一种用于抗原蛋白检测的纳米颗粒及其制备方法

1.本发明涉及病毒抗原蛋白检测领域，尤其涉及一种用于抗原蛋白检测的纳米颗粒及其制备方法和试纸条。


背景技术：

2.病毒是一种个体微小，结构简单，只含有一种核酸(dna或rna)，必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物。人体感染病毒会影响健康，甚至造成机体损伤，而在特定环境下病毒可能发生大规模传播，从而对整个区域的生产生活带来不便。而为了控制病毒的扩散蔓延，快速、准确地鉴别诊断个体是否感染病毒十分重要。
3.现有技术中普遍使用的病毒检测方法有免疫层析法和荧光pcr检测法。免疫层析法利用双抗夹心法将目标检测物捕捉，通过免疫层析检测板上测试线与控制线的显现情况对病毒的存在与否形成初步判断。但免疫层析法准确性和灵敏度较低，存在肉眼观察的偏差。荧光pcr检测法，即在常规pcr(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)的基础上加入荧光探针修饰，随着pcr产物的累积荧光强度不断扩增，来实现对目标物的痕量检测。但荧光pcr法所需时间较长，不适用于快检。因此现有的病毒检测方法无法同时实现快速及准确的检测。
4.因此，现有技术还有待于改进和发展。


技术实现要素：

5.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于抗原蛋白检测的纳米颗粒及其制备方法，旨在解决采用现有病毒检测方法无法快速且准确地检测特定病毒的问题。
6.本发明的技术方案如下：
7.本发明的第一方面，提供一种用于抗原蛋白检测的纳米颗粒的制备方法，包括步骤：
8.提供初始纳米颗粒溶液；
9.将所述初始纳米颗粒溶液与拉曼报告分子溶液混合进行偶联反应，得到表面修饰的纳米颗粒溶液，所述拉曼报告分子的官能团同时包含巯基和氰基；
10.将所述表面修饰的纳米颗粒溶液与抗体溶液混合进行静电吸附，得到用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液。
11.在一种实施方式中，所述拉曼报告分子为(2-巯基苯基)氰酸，2-氰基-1,4-苯基二硫醇，3,5-二氰基苯硫酚，4-氰基苯硫酚，2-氰基-4,4
’‑
双(巯甲基)联苯，4-巯基苯甲腈，5,5
’‑
二硫代双(2-氰基苯甲酸)，牛血清蛋白，4-氰基硫代苯甲酸和5,5
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二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-氰基苯甲酸酯)中的一种。
12.在一种实施方式中，所述将所述初始纳米颗粒溶液与拉曼报告分子溶液混合进行偶联反应，得到表面修饰的纳米颗粒溶液，包括：
13.将初始纳米颗粒溶液与所述拉曼报告分子溶液按所述初始纳米颗粒与所述拉曼报告分子摩尔比为100:1-300:1的比例混合后在室温下搅拌15-30min，得到第一混合溶液；
14.将所述第一混合溶液的ph调节为7.2-8.0，得到所述表面修饰的纳米颗粒溶液。
15.在一种实施方式中，所述初始纳米颗粒溶液为纳米金溶液或纳米银溶液，所述拉曼报告分子溶液为所述拉曼报告分子的乙醇溶液。
16.在一种实施方式中，所述将所述表面修饰的纳米颗粒溶液与抗体溶液混合进行静电吸附，得到用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液，包括：
17.将所述表面修饰的纳米颗粒溶液与所述抗体溶液混合后震荡培育，得到第二混合溶液；
18.将所述第二混合溶液与稳定剂溶液混合后震荡培育，得到第三混合溶液；
19.将所述第三混合溶液离心后去除上清液，用保护液稀释后得到用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液。
20.在一种实施方式中，所述将所述表面修饰的纳米颗粒溶液与抗体溶液混合后震荡培育，得到第二混合溶液，具体包括：
21.将所述表面修饰的纳米颗粒溶液与所述抗体溶液按所述表面修饰的纳米颗粒与所述抗体的质量比为50:1-200:1的比例混合后在37℃条件下震荡培育1-3h，得到所述第二混合溶液。
