1.本发明涉及中药技术领域，特别是涉及一种石见穿药材或其标准汤剂的特征图谱构建方法和检测方法。
背景技术：2.《中国药典》1977年版收载石见穿为唇形科植物华鼠尾草(salvia chinensis benth.)的干燥地上部分；夏、秋二季花期采割，除去杂质，晒干；其味苦、辛，性平；归肝、胃、肺经；具有清解热毒，活血，利气，止痛的作用；用于脘胁胀痛，痈肿。石见穿的化学成分以酚酸类、酚酸酯类和三萜类为主，此外还包括酸性多糖、甾醇、氨基酸等。其中酚酸类及酚酸酯类成分含量最高，例如迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、迷迭香酸乙酯、丹酚酸a、丹酚酸b、丹酚酸c、丹酚酸c甲酯、丹参素等，该类物质多为水溶性化合物，具有较强的药理活性，是石见穿最主要的有效成分之一。近年来石见穿作为抗肿瘤中药被广泛应用于各药剂组方中，具有较强的临床价值。
3.然而，现行石见穿的药典标准及各地方药材标准均较简单，仅含性状、显微及薄层鉴别项，无法全面评价石见穿的质量。目前有关石见穿的文献报道主要针对其化学成分和药理作用进行研究，而其质量标准研究方面仅有少量关于酚酸类成分含量测定的报道。此外，石见穿具有来源广泛、成分复杂的特点，在临床上使用多以汤剂为主，汤剂中通常含有多种水溶性成分，依靠简单一种或两种成分的含量测定不足以全面反映石见穿药材的内在质量以及石见穿的临床作用，缺乏专属性，也不能反映其临床汤剂的物质基础特征。
技术实现要素：4.基于此，本发明提供一种石见穿药材或其标准汤剂的特征图谱构建方法和检测方法。该方法为石见穿药材及其标准汤剂提供一种更为全面、客观、快速的质量评价方法。
5.具体技术方案如下：
6.本发明的第一方面，提供一种石见穿药材或其标准汤剂的特征图谱构建方法，包括如下步骤：
7.取石见穿对照药材，加入有机溶剂进行提取，过滤，取续滤液，制备对照药材参照物溶液；取咖啡酸对照品、绿原酸对照品、迷迭香酸对照品、丹酚酸b对照品、丹参素钠对照品，加入有机溶剂溶解，制备对照品参照物溶液；
8.取石见穿药材或饮片，加入有机溶剂进行提取，过滤，取续滤液，制备供试品溶液ⅰ；或取石见穿标准汤剂冻干粉，加入有机溶剂进行提取，过滤，取续滤液，制备供试品溶液ⅱ；
9.采用超高效液相色谱法对所述对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液以及供试品溶液ⅰ进行检测，建立石见穿药材的特征图谱；或，
10.采用超高效液相色谱法对所述对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液以及供试品溶液ⅱ进行检测，建立石见穿标准汤剂的特征图谱；
11.所述超高效液相色谱法采用的流动相a为乙腈，流动相b为体积分数为0.05％～0.2％的甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
12.在其中一实施例中，所述梯度洗脱包括如下程序：
13.0min～3min，所述流动相a的体积百分比保持为2％；
14.3min～10min，所述流动相a的体积百分比由2％上升至7％；
15.10min～13min，所述流动相a的体积百分比由7％上升至9％；
16.13min～30min，所述流动相a的体积百分比由9％上升至20％；
17.30min～36min，所述流动相a的体积百分比由20％上升至26％；
18.36min～40min，所述流动相a的体积百分比由26％上升至60％。
19.在其中一实施例中，所述超高效液相色谱法还包括如下检测条件：
20.色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
21.流速：0.2ml/min～0.6ml/min；
22.柱温：35℃～45℃；
23.检测波长：280nm～300nm。
24.在其中一实施例中，所述有机溶剂为体积分数为40％～60％的甲醇水溶液。
25.在其中一实施例中，提取的方法为超声提取，包括如下条件：时间为20min～40min，功率为240w～260w，频率为30khz～50khz。
26.在其中一实施例中，所述特征图谱包括6个特征峰。
27.在其中一实施例中，所述的石见穿药材或其标准汤剂的特征图谱构建方法，还包括如下步骤：
28.采用质谱法对所述特征峰进行鉴定。
29.在其中一实施例中，所述质谱法包括如下检测条件：
