一种孕期营养因子联合检测用试纸条、制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种孕期营养因子联合检测用试纸条、制备方法及其应用。


背景技术：

2.孕期过程中，对叶酸、维生素b12和维生素d是重要的营养因子，其中叶酸是一种水溶性维生素，分子式是c19h19n7o6。因绿叶中含量十分丰富而得名，又名喋酰谷氨酸。叶酸作为机体细胞生长和繁殖必不可少的维生素之一，缺乏会对人体正常的生理活动产生影响。许多文献报道，缺乏叶酸与神经管畸形、巨幼细胞贫血、唇腭裂、抑郁症、肿瘤等疾病有直接关系。在自然界中有几种存在形式，其母体化合物是由喋啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸3种成分结合而成。
3.叶酸含有1个或多个谷氨酰基，天然存在的叶酸大都是多谷氨酸形式。叶酸的生物活性形式为四氢叶酸。叶酸为黄色结晶，微溶于水，但其钠盐极易溶于水。不溶于乙醇。在酸性溶液中易破坏，对热也不稳定，在室温中很易损失，见光极易被破坏。
4.维生素b12又叫钴胺素，是一种含有3价钴的多环系化合物，4个还原的吡咯环连在一起变成为1个咕啉大环(与卟啉相似)，是唯一含金属元素的维生素。维生素d是一种脂溶性维生素，乃环戊烷多氢菲类化合物，一组结构上与固醇有关，功能上可防止佝偻病的维生素，最主要的是维生素d3与d2。
5.孕期检测时，会对上述三种营养因子进行检测，检测时需要对采集的样本进行预处理之后才能进行检测，为了简化测试过程，需要得到一种能够对孕期叶酸和维生素的联合快速检测试剂盒，方便孕期过程中的营养因子快速，便捷，多次检测。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种孕期营养因子联合检测用试纸条、制备方法及其应用，从而解决现有技术中存在的前述问题。
7.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
8.一种孕期营养因子联合检测用试纸条，包括支撑板、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水垫和样品垫，其中，所述支撑板为长条结构，位于最底部，在所述支撑板上方依次设置所述样品垫、所述玻璃纤维素膜、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫；所述硝酸纤维素膜上依次设置叶酸检测线、维生素d检测线、维生素b12检测线和质控线；所述玻璃硝酸纤维素膜包含有量子点标记的fa抗体、量子点标记的vb12抗体、量子点标记的vd抗体和量子点标记的鸡igy。
9.优选的，所述样品垫的顶端压住所述玻璃纤维素膜的底端并与之粘贴，所述玻璃纤维素膜的顶端压住所述硝酸纤维素膜的底端并与之粘贴，所述硝酸纤维素膜的顶端被所述吸水滤纸的底端压住并与之粘贴。
10.优选的，叶酸检测线、维生素d检测线、维生素b12检测线和质控线间隔6-8mm。
11.本发明的另一个目的在于提供一种孕期营养因子联合检测用试纸条的制备方法，包括以下步骤：
12.s1，制备量子点标记的fa抗体：采用mes缓冲液稀释量子点微球颗粒，加入羧甲基纤维素钠和活化剂，活化10-20min后，加入终止剂后反应10-20min；按照fa抗体与量子点微球质量比为1：20的比例加入抗体，经混匀和离心处理后得到量子点标记的fa抗体；
13.s2，制备量子点标记的vb12抗体、vd抗体和鸡igy抗体:按照步骤s1中同样的方法分别制备量子点标记的vb12抗体、vd抗体和鸡igy抗体；
14.s3，制备包含有抗体混合物的玻璃纤维素膜：将量子点标记的fa抗体、量子点标记的vb12抗体、量子点标记的vd抗体、量子点标记的鸡igy抗体按质量比1：1：1:1混合后，喷涂于玻璃纤维素膜上，干燥后即得量子点标记的fa抗体、量子点标记的vb12抗体、量子点标记的vd抗体、量子点标记的鸡igy抗体混合物标记的玻璃纤维素膜；
15.s4，制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，按一定的间隔依次划分叶酸检测线、vb12检测线、vd检测线和质控线，然后分别取fa-bsa、vb12-bsa、vd-bsa和羊抗鸡igy，分别喷涂到对应的叶酸检测线、vb12检测线、vd检测线和质控线上，干燥后即得硝酸纤维素膜；
16.s5，组装试纸条：在塑料板上放置步骤s4制备的硝酸纤维素膜,将步骤s3制备的玻璃纤维素膜压在所述硝酸纤维素膜靠近检测线的一端，然后在玻璃纤维素的一端放置样品垫，硝酸纤维素膜的另一端放置吸水垫，干燥后即完成试纸条的组装过程。