22.在一种实施方式中，所述将所述第二混合溶液与稳定剂溶液混合后震荡培育，得到第三混合溶液，具体包括：
23.将所述稳定剂溶液与所述第二混合溶液按体积比为5:1-10:1的比例混合后在37℃条件下震荡培育1-3h，得到所述第三混合溶液，所述稳定剂溶液为牛血清蛋白-磷酸缓冲液。
24.在一种实施方式中，所述将所述第三混合溶液离心后去除上清液，用保护液稀释后得到用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液，具体包括：
25.将所述第三混合溶液以5000-15000r/min的速度离心5-15min，去除上清液；
26.使用10-30μl保护液稀释离心后的絮状沉淀，得到所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液，所述保护液为牛血清蛋白-硼酸钠水溶液或磷酸缓冲液、牛血清蛋白、蔗糖、聚山梨醇酯-20以及聚乙二醇辛基苯基醚的混合液。
27.本发明的第二方面，提供一种用于抗原蛋白检测的纳米颗粒，通过如上所述的用于抗原蛋白检测的纳米颗粒的制备方法制得，且将所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒用于检测病毒的抗原蛋白。
28.本发明的第三方面，提供一种用于抗原蛋白检测的试纸条，包括依次连接的样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜和吸收垫，在所述硝酸纤维素膜上设有测试线和控制线，并将如上所述的用于抗原蛋白检测的纳米颗粒的溶液滴加在所述结合垫上。
29.有益效果：本发明提供了一种用于抗原蛋白检测的纳米颗粒及其制备方法，包括提供初始纳米颗粒溶液；将所述初始纳米颗粒溶液与拉曼报告分子溶液混合进行偶联反应，得到表面修饰的纳米颗粒溶液，所述拉曼报告分子的官能团同时包含巯基和氰基；以及将所述表面修饰的纳米颗粒溶液与抗体溶液混合进行静电吸附，得到用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液。通过所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒，可以特异性地捕获病毒的抗原蛋
白，从而结合免疫层析法和拉曼光谱表征快速且高效地检出特定抗原蛋白，实现快速且准确地检测特定病毒。
附图说明
30.图1为本发明实施例中用于抗原蛋白检测的纳米颗粒的制备流程图。
31.图2为本发明实施例中用于抗原蛋白检测的试纸条的示意图。
32.图3为本发明实施例中制备的初始纳米颗粒溶液的透射电子显微镜(tem)表征结果图。
具体实施方式
33.本发明提供一种用于抗原蛋白检测的纳米颗粒及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
34.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
35.表面增强拉曼散射(sers)克服了拉曼光谱灵敏度低的缺点，当纳米级别的金、银粒子之间的间隔减小到一定范围时(小于2nm)，这些纳米结构产生的等离子激元共振，使其附近的电磁场迅速增强，从而致使拉曼信号也大大增强。sers效应一直以来有着较为广泛的应用，特别是在物质的痕量检测方面。本发明通过对纳米颗粒进行拉曼报告分子的修饰，利用sers效应，得到拉曼信号增强的纳米颗粒，实现对病毒抗原蛋白的痕量检测。相对于免疫层析法和荧光pcr检测法，本发明制备得到的用于抗原蛋白检测的纳米颗粒利用拉曼光谱可以实现快速检测。以针对病毒的核衣壳蛋白(n蛋白)为例，本发明制备得到的用于抗原蛋白检测的纳米颗粒可以将抗原蛋白的检测限降低到1pg-100fg n蛋白/ml，约为ct值36-37。可选地，所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒特还可以用于针对病毒的刺突蛋白(s蛋白)检测。
