一种基于氧化钛纳米材料基质的房水分析方法

1.本发明属于医学领域，具体涉及一种基于氧化钛纳米材料基质的房水分析方法，尤其涉及一种基于金纳米粒子修饰的氧化钛纳米材料基质的房水分析方法。


背景技术：

2.房水是填充于人眼角膜和虹膜晶体隔之间的空间（前房）里的液体，正常情况下无色透明、量和成分相对稳定。房水是围绕晶状体前后室的透明液体，在维持眼内压、为晶状体提供营养物质和抗氧化剂以及清除晶状体的代谢废物方面起着重要作用。
3.白内障是一种具有晶状体蛋白变性和代谢紊乱等多种症状的致盲性眼病，其诱因包括年龄、高度近视、糖尿病、中毒和辐射等。截至2020年，全球白内障病例超过1530万，居失明原因之首。当发生白内障等其他眼部疾病时，房水中的成分、性状、产生和排出的量都会发生明显的变化，此时房水成分的分析有非常重要的意义。
4.继基因组还有蛋白组学之后，代谢组学是一门新兴的学科，与脱氧核糖核酸和蛋白质分别受限于表观遗传事件和翻译后修饰不同，代谢物作为生物体代谢的最终产物，与表型直接相关。初步研究发现，糖尿病或高度近视的白内障患者的房水中出现了代谢物的异常，表明房水可能包含有用的信息，能够反映白内障患者在代谢水平上相关的病变。
5.质谱（ms）在代谢组学中得到了广泛的应用，近年来，基于激光解吸/电离质谱（ldi-ms）的代谢组学分析方法被大量报道。与传统的气质联用以及液质联用相比，激光解吸/电离质谱具有高通量、高分析速度和简单的样品制备的优点，在代谢组学方面显示了巨大的潜力。ldi-ms最重要的特点就是基质的设计，目前很多材料被设计用于maldi基质，如碳材料、金属有机框架、贵金属、和金属氧化物，与传统的基质（如chca和dhb）相比，它们具有明显的背景消除能力。但是这些纳米材料对代谢物的电离能力不足导致低丰度的体液样品中的代谢物无法被检出，其次单一的材料无法实现全局代谢物覆盖，因此种将高电离效率的复合材料应用到代谢物的分析中具有极大的潜力。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提出一种基于氧化钛纳米材料基质的房水分析方法。
7.本发明提出的一种基于氧化钛纳米材料基质的房水分析方法，具体步骤如下：将氧化钛纳米材料与去离子水配置成材料分散溶液，其中氧化钛纳米材料与去离子水的质量体积比为：1-2 g/l，取1~2μl房水样品沉积在靶板上，样品干燥后，再在其上点上1~2μl材料分散溶液，然后进入maldi-tof-ms质谱分析；其中，氧化钛纳米材料为金纳米粒子修饰的多层氧化钛二元基质材料。
8.本发明中，房水样品进入maldi-tof-ms质谱分析获得的代谢谱图用软件中提取后，对同一份房水样品进行平均和峰对齐，建立m/z信号矩阵，再将矩阵数据导入到simca软件中，通过建立偏最小二乘判别分析模型。
9.本发明中，所述金纳米粒子修饰的多层氧化钛基质材料的合成方法，具体步骤如
下：（1）将聚氧乙烯聚氧丙烯醚三嵌段共聚物加入到四氢呋喃溶液中，充分搅拌溶解后，加入乙酸和浓盐酸，再充分搅拌大约10 min，在体系中加入钛酸四丁酯，大约反应半小时后，将清澈的黄白色溶液倒入两个称量瓶中，在40 ℃真空干燥箱中干燥；（2）将步骤（1）所得产物均匀分散于无水乙醇中，剧烈搅拌至溶解完全，之后再加入约15 ml甘油，充分搅拌10 min，将所得混合溶液转移至高压反应釜中，在100 ℃的条件下加热10 h,冷却至室温，收集沉淀，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在真空干燥箱中干燥得到白色固体；（3）将步骤（2）所得产物在马弗炉中350 ℃的条件下煅烧3小时；（4）将步骤（3）所得产物分散在氯金酸溶液中，加热至巨沸后，用柠檬酸三钠进行还原，收集得到紫红色固体，所得产物用去离子水还有乙醇洗涤后，在真空干燥箱中进行干燥，即得所述金纳米粒子修饰的氧化钛二元基质材料。
