一种基于相分离研究磷酸化p53稳定性以及细胞内定位的方法

1.本发明属于分子生物学和细胞生物学领域，具体涉及一种基于相分离研究磷酸化p53稳定性以及细胞内定位的方法。


背景技术：

2.p53基因位于人类17号染色体(17p13.1)的短臂上，编码具有393个氨基酸和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为53kda的核内磷酸化蛋白。p53是一种重要的肿瘤抑制因子，参与了与dna修复、细胞周期阻滞、衰老、凋亡、自噬和新陈代谢相关的许多过程。在未受压力的细胞中，p53通常是一种短暂存在的蛋白质，主要通过其负调控因子mdm2维持在低水平，一旦发生dna损伤或其他压力，p53就会通过广泛的翻译后修饰(例如磷酸化) 被激活并稳定。例如，ser392磷酸化可以增加p53的稳定性、增强四聚体形成并调节p53对特定和非特定dna位点的结合亲和力。
3.尽管进行了数十年的深入研究，因为p53复杂的信号传导，我们对p53信号级联的理解仍然不完整。细胞内的研究容易受到多种未知因素的影响，体外研究则难以还原p53在细胞内不均匀分布。一方面，虽然p53通常均匀分布在正常细胞核中，但压力下p53可以在局部富集以高效行驶功能；另一方面，在癌细胞和肿瘤组织中常常观察到p53蛋白聚集体，这会导致p53原有功能丧失甚至导致致癌活性。
4.因此，需要开发一套既可以模拟体内环境，又可以明确单一位点磷酸化所造成影响的p53 体外研究体系。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种既可以模拟体内环境，又可以明确位点磷酸化所造成影响的 p53体外研究体系。
6.本发明所采取的技术方案是：
7.本发明的第一方面，提供一种体系，包括：med1-idr蛋白、pol ii蛋白、p53蛋白和p53 靶dna，以及相分离诱导剂。
8.在本发明的一些实施方式中，所述p53蛋白、med1-idr蛋白、pol ii蛋白和靶dna的质量比为(8～12)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：1。
9.在本发明的一些优选实施方式中，所述p53蛋白、med1-idr蛋白、pol ii蛋白和靶dna 的质量比为10:1:1:1。
10.在本发明的一些实施方式中，所述p53蛋白为p53蛋白、磷酸化p53蛋白或模拟磷酸化 p53蛋白。
11.在本发明的一些实施方式中，所述p53蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述模拟磷酸化p53蛋白为seq id no.2中第392位的丝氨酸突变为天冬氨酸。
12.在本发明的一些实施方式中，所述med1-idr蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所
示；所述pol ii蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述p53靶dna的序列如seq id no.5 所示。
13.在本发明的一些实施方式中，所述相分离诱导剂为拥挤剂。
14.在本发明的一些实施方式中，所述拥挤剂占体系的质量比为2～50％，拥挤剂在较大范围内都可以诱导相分离。
15.在本发明的一些实施方式中，所述拥挤剂为peg-8000、peg-600、peg-4000、ficoll、 sucrose。
16.在本发明的一些实施方式中，所述p53蛋白被荧光标记。
17.在本发明的一些实施方式中，所述荧光标记可以为荧光标签蛋白或荧光探针。
18.在本发明的一些实施方式中，所述体系中包含荧光标签蛋白。
19.在本发明的一些实施方式中，所述荧光标签蛋白为egfp、cfp、yfp、mcherry、gfp。
20.本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述体系在研究p53液滴形成、磷酸化p53稳定性以及磷酸化调节p53信号转导方面的应用。
21.本发明的第二方面，提供一种胞外研究p53对dna损伤后修复的调控方法，通过本发明第一方面所述的体系诱导p53液滴，监测p53对dna损伤后修复进程的调控作用。
22.在本发明的一些实施方式中，所述方法可以在体外模拟相分离体系，也可研究单一位点磷酸化所造成影响的p53体外研究体系。
23.本发明的第三方面，提供一种细胞内研究p53对dna损伤后修复的调控方法，通过dna 损伤诱导胞内的p53蛋白形成p53液滴，并观测液滴的性质。
24.在本发明的一些实施方式中，所述dna损伤为紫外辐射诱导或化学试剂诱导等常见的 dna损伤方式。
25.在本发明的一些实施方式中，可以通过荧光标签、荧光探针等方式定位或监测胞内p53 的状态。
26.在本发明的一些实施方式中，可以通过体外构建连接荧光标签的p53表达载体转染进细胞进行定位和监测。
