一种稳心中药组合物的检测方法与流程

本发明涉及一种稳心中药组合物的检测方法，属于药品质量检测方法领域。

背景技术：

1、本发明所述的稳心中药组合物可以为稳心颗粒、稳心片，该产品是由山东步长制药股份有限公司生产，其主要由党参、黄精、三七、琥珀、甘松等成分制备而成。其该药的功效为：益气养阴，活血化瘀。用于气阴两虚，心脉瘀阻所致的心悸不宁，气短乏力，胸闷胸痛；室性早搏、房室早搏见上述证候者。它临床上用于稳定心率失常等疾病，有着显著的临床疗效显著。本技术人对该产品进行了布局多件该产品的相关专利申请，申请号分别为：01131734.5、200410081398.2、200610042976.0、200610042974.1、200810232536.0、200810183930.x、201510145198.7、201610013406.2、201811308826.9、201910483321.4，上述专利保护内容主题大多集中在从组方、制备工艺改进、质量检测成分含量检测、有效物质成分研究、防治变态反应性疾病、骨折临床新用途等。

2、对我公司产品的质量检测方法进行系统梳理可知，cn101088549a公开采用十八烷基硅烷键合相硅胶为填充剂；乙腈-水为流动相，梯度洗脱条件：0-18分钟：乙腈-水配比为1∶9，18-30分钟：乙腈-水配比为34∶66，30-38分钟：乙腈-水配比为9∶1，38-50分钟：乙腈-水配比为1∶9；检测波长为203nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min，并测定三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1含量。然而cn104730193a公开一种稳心颗粒中挥发性成分的检测方法，采用顶空固相微萃取技术，提取稳心颗粒中挥发性成分。并结合利用气相色谱-质谱联技术，共分离鉴定出挥发性成分74个。cn105548425a公开一种采用高效液相法测定三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1含量的步骤，该方法还包括了采用高效液相方法测定人参皂苷rd与党参炔苷含量的步骤。本发明在利用高效液相法测定三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1含量的基础上增加了高效液相法测定人参皂苷rd与党参炔苷的含量，使稳心颗粒的质量控制的指标更加全面；本发明检测方法的精密度、稳定性、重现性好。但上述检测方法在工艺化大生产的过程中，还存在操作步骤复杂、按照现行标准中规定的色谱条件进行试验人参皂苷rg1与干扰峰re未达到有效分离，且供试品制备过程中，弃去的碱液中含有部分目标成分，导致测得含量低于实际值。因此，研发开发一种操作简便、准确度高、且分离度好的检测方法显得尤为必要。

技术实现思路

1、本发明目的在于，提供一种稳心中药组合物的检测方法，该检测方法具有操作简便可行、专属性强、稳定性、重复性可靠，可作为本发明稳心中药组合物的内在质量检测方法。

2、本发明中药组合物检测方法的技术方案具体如下：

3、一种稳心中药组合物的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

4、⑴、供试品溶液的制备：取本发明中药，称定，加入70～90％甲醇，超声处理，再称定重量，用70～90％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；

5、⑵、对照品溶液的制备：取三七皂苷r1对照品、人参皂苷rg1对照品和人参皂苷rb1对照品适量，精密称定，加甲醇制成混合溶液，即得；

6、⑶、色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相：a相为乙腈-b相为水，其梯度洗脱程序为：0-12min，流动相a的体积配比16→19％，流动相b的体积配比84→81％；12～35min，流动相a的体积配比19→24％，流动相b的体积配比81→76％；35～38min，流动相a的体积配比24→28％，流动相b的体积配比76→72％；38～60min，流动相a的体积配比28→31％，流动相b的体积配比72→69％；60～70min，流动相a的体积配比31→43％，流动相b的体积配比69→57％；所述检测柱温度：20～30℃，检测波长190～210nm；

7、⑷、测定法：分别吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。

8、优选的，所述检测方法步骤⑴供试品溶液样品的制备中所述甲醇的浓度为80％。

9、优选的，所述检测方法步骤⑴供试品溶液样品的制备中所述超声处理的功率为400～600w、频率为30～50khz、超声时间为30～60min。

10、优选的，所述检测方法步骤⑴供试品溶液样品的制备中所述超声处理的功率为500w、频率为40khz、超声时间为45min。

11、优选的，所述检测方法步骤⑵对照品溶液的制备中所述三七皂苷r1的浓度为0.0878～0.7024μg/ml、人参皂苷rg1的浓度为0.2830～2.2640μg/ml、人参皂苷rb1的浓度为0.2198～1.7584μg/ml。