30.离子化方式为加热电喷雾离子化；鞘气流速为30arb～40arb；辅助气流速为5arb～15arb；喷雾电压为3.5kv～4kv；s-lens电压为40v～60v；加热温度为300℃～400℃；毛细管温度为300℃～400℃；扫描模式为负离子模式；扫描范围为100～1500；归一化碰撞能量为35～45。
31.本发明的第二方面，提供一种石见穿药材或其标准汤剂的检测方法，包括如下步骤：
32.取待测石见穿药材或饮片，加入有机溶剂进行提取，过滤，取续滤液，制备待测样品溶液ⅰ；或取待测石见穿标准汤剂冻干粉，加入有机溶剂进行提取，过滤，取续滤液，制备待测样品溶液ⅱ；
33.采用超高效液相色谱法对所述待测样品溶液ⅰ或待测样品溶液ⅱ进行检测；
34.所述超高效液相色谱法采用的流动相a为乙腈，流动相b为体积分数为0.05％～0.2％的甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
35.在其中一实施例中，所述梯度洗脱包括如下程序：
36.0min～3min，所述流动相a的体积百分比保持为2％；
37.3min～10min，所述流动相a的体积百分比由2％上升至7％；
38.10min～13min，所述流动相a的体积百分比由7％上升至9％；
39.13min～30min，所述流动相a的体积百分比由9％上升至20％；
40.30min～36min，所述流动相a的体积百分比由20％上升至26％；
41.36min～40min，所述流动相a的体积百分比由26％上升至60％。
42.在其中一实施例中，所述超高效液相色谱法还包括如下检测条件：
43.色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
44.流速：0.2ml/min～0.6ml/min；
45.柱温：35℃～45℃；
46.检测波长：280nm～300nm。
47.在其中一实施例中，所述有机溶剂为体积分数为40～60％的甲醇水溶液。
48.在其中一实施例中，提取的方法为超声提取，包括如下条件：时间为20min～40min，功率为240w～260w，频率为30khz～50khz。
49.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
50.本发明通过选择适宜的参照物，并采用一定的超高效液相色谱法(uplc)条件构建石见穿或其标准汤剂的特征图谱，构建的特征图谱标定了6个水溶性成分的特征峰，能够快速、全面地实现对石见穿药材多个特征成分的质量监控，同时可以准确反映由该石见穿药材制成的标准汤剂的质量，进而为石见穿药材及其标准汤剂提供一种较为全面、客观、快速的质量评价方法，且方法操作简便、重复性好。
附图说明
51.图1为实施例1中石见穿药材的全波长扫描图；
52.图2为实施例1不同检测波长下石见穿药材的色谱图(s1：325nm；s2：290nm；s3：254nm)；
53.图3为实施例1中采用不同流动相b的石见穿药材色谱图；
54.图4为实施例1中采用不同色谱柱的石见穿药材色谱图；
55.图5为实施例1中15批石见穿药材的特征图谱；
56.图6为实施例1中石见穿对照药材的特征图谱；
57.图7为实施例1中15批石见穿药材相应的标准汤剂的特征图谱；
58.图8为实施例1中石见穿药材(s1)的紫外和总离子流色谱图；
59.图9为实施例1中石见穿特征图谱的特征峰确认图；
60.图10为实施例1中石见穿药材特征图谱专属性考察色谱图；
61.图11为实施例1中石见穿药材对照特征图谱(峰1：丹参素；峰3：咖啡酸；峰4：绿原酸；峰5(s)：迷迭香酸；峰6：丹酚酸b)；
62.图12为实施例1中石见穿标准汤剂对照特征图谱(峰1：丹参素；峰3：咖啡酸；峰4：绿原酸；峰5(s)：迷迭香酸；峰6：丹酚酸b)；
63.图13为实施例1中石见穿药材对照特征图谱与石见穿标准汤剂对照特征图谱的对比图；
64.图14为实施例2中待测石见穿药材的uplc色谱图。
具体实施方式
65.为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出
了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
66.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
67.本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