17.优选的，步骤s1中，量子点微球颗粒与mes缓冲液的体积比为1：10；活化剂采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；终止剂采用β巯基乙醇和赖氨酸。
18.更进一步的，采用mes缓冲液稀释量子点微球颗粒，加入羧甲基纤维素钠和活化剂，活化10-20min后，加入终止剂后反应10-20min具体为：取0.02m，ph＝5.5～6.5的mes缓冲液100ul,混合加入10ul浓度100mg/ml的量子点微球颗粒，然后加入羧甲基纤维素钠100mg，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化10-20min后，加入β巯基乙醇，终浓度为5mm，加入赖氨酸，终浓度为10mm，反应10-20min。
19.优选的，步骤s1中，所述经混匀和离心处理后得到量子点标记的fa抗体具体包括：混匀3-3.5h后，8000-15000rpm离心15-30min，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1-1.5h，之后8000-15000rpm离心15-30min，沉淀颗粒物复溶于分散液，即得量子点标记的fa抗体。
20.优选的，步骤s4中分别取fa-bsa、vb12-bsa、vd-bsa和羊抗鸡igy，分别喷涂到对应的叶酸检测线、vb12检测线、vd检测线和质控线上，具体包括：分别取浓度均为1mg/ml的fa-bsa、vb12-bsa、vd-bsa和羊抗鸡igy，以1ul/cm，10cm/秒的速度分别喷涂到硝酸纤维膜的叶酸检测线、vb12检测线、vd检测线和质控线上。
21.优选的，步骤s5中，组装过程中，所述吸水垫长度为40-45mm，所述吸水垫与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1-2mm；所述玻璃纤维素膜的长度为6-8mm，所述玻璃纤维素膜与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1-2mm；所述样品垫的长度为25-27mm，所述样品垫与所述玻璃纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1-2mm。
22.优选的，步骤s3、s4和s5中的干燥过程均采用37℃干燥3-5h。
23.本发明的最后一个目的在于提供孕期营养因子联合检测用试纸条在孕期检测试剂盒中的应用。
24.本发明的有益效果是：
25.本发明公开了一种孕期营养因子联合检测用试纸条、制备方法及其应用，该试纸条以羧甲基纤维素钠系统进行量子点标记的fa抗体、量子点标记的vb12抗体、量子点标记的vd抗体包被在玻璃纤维素膜上，作为检测探针，利用竞争法原理结合量子点的荧光特性实现了采用荧光免疫层析的方法，同时对fa、vb12、vd进行快速、特异、简便、灵敏的联合检测。
附图说明
26.图1是实施例1中提供的孕期营养因子联合检测用试纸条结构示意图；
27.1是样品垫，2是支撑板，3是玻璃纤维素膜，4是硝酸纤维素膜，5是吸水垫，6是叶酸检测线，7是vb12检测线，8是vd检测线，9是质控线。
具体实施方式
28.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
29.实施例1
30.本实施例提供了一种孕期营养因子联合检测用试纸条，该试纸条结构如图1所示，包括支撑板、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水垫和样品垫，其中，所述支撑板为长条结构，位于最底部，在所述支撑板上方依次设置所述样品垫、所述玻璃纤维素膜、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫；所述硝酸纤维素膜上依次设置有叶酸检测线、vb12检测线、vd检测线和质控线；所述玻璃硝酸纤维素膜包含有量子点标记的fa抗体、量子点标记的vb12抗体、量子点标记的vd抗体和量子点标记的igy。
31.本实施例中的试纸条的结构中，所述样品垫的顶端压住所述玻璃纤维素膜的底端并与之粘贴，所述玻璃纤维素膜的顶端压住所述硝酸纤维素膜的底端并与之粘贴，所述硝酸纤维素膜的顶端被所述吸水滤纸的底端压住并与之粘贴。硝酸纤维素膜上设置的所述叶酸检测线、维生素d检测线、维生素b12检测线之间分别间隔4-6mm，可根据实际的试纸条长度进行设置。
32.实施例2
33.本实施例提供了一种孕期营养因子联合检测用试纸条的制备方法，该方法具体包括以下步骤：