36.具体地，本发明首先通过在金纳米颗粒或银纳米颗粒上进行偶联反应，通过拉曼报告分子对金纳米颗粒或银纳米颗粒进行表面修饰，得到表面修饰的纳米颗粒；然后将对应抗原蛋白的特定抗体通过静电吸附包裹在表面修饰的纳米颗粒的表面空位上，得到用于抗原蛋白检测的纳米颗粒。其中，所述拉曼报告分子为官能团同时包括巯基和氰基的物质，从而保证所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒可以利用sers效应在拉曼光谱表征结果中特异性地显示出来。本发明所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒与拉曼光谱以及免疫层析法相结合，可以针对特定病毒的抗原蛋白进行捕获，从而实现对特定病毒的快速检测，并且检测限低，检测灵敏度高。
37.在本发明所述的用于抗原蛋白检测的纳米颗粒的制备方法中，如图1所示，包括步骤：
38.s100、提供初始纳米颗粒溶液；
39.s200、将所述初始纳米颗粒溶液与拉曼报告分子溶液混合进行偶联反应，得到表面修饰的纳米颗粒溶液，所述拉曼报告分子的官能团同时包含巯基和氰基；
40.s300、将所述表面修饰的纳米颗粒溶液与抗体溶液混合进行静电吸附，得到用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液。
41.采用本发明所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒的制备方法，可以得到能够快速和痕量检测病毒的抗原蛋白的纳米颗粒，结合拉曼光谱仪，利用sers效应可以快速得出样品中是否存在特定的病毒。可选地，所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒特异性地用于针对新冠肺炎病毒的n蛋白检测，且检出限降低到1pg-100fg n蛋白/ml。可选地，所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒特还可以用于针对甲流、乙流等病毒的抗原蛋白检测。
42.具体地，所述拉曼报告分子为(2-巯基苯基)氰酸，2-氰基-1,4-苯基二硫醇，3,5-二氰基苯硫酚，4-氰基苯硫酚，2-氰基-4,4
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双(巯甲基)联苯，4-巯基苯甲腈，5,5
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二硫代双(2-氰基苯甲酸)，牛血清蛋白，4-氰基硫代苯甲酸和5,5
’‑
二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-氰基苯甲酸酯)中的一种，从而保证可以在检测过程中通过拉曼光谱表征结果特异性显示出来。具体地，针对具有巯基的拉曼报告分子，在表面修饰过程中，所述拉曼报告分子通过硫与纳米颗粒的共价偶联修饰在所述纳米颗粒表面，并通过其他基团作为特征基团；针对具有氰基的拉曼报告分子，通过其他共价方式与纳米颗粒表面偶联，同时在最终的检测表征过程中利用氰基在2000-2500cm-1
处的振动峰作为特征峰，周围没有其他杂峰，因此可以快速准确地判断拉曼报告分子是否存在。而本发明选取同时包含巯基和氰基的分子作为拉曼报告分子，既保证了拉曼报告分子与纳米颗粒表面稳定且牢固的连接，同时在最终的检测表征结果中可以清晰地显示用于抗原蛋白检测的纳米颗粒是否存在，从而实现快速准确地检测。
43.在一种实施方式中，在所述步骤100之前，还包括步骤：
44.s90、制备粒径为30-50nm的初始纳米颗粒溶液。
45.具体地，所述初始纳米颗粒溶液为纳米金溶液或纳米银溶液。
46.可选地，通过柠檬酸钠水热还原法获取纳米金溶液，包括将2％(w/w)氯金酸水溶液加热搅拌至微沸，之后加入1％(w/w)柠檬酸钠水溶液，控制微沸回流直至溶液颜色变为酒红色，从而获取粒径为30-50nm的纳米金溶液。
47.可选地，将硝酸银通过柠檬酸钠水热还原法获取所述纳米银溶液，包括将2％(w/w)硝酸银水溶液加热搅拌至微沸，之后加入1％(w/w)柠檬酸钠水溶液，控制微沸回流直至溶液颜色变为灰黑色，从而获取粒径为30-50nm的纳米银溶液。
48.在一种实施方式中，所述步骤s200包括：
49.s210、将初始纳米颗粒溶液与所述拉曼报告分子溶液按所述初始纳米颗粒与所述拉曼报告分子摩尔比为100:1-300:1的比例混合后在室温下搅拌15-30min，得到第一混合溶液；
50.s220、将所述第一混合溶液的ph调节为7.2-8.0，得到所述表面修饰的纳米颗粒溶液。