68.本发明中，“第一方面”、“第二方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
69.本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
70.本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
71.本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
72.本发明提供一种石见穿药材或其标准汤剂的特征图谱构建方法，包括如下步骤：
73.取石见穿对照药材，加入有机溶剂进行提取，过滤，取续滤液，制备对照药材参照物溶液；取咖啡酸对照品、绿原酸对照品、迷迭香酸对照品、丹酚酸b对照品、丹参素钠对照品，加入有机溶剂溶解，制备对照品参照物溶液；
74.取石见穿药材或饮片，加入有机溶剂进行提取，过滤，取续滤液，制备供试品溶液ⅰ；或取石见穿标准汤剂冻干粉，加入有机溶剂进行提取，过滤，取续滤液，制备供试品溶液ⅱ；
75.采用超高效液相色谱法对对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液以及供试品溶液ⅰ进行检测，建立石见穿药材的特征图谱；或，
76.采用超高效液相色谱法对对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液以及供试品溶液ⅱ进行检测，建立石见穿标准汤剂的特征图谱；
77.超高效液相色谱法采用的流动相a为乙腈，流动相b为体积分数为0.05％～0.2％的甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
78.可以理解地，特征图谱是一种综合的、可量化的现代质量分析方法，可实现对中药整体性的全面评价。在现阶段，针对中药有效成分多样性及复杂性，中药特征图谱的建立能大大提高中药质量控制的技术水平及科技含量。传统的特征图谱均是通过hplc完成的，耗时较长，本发明采用uplc构建特征图谱，与hplc相比具有分析速度快、灵敏度高的优点。
79.在其中一示例中，甲酸水溶液的体积分数包括但不限于：0.05％、0.07％、0.09％、
0.1％、0.11％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％。
80.在其中一示例中，梯度洗脱包括如下程序：
81.0min～3min，流动相a的体积百分比保持为2％；
82.3min～10min，流动相a的体积百分比由2％上升至7％；
83.10min～13min，流动相a的体积百分比由7％上升至9％；
84.13min～30min，流动相a的体积百分比由9％上升至20％；
85.30min～36min，流动相a的体积百分比由20％上升至26％；
86.36min～40min，流动相a的体积百分比由26％上升至60％。
87.在其中一示例中，超高效液相色谱法还包括如下检测条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。进一步地，色谱柱为waters beh c18(100mm
×
2.1mm，1.7μm)色谱柱。
88.在其中一示例中，超高效液相色谱法还包括如下检测条件：流速为0.2ml/min～0.6ml/min。进一步地，流速包括但不限于：0.2ml/min、0.25ml/min、0.3ml/min、0.35ml/min、0.4ml/min、0.45ml/min、0.5ml/min、0.55ml/min、0.6ml/min。
89.在其中一示例中，超高效液相色谱法还包括如下检测条件：柱温为35℃～45℃。进一步地，柱温包括但不限于：35℃、37℃、39℃、40℃、41℃、43℃、45℃。
90.在其中一示例中，超高效液相色谱法还包括如下检测条件：紫外检测波长为280nm～300nm。进一步地，紫外检测波长包括但不限于：280nm、285nm、290nm、295nm、300nm。
91.具体地，在其中一示例中，超高效液相色谱法还包括如下检测条件：
92.色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
93.流速：0.2ml/min～0.6ml/min；
94.柱温：35℃～45℃；
95.检测波长：280nm～300nm。