34.s1，制备量子点标记的fa抗体：取0.02m，ph＝6.1的mes缓冲液100ul,混合加入到10ul浓度为100mg/ml的量子点微球颗粒中，然后加入羧甲基纤维素钠100mg，加入活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化15min后，加入β巯基乙醇，终浓度为5mm，加入赖氨酸，终浓度为10mm，反应15min。
35.按照fa抗体与量子点微球质量比为1：20的比例在量子点微球颗粒中加入fa抗体，混匀3h后，8000rpm离心20min，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1h，之后8000rpm离心20min，沉淀颗粒物复溶于分散液，即得量子点标记的fa抗体；
36.s2，制备量子点标记的vb12抗体、vd抗体和鸡igy抗体:按照步骤s1中同样的方法
分别制备量子点标记的vb12抗体、vd抗体和鸡igy抗体；
37.s3，制备包含有抗体混合物的玻璃纤维素膜：将量子点标记的fa抗体、量子点标记的vb12抗体、量子点标记的vd抗体和量子点标记的鸡igy抗体按照质量比为1：1：1:1混合，喷涂于玻璃纤维素膜上，37℃干燥4h，即得量子点标记的fa抗体、量子点标记的vb12抗体、量子点标记的vd抗体、量子点标记的鸡igy抗体混合物标记的玻璃纤维素膜；
38.s4,制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，间隔6mm依次划分叶酸检测线、vb12检测线、vd检测线和质控线，然后分别取fa-bsa、vb12-bsa、vd-bsa和羊抗鸡igy，分别喷涂到对应的叶酸检测线、vb12检测线、vd检测线和质控线上，干燥后即得硝酸纤维素膜；
39.s5，组装试纸条：在塑料板上放置步骤s4制备的硝酸纤维素膜,将步骤s3制备的玻璃纤维素膜压在所述硝酸纤维素膜靠近检测线的一端，然后在玻璃纤维素的一端放置样品垫，硝酸纤维素膜的另一端放置吸水垫，干燥后即完成试纸条的组装过程。
40.其中，组装过程中，采用的所述吸水垫长度为40-45mm，所述吸水垫与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1mm；所述玻璃纤维素膜的长度为6mm，所述玻璃纤维素膜与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1mm；所述样品垫的长度为25mm，所述样品垫与所述玻璃纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1mm。
41.实施例3
42.本实施例提供了一种孕期营养因子联合检测用试纸条的制备方法，该方法具体包括以下步骤：
43.s1，制备量子点标记的fa抗体：取0.02m，ph＝6.5的mes缓冲液100ul,混合加入到10ul浓度为100mg/ml的量子点微球颗粒中，然后加入羧甲基纤维素钠100mg，加入活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化15min后，加入β巯基乙醇，终浓度为5mm，加入赖氨酸，终浓度为10mm，反应15min。
44.按照fa抗体与量子点微球质量比为1：20的比例在量子点微球颗粒中加入hcg抗体，混匀3h后，15000rpm离心10min，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1h，之后15000rpm离心10min，沉淀颗粒物复溶于分散液，即得量子点标记的fa抗体；
45.s2，制备量子点标记的vb12抗体、vd抗体和igy抗体:按照步骤s1中同样的方法分别制备量子点标记的vb12抗体、vd抗体和igy抗体；
46.s3，制备包含有抗体混合物的玻璃纤维素膜：将量子点标记的fa抗体、量子点标记的vb12抗体、量子点标记的vd抗体和量子点标记的鸡igy抗体按照质量比为1：1：1:1混合，喷涂于玻璃纤维素膜上，37℃干燥4h，即得量子点标记的fa抗体、量子点标记的vb12抗体、量子点标记的vd抗体和量子点标记的鸡igy抗体混合物标记的玻璃纤维素膜；
47.s4,制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，间隔8mm依次划分叶酸检测线、vb12检测线、vd检测线和质控线，然后分别取fa-bsa、vb12-bsa、vd-bsa和羊抗鸡igy，分别喷涂到对应的叶酸检测线、vb12检测线、vd检测线和质控线上，干燥后即得硝酸纤维素膜；
48.s5，组装试纸条：在塑料板上放置步骤s4制备的硝酸纤维素膜,将步骤s3制备的玻璃纤维素膜压在所述硝酸纤维素膜靠近检测线的一端，然后在玻璃纤维素的一端放置样品垫，硝酸纤维素膜的另一端放置吸水垫，干燥后即完成试纸条的组装过程。