51.具体实施时，所述初始纳米颗粒溶液为步骤s90中制备得到的粒径为30-50nm的纳米金溶液或纳米银溶液，所述拉曼报告分子溶液为将拉曼报告分子溶解于乙醇后得到的溶液。
52.具体实施时，通过调整拉曼报告分子溶液的浓度，从而在混合所述初始纳米颗粒溶液与所述拉曼报告分子溶液时保证所述初始纳米颗粒与所述拉曼报告分子摩尔比为
100:1-300:1。可选地，调整所述拉曼报告分子溶液的浓度，使所述初始纳米颗粒与所述拉曼报告分子摩尔比为150:1-250:1。通过设置初始纳米颗粒与拉曼报告分子的摩尔比在特定范围，以保证拉曼报告分子稳定偶联在纳米颗粒的表面，同时保证所述纳米颗粒的表面依然留有间隙，以作进一步的表面修饰。
53.具体实施时，利用k2co3水溶液调节所述第一混合溶液的ph值，并将所述第一混合溶液的ph值保持在7.2-8.0。可选地，将所述第一混合溶液的ph值保持在7.4-7.7。通过调节所述第一混合溶液的ph，以确保所述初始纳米颗粒溶液的稳定，避免反应过程中发生团聚影响最终的表面修饰结果。
54.在一种实施方式中，所述步骤s300包括：
55.s310、将所述表面修饰的纳米颗粒溶液与所述抗体溶液混合后震荡培育，得到第二混合溶液；
56.s320、将所述第二混合溶液与稳定剂溶液混合后震荡培育，得到第三混合溶液；
57.s330、将所述第三混合溶液离心后去除上清液，用保护液稀释后得到用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液。
58.步骤s310中，在一种实施方式中，将所述表面修饰的纳米颗粒溶液与所述抗体溶液按所述表面修饰的纳米颗粒与所述抗体的质量比为50:1-200:1的比例混合，并放置于37℃条件下震荡培育1-3h，从而得到所述第二混合溶液。可选地，通过调整所述抗体溶液中抗体的浓度，从而保证所述表面修饰的纳米颗粒与所述抗体的质量比为75:1-150:1。由于所述表面修饰的纳米颗粒在合成过程中，通过调整初始纳米颗粒与拉曼报告分子的摩尔比，使得所述表面修饰的纳米颗粒的表面依然留有空隙，所述抗体可以通过静电吸附的形式结合在所述表面修饰的纳米颗粒表面，形成可以对特定抗原蛋白起指示作用的拉曼探针分子。通过设置所述表面修饰的纳米颗粒与所述抗体的质量比，以保证抗体分子可以与所述表面修饰的纳米颗粒充分接触以完成静电吸附，同时避免团聚现象的产生，保证所述第二混合溶液的稳定性。
59.步骤s320中，在一种实施方式中，将所述稳定剂溶液与所述第二混合溶液按体积比为5:1-10:1的比例混合后在37℃条件下震荡培育1-3h，得到所述第三混合溶液。
60.在具体实施时，所述稳定剂溶液为牛血清蛋白-磷酸缓冲液，将含有5％牛血清蛋白(bsa)的磷酸缓冲液(pb)加入所述第二混合溶液中震荡培育，从而得到所述第三混合溶液。通过所述稳定剂溶液使得所述第三混合溶液中的纳米颗粒间静电平衡，从而避免发生团聚，以提高所述第三混合溶液的稳定性并延长所述第三混合溶液的保存时间。
61.步骤s330中，在一种实施方式中，将所述第三混合溶液以5000-15000r/min的速度离心5-15min，去除上清液后使用10-30μl保护液稀释离心后的絮状沉淀，得到所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液。
62.在具体实施时，所述保护液是牛血清蛋白-硼酸钠水溶液。
63.在具体实施时，所述保护液还可以是包括磷酸缓冲液、牛血清蛋白、蔗糖、聚山梨醇酯-20(吐温20，tween-20)以及聚乙二醇辛基苯基醚(tx-100)的混合液。其中，牛血清蛋白在混合液中的质量比为1％-2％；蔗糖在混合液中的质量比为1％-3％；tween-20在混合液中的质量比为0.5％-1％；tx-100在混合液中的质量比为0.5％-1％。
64.利用所述保护液稀释所述第三混合溶液离心后的絮状沉淀，可以有效防止氧化过
程，同时保证纳米颗粒的稳定，从而提供一种可以长时间保存的溶液体系，延长所述用于蛋白检测的纳米颗粒的使用寿命。当使用混合液作为保护液时，通过多种试剂的联合作用，可以有效避免纳米颗粒之间发生团聚，同时防止所述抗体从纳米颗粒表面脱落，影响最终的检测结果。
