一种基于模拟酶的电化学免疫传感器及其制备方法和应用

1.本发明涉及一种电化学免疫传感器及其制备方法和应用，更具体地，涉及一种基于纳米bnm模拟酶的电化学免疫传感器的制备和其在脱氧雪腐镰刀烯醇(don)检测中的应用。


背景技术：

2.脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)，又称呕吐毒素，是单端孢霉烯家族中最具代表性的霉菌毒素之一。它的主要产属包括禾谷镰刀菌和大镰刀菌。研究表明饲料中的脱氧雪腐镰刀烯醇(don)残留会导致动物腹泻、呕吐和畜禽组织损伤，食品中的脱氧雪腐镰刀烯醇(don)残留会引起人类的肝脏、心脏、肾脏等器官的慢性毒性，严重危害人体健康。而在食品和饲料的常规加工过程中，脱氧雪腐镰刀烯醇(don)非常稳定。
3.因此，开发一种食品和饲料中脱氧雪腐镰刀烯醇(don)残留检测方法至关重要。


技术实现要素：

4.发明目的：提供一种电化学免疫传感器及其制备方法和应用，在脱氧雪腐镰刀烯醇(don)检测中快速、灵敏、特异、可靠，操作简便，成本低廉。
5.电流型无标记免疫分析方法基于抗原抗体的特异性结合，在电极表面形成的免疫复合物阻碍电化学活性探针与电极之间的电子传输，从而引起电活性物质峰电流下降，利用这种电流的变化可实现脱氧雪腐镰刀烯醇(don)的定量检测。但是，现有传统的电化学探针应用于无标记电化学传感，传感器的检测灵敏度不高，未能在脱氧雪腐镰刀烯醇(don)检测上充分发挥电流型无标记免疫分析方法高灵敏度检测的优势。
6.随着纳米技术的飞速发展，研究发现某些人工合成无机纳米材料与免疫电传感器的结合使用弥补了这一缺陷。
7.本发明以三价铁离子溶液与有机配体(2-氨基对苯二甲酸)结合形成的mof材料nh
2-mil-101的八面体结构为基础，利用c12以上的长链脂肪酸调制剂诱导其框架内形成缺陷，在nh
2-mil-101表面生成多微晶球状结构从而产生更多的反应催化位点，以此热解获得的纳米bnm具有以下几个优势：(1)具有模拟辣根过氧化物酶的高效催化活性，以硫堇和过氧化氢作为酶反应底物，实现脱氧雪腐镰刀烯醇(don)抗原的有效检测。(2)由于bnm表面的氨基，可以通过交联剂以共价结合方式将脱氧雪腐镰刀烯醇(don)抗体直接连接于纳米bnm材料，有利于抗体负载于电极，因此也有利于脱氧雪腐镰刀烯醇(don)抗原的检测。
8.技术方案：
9.第一方面，提供一种用于检测脱氧雪腐镰刀烯醇(don)的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
10.a、制备纳米bnm模拟酶
11.将长链脂肪酸调制剂调制后的含三价铁离子溶液与2-氨基对苯二甲酸混合后，在设定温度下生长晶体，然后离心收集后干燥、煅烧制得bnm材料；
12.b、制备bnm-don抗体-壳聚糖溶液
13.使用交联剂将脱氧雪腐镰刀烯醇don抗体结合到bnm表面，得到bnm-don抗体复合物；然后将bnm-don抗体复合物分散在壳聚糖溶液中，制得bnm-don抗体-壳聚糖溶液；
14.c、制备脱氧雪腐镰刀烯醇(don)电化学免疫传感器工作电极
15.将bnm-don抗体-壳聚糖溶液滴加在预处理后的玻碳电极上，得到bnm-don抗体-壳聚糖复合电极；
16.用血清白蛋白溶液阻断bnm-don抗体-壳聚糖复合电极上的非特异性结合位点后，洗涤，得到所述电化学免疫传感器。
17.在一些实施例中，步骤a中，三价铁离子、长链脂肪酸调制剂、2-氨基对苯二甲酸的摩尔比为69:(30～50):(30～40)；优选为69:40:35。
18.在一些实施例中，步骤a中，三价铁离子的来源采用三氯化铁、硫酸铁、醋酸铁或三氯化铁水合物、硫酸铁水合物、醋酸铁水合物中的一种或几种；
19.优选的，所述三价铁离子的来源溶于二甲基甲酰胺形成含三价铁离子溶液。
20.在一些实施例中，步骤a中，长链脂肪酸调制剂选自棕榈酸、硬脂酸、月桂酸、花生酸中的一种或几种；
21.在一些实施例中，烷基链长碳原子逐渐增加，诱导nh
2-mil101表面呈现越多由于缺陷产生的微晶球状结构，因此优选棕榈酸作为调制剂。
22.在一些实施例中，步骤a中，晶体生长温度为160～240℃，优选为200℃。
23.煅烧过程在氮气氛围中，煅烧的温度为250～350℃，优选为300℃。
24.在一些实施例中，交联剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-环己基-2-吗啉乙基碳二亚胺、戊二醛中的一种或几种，交联剂优选为戊二醛。
