正)得到的电化学发光光谱如图9所示。
98.本对比例1得到的不同缓冲液的电化学发光光谱如图9所示，如图可知，在703nm处没有发现单线态氧的特征发射峰，说明其它缓冲液不能产生单线态氧。
99.对比例2
100.如实施例1所述，不同的是：
101.将三乙胺替换为三丙胺、2-n-二丁基乙醇、过氧化氢、水合肼。以玻碳电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，以0.1m ph＝9.7碳酸盐作为缓冲溶液，10mm三丙胺、2-n-二丁基乙醇、过氧化氢、水合肼作为共反应剂，0.15mg/ml聚集诱导金簇作为发光试剂。
102.分别以三丙胺(a)、2-n-二丁基乙醇(b)、过氧化氢(c)、水合肼(d)为共反应剂采用循环伏安法驱动(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初扫向正)得到的电化学发光光谱如图10所示。
103.本对比例2得到的不同共反应剂的电化学发光光谱如图10所示，如图可知，在703nm处没有发现单线态氧的特征发射峰，说明其它共反应剂无法产生单线态氧。