49.其中，组装过程中，采用的所述吸水垫长度为45mm，所述吸水垫与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为2mm；所述玻璃纤维素膜的长度为8mm，所述玻璃纤维素膜
与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为2mm；所述样品垫的长度为27mm，所述样品垫与所述玻璃纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为2mm。
50.实施例4
51.本实施例提供了本实施例提供了一种孕期营养因子联合检测用试纸条的制备方法，该方法具体包括以下步骤：
52.s1，制备量子点标记的fa抗体：取0.02m，ph＝5.5的mes缓冲液100ul,混合加入到10ul浓度为100mg/ml的量子点微球颗粒中，然后加入羧甲基纤维素钠100mg，加入活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化10min后，加入β巯基乙醇，终浓度为5mm，加入赖氨酸，终浓度为10mm，反应10min。
53.按照fa抗体与量子点微球质量比为1：20的比例在量子点微球颗粒中加入fa抗体，混匀3.5h后，10000rpm离心20min，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1.5h，之后10000rpm离心20min，沉淀颗粒物复溶于分散液，即得量子点标记的fa抗体；
54.s2，制备量子点标记的vb12抗体、vd抗体和igy抗体:按照步骤s1中同样的方法分别制备量子点标记的vb12抗体、vd抗体和igy抗体；
55.s3，制备包含有抗体混合物的玻璃纤维素膜：将量子点标记的fa抗体、量子点标记的vb12抗体、量子点标记的vd抗体、量子点标记的鸡igy抗体按质量比1：1：1:1混合后，喷涂于玻璃纤维素膜上，干燥后即得量子点标记的fa抗体、量子点标记的vb12抗体、量子点标记的vd抗体、量子点标记的鸡igy抗体混合物标记的玻璃纤维素膜；
56.s4,制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，间隔7mm依次划分叶酸检测线、vb12检测线、vd检测线和质控线，然后分别取fa-bsa、vb12-bsa、vd-bsa和羊抗鸡igy，分别喷涂到对应的叶酸检测线、vb12检测线、vd检测线和质控线上，干燥后即得硝酸纤维素膜；
57.s5，组装试纸条：在塑料板上放置步骤s4制备的硝酸纤维素膜,将步骤s3制备的玻璃纤维素膜压在所述硝酸纤维素膜靠近检测线的一端，然后在玻璃纤维素的一端放置样品垫，硝酸纤维素膜的另一端放置吸水垫，37℃下干燥5h后即完成试纸条的组装过程。
58.其中，组装过程中，采用的所述吸水垫长度为42mm，所述吸水垫与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1.5mm；所述玻璃纤维素膜的长度为7mm，所述玻璃纤维素膜与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1.5mm；所述样品垫的长度为26mm，所述样品垫与所述玻璃纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1.5mm。
59.实施例5
60.本实施例提供一种孕期营养因子检测试剂盒，该试剂盒中包括实施例1中提供的孕期营养因子联合检测用试纸条，使用该试剂盒，能够在孕期检测时同时叶酸、维生素b12和维生素d的含量。
61.首先将叶酸、维生素b12和维生素d溶解为多个梯度的标准品溶液，并同时配制空白溶液。分别取标准品和待测样品滴入试纸条样品槽中，将显色完成的试纸条放入荧光免疫层析读数仪中，读取并记录t/c线的发光值，绘制叶酸、维生素b12和维生素d监测标准曲线；将待测样品的t/c值带入标准曲线中，得到叶酸、维生素b12和维生素d浓度结果。
62.为了测试结果，本技术将实施例1中得到的试剂盒进行测试，得到的数据如下表所示：
63.[0064][0065]
通过采用本发明公开的上述技术方案，得到了如下有益的效果：
[0066]
本发明公开了一种孕期营养因子联合检测用试纸条、制备方法及其应用，该试纸条以羧甲基纤维素钠系统进行量子点标记的fa抗体、量子点标记的vb12抗体、量子点标记的vd抗体包被在玻璃纤维素膜上，作为检测探针，利用竞争法原理结合量子点的荧光特性实现了采用荧光免疫层析的方法，同时对fa、vb12、vd进行快速、特异、简便、灵敏的联合检测。
[0067]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视本发明的保护范围。