65.本发明实施例还提供一种用于抗原蛋白检测的纳米颗粒，其中，采用本发明实施例如上所述的制备方法制备得到，且将所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒应用于检测病毒的抗原蛋白。本实施例中，所述抗原蛋白为核衣壳蛋白(n蛋白)，例如新冠肺炎病毒的n蛋白检测，将所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒与拉曼光谱和免疫层析法结合，可以实现对于新冠肺炎病毒的快速高效检测，检测灵敏度高。
66.本发明实施例还提供一种用于抗原蛋白检测的试纸条，其中，如图2所示，所述试纸条包括依次相连的样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜和吸收垫，在所述硝酸纤维素膜上设有测试线和控制线，并将本发明实施例如上所述的用于抗原蛋白检测的纳米颗粒配置为溶液后滴加在所述结合垫上，从而得到可以快速高效检测特定病毒的试纸条。
67.具体实施时，将所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒的溶液滴加在所述结合垫上之后，将所述样品垫，所述结合垫，所述硝酸纤维素膜和所述吸收垫裁剪为规定尺寸，组装为试纸条，其中所述硝酸纤维素膜上的测试线靠近所述结合垫，控制线靠近所述吸收垫。进一步地，在所述测试线上划上待检测抗原蛋白的另一种抗体溶液，在所述控制线上划上针对表面修饰所用的抗体的二抗溶液。最后，在所述样品垫上滴加底物抗原的缓冲液，进行测试。
68.具体实施时，在所述结合垫上滴加所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒的溶液之前，对所述样品垫和所述结合垫用处理液进行提前处理。其中，所述处理液为含有磷酸缓冲液、蔗糖、奶粉以及tween-20的混合液，且所述处理液中磷酸缓冲液的浓度为0.01-0.05mol/l；蔗糖的质量比为4％-7％；奶粉的质量比为0.2％-0.5％；tween-20的质量比为0.1％-0.2％。
69.本实施方式中，将待测样品滴加在所述试纸条的样品垫上，在层析作用下样品在所述试纸条上扩散，与所述结合垫上的用于抗原蛋白检测的纳米颗粒结合后依次通过所述硝酸纤维素膜上的测试线和控制线，当待测样品中存在特定病毒的抗原蛋白时，测试线上的抗体会特异性结合抗原蛋白，在所述测试线上即可检出所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒。通过拉曼光谱仪，利用sers效应检测所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒表面的特定拉曼报告分子，本发明所述试纸条可以快速高效地检出特定病毒，且灵敏度高。针对病毒的n蛋白检测可以将检测限降低至1pg-100fg n蛋白/ml，与“金标准”核酸pcr检测方法灵敏度相当。
70.下面通过具体的实施例对本发明作进一步地说明。
71.实施例1
72.纳米金溶液的制备：
73.将199ml去离子水以及1ml 2％(w/w)haucl4混合，并加热搅拌至微沸。向其中加入1ml 1％柠檬酸钠水溶液，同时控制微沸回流。可观察到溶液颜色从淡黄色到黑色，再到酒红色。在溶液体系呈现酒红色后移除加热装置，停止加热和搅拌。待溶液恢复至室温，即获得粒径在30-50nm之间的金纳米粒子的溶液作为初始纳米颗粒溶液。将所述初始纳米颗粒
溶液保存于4℃下备用。如图3所示为所述初始纳米颗粒溶液的tem图像，从图中可以看出所述初始纳米颗粒溶液的平均粒径为30-50nm。
74.实施例2
75.纳米银溶液的制备：
76.取200ml 1mmol/l的agno3溶液，加热搅拌至微沸。向其中加入10ml 1％柠檬酸钠水溶液，同时控制微沸回流。可观察到溶液颜色从淡黄色到灰色，再到灰黑色。在溶液体系呈现灰黑色后移除加热装置，停止加热和搅拌。待溶液恢复至室温，即获得粒径在30-50nm之间的银纳米粒子的溶液作为初始纳米颗粒溶液。将所述初始纳米颗粒溶液保存于4℃下备用。
77.实施例3
78.用于抗原蛋白检测的纳米颗粒的制备：
79.将10ml上述初始纳米颗粒溶液与0.01ml 0.001mmol/ml 2-氰基-1,4-苯基二硫醇乙醇溶液混合并在室温下搅拌30min得到第一混合溶液，随后用0.1mol/l k2co3水溶液将所述第一混合溶液的ph值调整为7.2，得到表面修饰的纳米颗粒溶液。