10.本发明的有益效果在于：1.金纳米粒子修饰的多层氧化钛基质是一种复合材料基质，结合了氧化钛材料和金纳米粒子优良紫外吸收能力的特点，能够高效电离小分子代谢物；2.金纳米粒子修饰的多层氧化钛基质的结构中，片层的氧化钛材料的结构有伸展性，能够负载大量的金纳米粒子，相比其他结构的氧化钛材料，负载量大大提升，能够提高该材料对小分子代谢物的吸附和电离效率；3. 金纳米粒子修饰的多层氧化钛基质材料首次应用于白内障患者房水样品代谢物的研究，结合maldi质谱分析房水代谢物，再结合机器学习的算法，能够快速、高效、准确区分不同疾病相关的白内障，这对于疾病的早期诊断以及疾病分型具有极其重要的意义。
11.本发明提出了一种高效电离的 maldi小分子基质用于房水代谢物的分析以及不同疾病相关白内障的区分，首次合成了具有高电离效率的金纳米粒子修饰的多层氧化钛纳米材料并将其用于白内障患者房水样品的分析。在maldi质谱的分析中，该材料可以实现房水样品代谢指纹图谱的快速采集，大大缩短了传统代谢组学分析检测的时间。同时将得到的房水样品的代谢指纹图谱与机器学期相结合，能够快速、高效、准确的实现了不同疾病相关白内障的区分，包括老年性白内障、糖尿病性白内障和高度近视白内障。本发明旨在于提供一种新型的高效电离的maldi小分子基质的合成方法及其在疾病的诊断和分型中的应用。
附图说明
12.图1为实施例1的金纳米粒子修饰的多层氧化钛基质材料的扫描电子显微镜照片；图2为实施例1的金纳米粒子修饰的多层氧化钛基质材料的透射电子显微镜照片；图3为实施例1的多层氧化钛和金纳米粒子修饰的多层氧化钛基质材料的x射线粉末衍射结果；图4为实施例1的金纳米粒子修饰的多层氧化钛基质材料的氮气吸附等温线；图5为实施例1的多层氧化钛和金纳米粒子修饰的多层氧化钛基质材料的紫外可见吸收图谱；图6为实施例1中的多层氧化钛和金纳米粒子修饰的多层氧化钛基质材料对混合
小分子代谢物标准品样品分析的质谱图；图7为实施例2中的金纳米粒子修饰的多层氧化钛基质材料对于三种不同疾病相关白内障房水样品进行分析得到的代谢指纹图谱。图a为老年性相关白内障的房水代谢指纹图谱，图b为糖尿病相关白内障的房水代谢指纹图谱，图c为高度近视相关的房水代谢指纹图谱；图8为利用实施例2中的三种不同疾病相关白内障房水代谢指纹图谱通过建立偏最小二乘判别分析实现老年性相关白内障、糖尿病相关白内障以及高度近视相关白内障的区分。
具体实施方式
13.本发明利用金纳米粒子修饰的多层氧化钛纳米材料对老年性相关白内障、糖尿病相关白内障以及高度近视相关白内障房水样品进行分析并且通过建立机器学习模型区分这三组不同疾病相关的白内障，以下介绍具体实施方式。
14.实施例1：金纳米粒子修饰的多层氧化钛纳米材料的合成、对标准品的分析（1）将聚氧乙烯聚氧丙烯醚三嵌段共聚物加入到四氢呋喃溶液中，充分搅拌溶解后，加入乙酸和浓盐酸，再充分搅拌10 min，在体系中加入钛酸四丁酯，大约反应30 min后，将清澈的黄白色溶液倒入两个称量瓶中，在40 ℃真空干燥箱中干燥；（2）将步骤（1）所得产物均匀分散于无水乙醇中，剧烈搅拌至溶解完全，之后再加入15 ml甘油，充分搅拌10 min，将所得混合溶液转移至高压反应釜中，在100℃的条件下加热10 