12、优选的，所述检测方法步骤⑶的色谱条件为：所述检测柱温度：25℃，检测波长203nm。

13、优选的，所述检测方法步骤⑶的色谱条件为：所述色谱柱的型号为：un-techtabithathermo bds-c18、喆分zafex supfex jx-c18。

14、为了体现突出本发明技术方案创新性，我们将本实验过程中优选的部分实验提供如下。

15、1色谱条件的确定

16、1.1流动相的选择：

17、《中国药典》2015年版一部三七、稳心片和稳心胶囊项下含量测定的色谱条件均以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，采用稳心片、稳心胶囊项下流动相进行测定，结果发现稳心颗粒中人参皂苷rb1色谱峰与附近干扰峰未达到有效分离，影响定量结果的准确性，故根据本品种的测定情况对流动相配比进行调节，最终确定以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱。

18、表1本发明检测方法色谱流动相比例

19、

20、1.2检测波长的选择：

21、原标准的检测方法和《中国药典》2015年版一部稳心片和稳心胶囊项下含量测定的检测波长均为203nm。

22、1.3柱温的选择

23、参照稳心片和稳心胶囊项下，柱温设定为25℃，按照上述流动相进行梯度洗脱，3个成分色谱峰分离效果良好，无干扰；试验发现当柱温设定为30℃、35℃时，人参皂苷rg1与干扰峰分离不佳，故参照稳心片和稳心胶囊方法，规定含量测定的柱温为25℃。

24、1.4耐用性试验

25、使用三种色谱柱：un-tech tabitha5μm，4.6×250mm；thermo bds-c18 5μm，250×4.6mm；喆分zafex supfex jx-c18 5μm，4.6×250mm；按上述色谱条件进行测试；结果表明，三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1色谱峰的峰形较好，试验条件适用范围广。

26、表2色谱柱的考察结果表(样品批号：2005017)

27、

28、1.5色谱条件及系统适用性试验综上所述，

29、色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按下表进行梯度洗脱，流速：1ml/min，柱温25℃。理论板数按人参皂苷rg1峰计算应不低于6000。

30、2供试品溶液制备方法的考察

31、2.1对照品溶液的制备：

32、精密称取三七皂苷r1(批号：110745-201318，以94.0％计)19.46mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用；精密称取人参皂苷rg1(批号：110703-201832，以92.4％计)19.14mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用；精密称取人参皂苷rb1对照品(批号：110704-201827，以91.2％计)20.08mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

33、分别精密量取上述三七皂苷r1对照品溶液3ml、人参皂苷rg1对照品溶液4ml、人参皂苷rb1对照品溶液3ml，置同一50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品混合溶液((三七皂苷r1浓度为0.0439mg/ml、人参皂苷rg1浓度为0.1415mg/ml、人参皂苷rb1浓度为0.1099mg/ml))。

34、2.2提取方法的考察

35、稳心颗粒包含有蔗糖和无蔗糖两种制剂规格，方法学考察所用样品为山东步长制药有限公司提供批号为2005017(平均装量为8.9771g/袋)和2005052(无蔗糖)(平均装量为5.0366g/袋)，下同。

36、考察了超声直接提取和碱洗两种提取方式，具体试验情况如下：

37、方法一(原标准方法)：取装量差异项下的本品，研细，取约2g或lg(无庶糖)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50ml，密塞，称定重量，浸泡12小时，超声处理(功率300w，频率40khz)1小时，放冷，再称定重量，用水饱和的正丁醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，用2％氢氧化钠溶液洗涤2次，每次30ml，弃去碱液，再用正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

38、方法二：取装量差异项下的本品，研细，取约2g或lg(无庶糖)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50ml，密塞，称定重量，浸泡12小时，超声处理(功率500w，频率40khz)1小时，放冷，再称定重量，用水饱和的正丁醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，用浓氨试液洗涤2次，每次30ml，合并碱液，再用水饱和正丁醇溶液洗涤2次，每次25ml，合并正丁醇提取液和洗涤液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

39、方法三：取装量差异项下的本品，研细，取约2g或lg(无庶糖)，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、80％甲醇和60％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)45分钟，取出，放冷，再称定重量，分别用甲醇、80％甲醇和60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

40、分别精密吸取2.1项下对照品溶液及上述供试品溶液各10μl，按确定的色谱条件进行测定，结果见表3和表4。

41、表3提取方法考察结果-稳心颗粒2005017

42、

43、表4提取方法考察结果-稳心颗粒2005052(无蔗糖)