80.取1ml所述表面修饰的纳米颗粒溶液，向其中滴入0.01ml 1mg/ml抗体溶液，在37℃条件下震荡培育1h，得到第二混合溶液。取5ml ph＝7.2磷酸缓冲溶液，加入10mg牛血清蛋白后得到稳定剂溶液，并将所述稳定剂溶液与所述第二混合溶液混合后继续在37℃条件下震荡培育1h，得到第三混合溶液。将所述第三混合溶液在9000r/min条件下离心10min，去除上清液；在1ml去离子水中加入0.002mmol硼酸钠和1mg牛血清蛋白得到保护液，并将10μl所述保护液滴在所述第三混合溶液离心后的絮状沉淀上进行稀释，从而得到用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液。
81.实施例4
82.用于抗原蛋白检测的纳米颗粒的制备：
83.将11ml上述初始纳米颗粒溶液与0.01ml 0.001mmol/ml 5,5
’‑
二硫代双(2-氰基苯甲酸)乙醇溶液混合并在室温下搅拌30min得到第一混合溶液，随后用0.2mol/l k2co3水溶液将所述第一混合溶液的ph值调整为7.7，得到表面修饰的纳米颗粒溶液。
84.取1.5ml所述表面修饰的纳米颗粒溶液，向其中滴入0.01ml 1mg/ml抗体溶液，在37℃条件下震荡培育3h，得到第二混合溶液。取7.5ml ph＝7.7磷酸缓冲溶液，加入15mg牛血清蛋白后得到稳定剂溶液，并将所述稳定剂溶液与所述第二混合溶液混合后继续在37℃条件下震荡培育2h，得到第三混合溶液。将所述第三混合溶液在15000r/min的条件下离心15min，去除上清液；在2ml去离子水中加入0.004mmol硼酸钠和10mg牛血清蛋白得到保护液，并将20μl所述保护液滴在所述第三混合溶液离心后的絮状沉淀上进行稀释，从而得到用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液。
85.实施例5
86.用于抗原蛋白检测的纳米颗粒的制备：
87.将6ml上述初始纳米颗粒溶液与0.01ml 0.001mmol/ml 4-氰基苯硫酚的乙醇溶液混合并在室温下搅拌15min得到第一混合溶液，随后用0.1mol/l k2co3水溶液将所述第一混合溶液的ph值调整为8.0，得到表面修饰的纳米颗粒溶液。
88.取0.5ml所述表面修饰的纳米颗粒溶液，向其中滴入0.01ml 1mg/ml抗体溶液，在
37℃条件下震荡培育1h，得到第二混合溶液。取5ml ph＝8.0磷酸缓冲溶液，加入10mg牛血清蛋白后得到稳定剂溶液，并将所述稳定剂溶液与所述第二混合溶液混合后继续在37℃条件下震荡培育1h，得到第三混合溶液。将所述第三混合溶液在5000r/min的条件下离心10min，去除上清液；在20ml磷酸缓冲液中加入0.2g牛血清蛋白，0.1ml tween-20，0.4g蔗糖以及0.1ml tx-100得到保护液，并将30μl所述保护液滴在所述第三混合溶液离心后的絮状沉淀上进行稀释，从而得到用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液。
89.实施例6
90.用于抗原蛋白检测的纳米颗粒的制备：
91.将4ml上述初始纳米颗粒溶液与0.01ml 0.001mmol/ml 4-氰基硫代苯甲酸的乙醇溶液混合并在室温下搅拌30min得到第一混合溶液，随后用0.2mol/l k2co3水溶液将所述第一混合溶液的ph值调整为7.8，得到表面修饰的纳米颗粒溶液。
92.取1ml所述表面修饰的纳米颗粒溶液，向其中滴入0.01ml 1mg/ml抗体溶液，在37℃条件下震荡培育1h，得到第二混合溶液。取5ml ph＝7.8磷酸缓冲溶液，加入10mg牛血清蛋白后得到稳定剂溶液，并将所述稳定剂溶液与所述第二混合溶液混合后继续在37℃条件下震荡培育1h，得到第三混合溶液。将所述第三混合溶液在10000r/min的条件下离心5min，去除上清液；在20ml磷酸缓冲液中加入0.4g牛血清蛋白，0.2ml tween-20，0.6g蔗糖以及0.2ml tx-100得到保护液，并将25μl所述保护液滴在所述第三混合溶液离心后的絮状沉淀上进行稀释，从而得到用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液。