h,冷却至室温，收集沉淀，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在真空干燥箱中干燥得到白色固体；（3）将步骤（2）所得产物在马弗炉中350 ℃的条件下煅烧3小时；（4）将步骤（3）所得产物分散在氯金酸溶液中，加热至巨沸后，用柠檬酸三钠进行还原，收集得到紫红色固体，所得产物用去离子水还有乙醇洗涤后，在真空干燥箱中进行干燥，即得所述金纳米粒子修饰的多层氧化钛二元基质材料；（5）将制得的金纳米粒子修饰的多层氧化钛二元基质材料用扫描电子显微镜检测，检测条件是：将材料分散在无水乙醇中，在铜网上进行制样，在15kv工作电压下，抽真空后，1微米比例尺下扫描电子显微镜观察，检测结果如图1所示；（6）将制得的金纳米粒子修饰的氧化钛二元基质材料用透射电子显微镜检测，检测条件是：200kv工作电压下，取少量干燥的材料均匀分散于无水乙醇中在铜网上进行制样，干燥后插入仪器抽真空，1微米比例尺下观察透射电子显微镜图，检测结果如图2所示；（7）将精氨酸、肌酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、葡萄糖、甲硫氨酸、组氨酸和缬氨酸8种标准氨基酸配置成混合溶液（每种单独的氨基酸先配置为20mm，8种氨基酸每种取50ul稀释混合在一起，再加去离子水配置成浓度为1 mm的混合溶液）；（8）将多层氧化钛还有金纳米粒子修饰的多层氧化钛分散在去离子水溶液中，配置成1 mg. ml-1 的材料分散液；（9）质谱分析：取1~2 μl步骤（7）中的标准品混合液点靶板，自然干燥后，覆盖一层材料分散液，自然干燥后进行质谱分析，质谱图如6所示；分析结果：由图6可以看出，多层氧化钛还有金纳米粒子修饰的多层氧化钛对混合
的标准样品都有优良的电离效率，且金纳米粒子修饰的多层氧化钛对于混合的标准样品都有增强的电离效果。
15.实施例2
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对实际样品的分析（1）如实施例1步骤（1）至（4）制备金纳米粒子修饰的多层氧化钛二元基质材料；（2）房水样品的准备：在100 μl的房水样品中加入100 μl去离子水进行稀释；（3）质谱分析：取1~2 μl步骤（2）中的稀释后的三份房水样品（老年性相关的白内障房水样品、糖尿病相关的房水样品以及高度近视相关的房水样品）分别点靶，自然干燥后，再在其上覆盖1~2 μl制备的金纳米粒子修饰的多层氧化钛，自然干燥后，进行maldi分析，（质谱实验条件为：阳离子模式，激光强度为70%）质谱图如图7所示；分析结果：由图7可以看出，金纳米粒子修饰的氧化钛基质材料对于三份房水样品的代谢物都有优良的电离效率；（4）本次实验总共收集了183份白内障房水样品，其中包括67份老年性相关，51份糖尿病相关以及65份高度近视相关。将每一份房水样品进行四次点靶测试获取代谢指纹图谱。房水样品的代谢谱图的原始数据在flexanalysis 3.4软件中进行提取，用maldi quant r语言包对同一份房水样品进行平均和峰对齐，建立m/z信号矩阵，再将矩阵数据导入到simca软件中，通过建立偏最小二乘判别分析（opls-da）模型对三组房水样品进行诊断，如图8所示。
16.分析结果：由图8可以看出，在正交偏最小二乘判别分析（opls-da）模型中，三组房水样品能够被划分在不同的区域，并且每组样品之间的差异非常小能实现很好的聚集。 其次，该opls-da模型的预测值（q2）为0.923，证明该模型能够快速、准确的实现三种不同疾病相关白内障的区分。