44、

45、

46、由测定结果可知，原标准提取方法测得总含量明显低于其他方法，超声提取方法测得总量稍高于碱洗后碱液反洗的方法，采用超声提取直接进样，三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1均能达到有效分离，故为了减化操作，选择直接超声提取。甲醇、80％甲醇和60％甲醇提取效率无明显差异，由于稳心颗粒2005017样品甲醇超声提取的供试品溶液在24h内有颗粒状物质析出，故提取溶剂选择80％甲醇。

47、2.3提取方式考察

48、超声提取方法；取装量差异项下的本品，研细，取约2g或lg(无庶糖)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)45分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

49、回流提取方法：取装量差异项下的本品，研细，取约2g或lg(无庶糖)，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，水浴回流提取1小时，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

50、分别精密吸取2.1项下对照品溶液及上述供试品溶液各10μl，按确定的色谱条件进行测定，结果见表5和表6

51、表5提取方式考察结果-稳心颗粒2005017

52、

53、表6提取方式考察结果-稳心颗粒2005052(无蔗糖)

54、

55、

56、由测定结果可知，超声提取和回流提取没有明显差异，为简化操作，选择超声提取方式。

57、2.4提取时间的考察

58、取装量差异项下的本品，研细，取约2g或lg(无庶糖)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率500w，频率40khz)20、30、45和60分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

59、分别精密吸取2.1项下对照品溶液及上述供试品溶液各10μl，按确定的色谱条件进行测定，结果见表7和表8。

60、表7提取时间考察结果-稳心颗粒2005017

61、

62、表8提取时间考察结果-稳心颗粒2005052

63、

64、由测定结果可知，为保证提取完全，确定提取方法为超声提取45分钟。

65、2.5取样量的考察

66、取装量差异项下的本品，研细，分别取约1.5g、2g、2.5g或0.5g、lg、1.5g(无庶糖)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密入加80％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)45分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

67、分别精密吸取2.1项下对照品溶液及上述供试品溶液各10μl，按确定的色谱条件进行测定，结果见表9和表10。

68、表9取样量考察结果-稳心颗粒2005017

69、

70、表10取样量考察结果-稳心颗粒2005052

71、

72、由测定结果可知，为保证提取完全以及取样的均匀性，确定稳心颗粒取样量为2g或1g(无蔗糖)。

73、本发明检测方法的有益效果：

74、1.与原有标准相比较，本发明检测方法中供试品制备步骤大为简化，具体为：将原来“水饱和的正丁醇”提取溶剂更换为“80％甲醇”，以及将原来“浸泡12小时后超声，碱洗后碱液反洗”步骤优化为“超声提取”，这使得原有的操作步骤得以简便，可行，且操作时间大为减少。

75、2.本发明还将原有的色谱条件进行优化，最终得到最佳的色谱条件。其梯度洗脱程序为：0-12min，流动相a的体积配比16→19％，流动相b的体积配比84→81％；12～35min，流动相a的体积配比19→24％，流动相b的体积配比81→76％；35～38min，流动相a的体积配比24→28％，流动相b的体积配比76→72％；38～60min，流动相a的体积配比28→31％，流动相b的体积配比72→69％；60～70min，流动相a的体积配比31→43％，流动相b的体积配比69→57％，并使得人参皂苷rb1色谱峰与附近干扰峰达到有效分离。

76、3.本发明检测方法学考察，精密度试验结果：三七皂苷峰面积r1 rsd(％)为0.96，人参皂苷rg1峰面积rsd(％)为1.21，人参皂苷rb1峰面积rsd(％)为1.09。稳定性试验结果：三七皂苷峰面积r1 rsd(％)为1.76，人参皂苷rg1峰面积rsd(％)为1.23，人参皂苷rb1峰面积rsd(％)为1.53。这表明，供试品溶液在25小时内稳定性良好。重复性试验结果：三七皂苷峰面积r1 rsd(％)为1.57～1.79，人参皂苷rg1峰面积rsd(％)为1.05～1.98，人参皂苷rb1峰面积rsd(％)为0.97～1.32。这表明，该检测方法重复性良好。样品的加样回收率试验结果可知：三七皂苷的r1平均回收率(％)为97.86～98.33，rsd(％)为1.74～1.87。人参皂苷rg1的平均回收率(％)为95.47～95.86，rsd(％)为1.74～1.68，人参皂苷rb1峰面积rsd(％)为95.53～95.69，rsd(％)为1.73～1.99。这表明，该检测方法加样回收率良好。综上所述，本发明检测方法的重新性、稳定性、可靠性良好，可以作为本发明稳心中药组合物内在质量检测方法，并应于该产品的产业化生产质量内控方法。