93.实施例7
94.用于抗原蛋白检测的纳米颗粒的制备：
95.将12ml上述初始纳米颗粒溶液与0.015ml 0.001mmol/ml牛血清蛋白乙醇溶液混合并在室温下搅拌30min得到第一混合溶液，随后用0.1mol/l k2co3水溶液将所述第一混合溶液的ph值调整为7.3，得到表面修饰的纳米颗粒溶液。
96.取2ml所述表面修饰的纳米颗粒溶液，向其中滴入0.01ml 1mg/ml抗体溶液，在37℃条件下震荡培育1h，得到第二混合溶液。取10ml ph＝7.3磷酸缓冲溶液，加入10mg牛血清蛋白后得到稳定剂溶液，并将所述稳定剂溶液与所述第二混合溶液混合后继续在37℃条件下震荡培育1h，得到第三混合溶液。将所述第三混合溶液在10000r/min的条件下离心10min，去除上清液；在2ml去离子水中加入0.008mmol硼酸钠和20mg牛血清蛋白得到保护液，并将20μl所述保护液滴在所述第三混合溶液离心后的絮状沉淀上进行稀释，从而得到用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液。
97.实施例8
98.用于抗原蛋白检测的纳米颗粒的制备：
99.将10ml上述初始纳米颗粒溶液与0.02ml 0.001mmol/ml 2-氰基-1,4-苯基二硫醇的乙醇溶液混合并在室温下搅拌20min得到第一混合溶液，随后用0.2mol/l k2co3水溶液将所述第一混合溶液的ph值调整为7.7，得到表面修饰的纳米颗粒溶液。
100.取2ml所述表面修饰的纳米颗粒溶液，向其中滴入0.01ml 1mg/ml抗体溶液，在37℃条件下震荡培育1h，得到第二混合溶液。取10ml ph＝7.7磷酸缓冲溶液，加入15mg牛血清蛋白后得到稳定剂溶液，并将所述稳定剂溶液与所述第二混合溶液混合后继续在37℃条件下震荡培育1h，得到第三混合溶液。将所述第三混合溶液在10000r/min的条件下离心
12min，去除上清液；在20ml磷酸缓冲液中加入0.25g牛血清蛋白，0.15ml tween-20，0.5g蔗糖以及0.15ml tx-100得到保护液，并将15μl所述保护液滴在所述第三混合溶液离心后的絮状沉淀上进行稀释，从而得到用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液。
101.实施例9
102.试纸条的组装：
103.在100ml去离子水中加入5g蔗糖，0.2g奶粉，0.1g tween-20，并加入0.02mol/l的磷酸缓冲液将ph调至7.4，得到处理液。
104.将样品垫和结合垫浸入所述处理液中1h后取出，在37℃下烘干。
105.在所述结合垫上滴加所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液，将所述结合垫在37℃下烘干。
106.将所述样品垫裁剪为2.0cm*4mm的条形，将所述结合垫裁剪为0.5cm*4mm的条形，将硝酸纤维素膜裁剪为2.5cm*4mm的条形，将吸水垫裁剪为1.7cm*4mm的条形，在所述硝酸纤维素膜的1/3处划上特定抗原蛋白的另一种抗体溶液作为测试线，在所述硝酸纤维素膜的2/3处划上对应特定抗原蛋白的第一种抗体的二抗溶液作为控制线，将所述硝酸纤维素膜在37℃下烘干。
107.取6.0cm*4mm的底板，将所述样品垫，所述结合垫，所述硝酸纤维素膜和所述吸收垫依次连接固定在所述底板上，且保证所述硝酸纤维素膜的所述测试线靠近所述样品垫，所述硝酸纤维素膜的所述控制线靠近所述吸水垫，从而得到本发明所述用于抗原蛋白检测的试纸条。
108.综上所述，本发明提供了一种用于抗原蛋白检测的纳米颗粒及其制备方法和试纸条，包括提供初始纳米颗粒溶液；将所述初始纳米颗粒溶液与拉曼报告分子溶液混合进行偶联反应，得到表面修饰的纳米颗粒溶液，所述拉曼报告分子的官能团同时包含巯基和氰基；以及将所述表面修饰的纳米颗粒溶液与抗体溶液混合进行静电吸附，得到用于抗原蛋白检测的纳米颗粒溶液。通过所述用于抗原蛋白检测的纳米颗粒，可以特异性地捕获病毒的抗原蛋白，从而结合免疫层析法和拉曼光谱可快速且高效地检出特定抗原蛋白，实现快速且准确地检测特定病毒。
109.应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。