27.在本发明的一些实施方式中，p53蛋白为p53蛋白、磷酸化p53蛋白或模拟磷酸化p53 蛋白。
28.本发明的有益效果是：
29.本发明提供了一种基于相分离研究p53调控dna修复隔室形成的方法。通过蛋白质相分离技术在细胞内构建蛋白质液滴，利用dna损伤后会在局部形成修复隔室，通过将荧光标签连到p53上可以通过显微镜直接观察p53参与修复隔室的空间情况。利用分子生物学技术，可以研究某一个位点的翻译后修饰对p53参与的dna修复隔室形成的影响，从而解决细胞内p53信号通路复杂、结果不易判定的问题。
30.本发明中实验条件可控制，体外表达的蛋白不经历磷酸化修饰，利用分子生物学，便于研究指定位点对p53参与的dna损伤隔室的潜在影响；而且相分离液滴在局部增加了蛋白的浓度，更加真实的模拟体内不均匀分布的环境；通过标签蛋白，过程和结果可视化，本发明技术在研究p53参与的基因表达的空间调控方面将有广泛应用。
附图说明
31.图1为实施例1中通过相分离和模拟转录复合物，在体外直观观测野生型和模拟磷酸化的p53的稳定性。图1a为p53-wt-egfp和p53-s392d-egfp在体外刚刚形成液滴的图像，比例尺，2μm；图1b为在模拟转录复合物中加入p53-wt-egfp和p53-s392d-egfp的结果，其中附上了颜色编码强度，比例尺，5μm。
32.图2为实施例2中在细胞内观测的结果。图2a为转染p53-wt-egfp后，hela细胞和被紫外线照射损伤的细胞的代表性显微镜图像，比例尺，2μm；图2b为在对损伤有反应的单个损伤处进行光漂白，监测荧光恢复和光漂白恢复代表图像和曲线，数据表示为平均值
±
sd(n ＝3次独立实验)；图2c为p53-wt-egfp和p53-s392a-egfp转染hela细胞后，对其进行uv 照射损伤细胞后的代表显微镜图像，比例尺，2μm；图2d为单个细胞中液滴总面积，比例尺， 2μm。
具体实施方式
33.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
34.实施例1
35.本实施例使用体外纯化p53，med1-idr-idr，pol ii和靶dna构建模拟的dna损伤隔室(也可称为dna repair compartments)，利用相分离可视化观测隔室稳定性和p53参与的情况。
36.1)通过pcr从含有所需序列的模板质粒上扩增出相应的dna片段。在扩增的引物上加入同源臂或linker序列。通过dna琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的下述蛋白对应的dna片段：egfp、p53-wt-egfp、p53-s392d-egfp、med1-idr、pol ii等。其中 egfp的氨基酸序列如序列列表中的seq id no.1；p53-wt的氨基酸序列如序列列表中的seqid no.2，p53-s392d的氨基酸序列与p53-wt相同，除了392位的丝氨酸突变为带负电的天冬氨酸；所述med1-idr的序列如序列表中的seq id no.3；所述pol ii的序列如序列列表中的seq id no.4；p53靶dna的序列如序列列表中的seq id no.5。
37.其中，seq id no.1：mvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkl tlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkdd gnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikv nfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefv taagitlgmdelyk。
38.seq id no.2：meepqsdpsvepplsqetfsdlwkllpennvlsplpsqamddlmlspd dieqwftedpgpdeaprmpeaappvapapaaptpaapapapswplsssvpsqktyqgsygfr lgflhsgtaksvtctyspalnkmfcqlaktcpvqlwvdstpppgtrvramaiykqsqhmt evvrrcphhercsdsdglappqhlirvegnlrveylddrntfrhsvvvpyeppevgsdctti hynymcnsscmggmnrrpiltiitledssgnllgrnsfevrvcacpgrdrrteeenlrkkg ephhelppgstkralpnntssspqpkkkpldgeyftlqirgrerfemfrelnealelkdaqa gkepggsrahsshlkskkgqstsrhkklmfktegpdsd。
39.seq id no.3：hhsgsqgpllttgdlgkektqkrvkegngtsnstlsgpgldskpgkr srtpsndg