25.在一些实施例中，使用交联剂将脱氧雪腐镰刀烯醇don抗体共价结合到bnm表面，包括：
26.将bnm分散在pbs缓冲液中，然后与交联剂混合，混合物孵育完成后、离心得到bnm-g；
27.将bnm-g与don抗体溶液混合、反应，don抗体与bnm-g共价结合得到bnm-don抗体复合物。
28.进一步的，所述don抗体溶液的浓度为0.5～2μg/ml。
29.第二方面，提供一种电化学免疫传感器，根据上述的制备方法制备得到。
30.第三方面，提供所述的电化学免疫传感器在脱氧雪腐镰刀烯醇(don)检测中的应用。
31.在一些实施例中，所述的应用，包括以下步骤：
32.s1、检测电化学免疫传感器电化学行为测试：将一定量的不同浓度的don抗原滴加到所述电化学免疫传感器上作为工作电极，与参比电极和辅助电极构成三电极测定体系，在含有硫堇与过氧化氢的pbs溶液中采用差分脉冲伏安法进行电化学测量，得出所述电化学免疫传感器对don的拟合线性回归方程及检出限；
33.s2、实际样品的测量：将处理好的待测样品滴加到所述电化学免疫传感器上作为工作电极，与参比电极和辅助电极构成三电极体系，进行电化学测量，并利用所述电化学免疫传感器对don的拟合线性回归方程计算出待测样品中don的浓度。
don抗体溶液混合。将上述溶液反应过夜(室温)，don抗体与bnm-g共价结合。最后离心将bnm-don抗体与反应混合物分离。随后用pbs缓冲液洗涤后分散在1.0wt％壳聚糖溶液中并超声10min，得到bnm-don抗体-壳聚糖溶液。
48.c、制备脱氧雪腐镰刀烯醇(don)电化学免疫传感器工作电极。
49.玻碳电极预处理将玻碳电极分别在1.0μm、0.3μm的al2o3在麂皮上抛光至镜面，每次抛光后先洗去表面污物，然后转移到乙醇和去离子水中超声10min。将5.0μl bnm-don抗体-壳聚糖溶液滴加到预处理的玻碳电极上，并使其在4℃下干燥12h，干燥后得到bnm-don抗体-壳聚糖复合电极；
50.将得到的电极与1％牛血清蛋白溶液在室温下封闭1小时，阻断非特异性结合位点，用pbs缓冲溶液再次洗涤后，得到检测don的电化学免疫传感器。
51.2.基于纳米bnm模拟酶的脱氧雪腐镰刀烯醇(don)电化学免疫传感器使用方法：
52.s1、使用时，先将5μl浓度为10-107pg/ml的don溶液滴加到检测don的电化学免疫传感器上，并以其为工作电极，铂丝电极为对电极，甘汞电极为参比电极构成经典三电极结构，在含有0.025mm硫堇与0.5mm过氧化氢的10ml ph＝5.5的pbs溶液中进行电化学测量，采用差分脉冲伏安法(dpv)，参数设定如下：振幅为50mv；脉冲宽度为0.05s；脉冲周期为0.5s。以不同浓度的don为横坐标，峰电流值为纵坐标，可得散点分布图如图3所示，做直线拟合后分析可知，复合电极所检测到的峰电流值在10-107pg/ml区间处具有良好的线性关系，线性回归方程为y＝0.959x-11.136，r2＝0.998，检出限为9.55pg/ml。
53.s2、实际样品的测量：从当地市场获取无污染的小麦粉作为检测样品。本研究选择蒸馏(di)水作为don分析的萃取溶剂。在5.0g小麦粉中加入不同浓度的呕吐毒素(1.5
×
102、1.5
×
104、1.5
×
106pg/ml)在室温下，在25毫升去离子水中搅拌15分钟，然后在5000转/分的转速下离心10分钟，再将上清液进行过滤。用该传感器检测上述样品，重复5次，结果如表1所示，免疫传感器的相对标准偏差(rsd)在2.6％-3.4％之间，回收率在94.7％-104.7％之间，说明本发明提出的免疫传感器能够很好地应用于don的测定。
54.表1实际样品检测
[0055][0056]
实施例2(对比例)
[0057]
本实施例与实施例1的区别是步骤1中a：将0.69mmol的fecl3·
6h2o与0.35mmol的nh
2-h2bdc溶解在30ml的dmf中并超声处理10分钟(不利用棕榈酸调制)。随后，将溶液放入烘箱中并迅速加热至200℃2小时。冷却至室温后，离心收集产物，用丙酮和去离子水洗涤3次并干燥。将干燥得到的固体产物在氮气氛围中300℃下煅烧2小时，最后用丙酮和去离子水洗涤多次并干燥得到煅烧nh
2-mil-101(nm)粉末；最终发现其过氧化物酶样活性低于bnm。
具体如图2所示。
[0058]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。