kskdkppkrkkadtegkspshsssnrpftpptstggskspgsagrsqtppgvatp pipkitiqipkgtvmvgkpsshsqytssgsvsssgskshhshsssssssastsgkmkssksegs sssklsssmyssqgssgssqsknssqsggkpgsspitkhglssgssstkmkpqgkpsslmnps lskpnispshsrppggsdklaspmkpvpgtppsskakspissgsggshmsgtssssgmksssg lgssgslsqktppssnsctassssfsssgssmsssqnqhgsskgkspsrnkkpsltavidklkh gvvtsgpggedpldgqmgvstnssshpmsskhnmsggefqgkreksdkdkskvstsgssv dsskktsesknvgstgvakiiiskhdggspsikakvtlqkpgessgeglrpqmassknygspl isgstpkhergspshskspaytpqnldsesesgssiaeksyqnspssddgirplpeystekhkk hkkekkkvkdkdrdrdrdkdrdkkkshsikpeswskspissdqslsmtsntilsadrpsrl spdfmigeedddlmdvalign。
40.seq id no.4：hmysptspayeprspggytpqspsysptspsysptspsysptspnysptsp sysptspsysptspsysptspsysptspsysptspsysptspsysptspsysptspsysptspsyspt spsysptspsysptspsysptspsysptspsysptspnysptspnytptspsysptspsysptspny tptspnysptspsysptspsysptspsyspssprytpqsptytpsspsyspsspsysptspkytpts psyspsspeytptspkysptspkysptspkysptsptyspttpkysptsptysptspvytptspky sptsptysptspkysptsptysptspkgstysptspgysptsptysltspaispddsdeen。
41.seq id no.5：atcaggaacatgtcccaacatgttgagctc。
42.所使用的引物如表1所示。
43.表1相关扩增引物
[0044][0045][0046]
所使用的pcr扩增体系如表2所示。
[0047]
表2 pcr反应体系
[0048]
pcr反应体系总体积50μlkod fx高保真酶0.5μl2
×
kod buffer25.0μldntps10.0μlprimer 11.0μlprimer 21.0μl模板1ng/μlddh2o补足至50μl
[0049]
所使用的pcr反应程序如表3所示。
[0050]
表3 pcr反应程序
[0051][0052]
2)将5μl的无缝连接酶与总体积为5μl的回收所得基因片段和大肠杆菌表达载体pet28a 混合均匀，其中基因片段和载体质量分数之比为3：1。将以上体系静置与50℃中30min。取分装好的感受态细胞，转入10μl重组质粒，混合均匀后冰浴30min；冰浴后，向感受态细胞中加入800μl lb液体培养基，37℃、200rpm孵育45min；孵育结束后，5000rpm离心5min，收集菌体并弃上清(保留200μl左右)，在超净台中重悬后涂布至相应抗性平板，37℃培养 18h。
[0053]
3)选取2)中转化所得平板上的单菌落转化子进行测序。对于构建成功的重组质粒，接入含有硫酸卡拉霉素的10ml lb液体培养基中，37℃、200rpm过夜培养。
[0054]
4)过夜培养后的种子液接种于有硫酸卡拉霉素的100ml lb液体培养基中，37℃、200rpm 培养至od
600
值到达0.6左右，加入50mm iptg和150μm znso4诱导菌体表达蛋白，16℃、 200rpm孵育18h。
[0055]
5)将100ml培养基所得菌体重悬于15ml含有蛋白酶抑制剂(roche)，pmsf和1mm dtt 的buffer a(50mm tris，0.6m nacl，ph 7.5)中，在冰上超声裂解细胞30min，3s开，3s 关。随后在4℃下以10,000rpm离心40分钟清除不融性杂质，收集上清液，并用0.22μm滤膜过滤。所得粗蛋白溶液用ni-nat柱纯化，获得目的蛋白p53-wt-egfp、p53-s392d-egfp、 med1-idr、pol ii。
[0056]
6)使用amicon ultra离心过滤器(10k mwco，millipore)将纯化后的重组蛋白更换缓冲液并浓缩蛋白质浓度至50μm。
[0057]
7)在混合好med1-idr、pol ii和p53靶dna以在体外模拟转录复合物中，分别加入 p53-wt-egfp或p53-s392d-egfp，并加入占体系质量比5％的peg-8000作为分子拥挤剂。所述p53、med1-idr、pol ii和靶dna的比例为：10:1:1:1，其中dna浓度过高可能会导致液滴溶解。随后立即将蛋白质溶液加载到自制的隔室中，该室包括由两条平行的双面胶带条连接的载玻片和盖玻片(隔离室参考：boija,a.,et al.,transcription factors activate genesthrough the phase-separation capacity of their activation domains.cell,2018.175(7):p. 1842-+)。然后使用共聚焦显微镜的60x油浸物镜对载玻片进行成像，并对观测到的液滴的荧光强度进行定量。在孵育2小时后，再次对隔室中的蛋白进行代表图像采集。
[0058]
实验结果如图1所示，其中图1a报告了，液滴形成后孵育两小时，开始变成不规则
形状，而p53-s392d-egfp依然维持了较好的液滴形态，通过相分离成像可以看到， p53-s392d-egfp液滴的性质更稳定；图1b在液滴中增加了med1-idr、dna和pol ii，通过荧光强度进行定量可以看到，p53-s392d-egfp可更高效地被转录相关因子识别和募集。
[0059]
实施例2
[0060]
本实施例看其细胞内可视化定位，并可以进行胞内验证。p53是一种核内磷酸化蛋白，在收到dna损伤时，ser392点会发生磷酸化。于是，在这里申请人将ser392突变为不能发生磷酸化的ala392，以此作为阴性对照。
[0061]
1)通过pcr从含有所需序列的模板质粒上扩增出相应的dna片段。在扩增的引物上加入同源臂或linker序列(引物如实施例1)。通过dna琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的下述蛋白对应的dna片段：p53-wt-egfp，p53-s392a-egfp等。其中egfp的氨基酸序列如序列列表中的seq id no.1，p53-wt的氨基酸序列如序列列表中的seq id no.2， p53-s392d的氨基酸序列与p53-wt相同，除了392位的丝氨酸突变为无法被磷酸化的丙氨酸。
[0062]
2)通过分子克隆等步骤得到连接到哺乳细胞表达载体pcdna3上的(引物： pcdna3-r:ggatccgacctttcgctttt(seq id no.20)；pcdna3-f： agggccctattctatagtgt(seq id no.21))融合蛋白p53-wt-egfp或p53-s392a-egfp 的表达质，测序后转化到人宫颈癌细胞系hela细胞中。
[0063]
3)将人宫颈癌细胞系hela细胞在标准无菌细胞培养条件下培养(37℃，湿润气氛下生长，5％二氧化碳)。细胞系在含有10％fbs(bi)的高葡萄糖dmem(gibco)中作为单层培养。聚乙烯亚胺(polysciences)转染试剂用于在所有质粒的瞬时转染。转染所用的培养基为不含血清的opti-mem。
[0064]
4)转染完5小时，吸去转染液，换上新鲜的培养基。继续培养24小时。样品放在黑暗环境中用锡箔纸包裹培养。
[0065]
5)免疫染色前，在室温下用4％pfa固定10分钟。将细胞在pbs中的透化缓冲液(0.1％ triton x-100)中室温孵育20分钟，并在室温下封闭(3％bsa，2％山羊血清，pbs)60分钟。用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染色并在共聚焦显微镜下进行代表图像采集。
[0066]
6)将板暴露于uv辐射后重新采集图像。对视野中的液滴进行光漂白后荧光恢复(frap) 测定。漂白图像是通过128
×
128像素的光子收集获得的。frap期间的图像是用488nm激光线以20％的激光功率采集的，漂白直径为1-3μm的圆形范围，漂白时间为1s。在漂白前采集了2张图像作为对照，在漂白后的规定时间内每3s进行一次成像。采用fiji imagej对荧光恢复数据进行三次独立重复评价。
[0067]
实验结果见图2a，可以看出，原本均匀分布在细胞核中的p53蛋白，在受到紫外辐射诱导的dna损伤后形成了凝聚物，并且这些凝聚物具有光漂白恢复能力(图2b)，符合相分离液滴的特征。相比于野生型，s392a液滴的数量和面积都发生了减少(图2c和图2d)。
[0068]
综上所述，实施例1是从体外的角度通过拥挤剂诱导液滴形成，实施例2是从细胞内的角度dna损伤诱导胞内形成损伤隔室，研究p53磷酸化如何调节p53参与损伤隔室的形成。
[0069]
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出
各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。