96.在其中一示例中，有机溶剂为体积分数为40％～60％的甲醇水溶液。进一步地，甲醇水溶液的体积分数包括但不限于：40％、45％、47％、50％、53％、55％、60％。
97.在其中一示例中，提取的方法为超声提取，包括如下条件：时间为20min～40min，功率为240w～260w，频率为30khz～50khz。进一步地，超声提取的时间包括但不限于：20min、25min、29min、30min、31min、35min、40min；超声提取的功率包括但不限于：240w、245w、247w、250w、253w、255w、260w；超声提取的频率包括但不限于：30khz、35khz、40khz、45khz、50khz。
98.在其中一示例中，对照品参照物溶液的制备方法包括如下步骤：
99.取咖啡酸对照品、绿原酸对照品、迷迭香酸对照品、丹酚酸b对照品，精密称定，加入体积分数为40％～60％的甲醇水溶液分别制成每1ml含咖啡酸50μg、绿原酸50μg、迷迭香酸100μg、丹酚酸b 50μg的对照品参照物溶液；
100.取丹参素钠对照品，精密称定，加入体积分数为40％～60％的甲醇水溶液制成每1ml含50μg(相当于每1ml含丹参素45μg)的对照品参照物溶液。
101.在其中一示例中，特征图谱包括6个特征峰。
102.本发明通过选择适宜的参照物，并采用一定的超高效液相色谱法(uplc)条件能够构建得到石见穿及其标准汤剂的特征图谱，将石见穿对照药材的特征图谱、石见穿药材的特征图谱和石见穿标准汤剂的特征图谱进行比较，确定了6个共有峰，这6个共有峰均能稳
定地从石见穿药材传递到石见穿标准汤剂中，故把该6个共有峰设为石见穿药材或其标准汤剂的特征峰。进一步地，本发明结合质谱法对特征峰进行指认和确认，明确其化学成分。
103.在其中一示例中，石见穿药材或其标准汤剂的特征图谱构建方法，还包括如下步骤：
104.采用质谱法对特征峰进行鉴定。
105.在其中一示例中，质谱法包括如下检测条件：
106.离子化方式为加热电喷雾离子化；鞘气流速为30arb～40arb；辅助气流速为5arb～15arb；喷雾电压为3.5kv～4kv；s-lens电压为40v～60v；加热温度为300℃～400℃；毛细管温度为300℃～400℃；扫描模式为负离子模式；扫描范围为100～1500；归一化碰撞能量(nce)为35～45。
107.在其中一示例中，质谱法的鞘气流速包括但不限于：30arb、31arb、32arb、33arb、34arb、35arb、36arb、37arb、38arb、39arb、40arb。
108.在其中一示例中，质谱法的辅助气流速包括但不限于：5arb、6arb、7arb、8arb、9arb、10arb、11arb、12arb、13arb、14arb、15arb。
109.在其中一示例中，质谱法的喷雾电压包括但不限于：3.5kv、3.6kv、3.7kv、3.8kv、3.9kv、4kv。
110.在其中一示例中，质谱法的s-lens电压包括但不限于：40v、42v、44v、46v、48v、50v、52v、54v、56v、58v、60v。
111.在其中一示例中，质谱法的加热温度包括但不限于：300℃、320℃、340℃、360℃、380℃、400℃。
112.在其中一示例中，质谱法的毛细管温度包括但不限于：300℃、320℃、340℃、360℃、380℃、400℃。
113.在其中一示例中，质谱法的归一化碰撞能量(nce)包括但不限于：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45。
114.本发明还提供一种石见穿药材或其标准汤剂的检测方法，包括如下步骤：
115.取待测石见穿药材或饮片，加入有机溶剂进行提取，过滤，取续滤液，制备待测样品溶液ⅰ；或取待测石见穿标准汤剂冻干粉，加入有机溶剂进行提取，过滤，取续滤液，制备待测样品溶液ⅱ；
116.采用超高效液相色谱法对待测样品溶液ⅰ或待测样品溶液ⅱ进行检测；
117.超高效液相色谱法采用的流动相a为乙腈，流动相b为体积分数为0.05％～0.2％的甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
118.可以理解地，采用超高效液相色谱法对待测样品溶液进行检测还包括将检测结果与上述特征图谱构建方法构建获得的特征图谱进行对比。
119.进一步地，可进行单一待测样品的检测，并与其特征图谱构建方法建立的特征图谱进行比较，以获得该单一待测样品的质量；或进行多批待测样品的检测，互相比较多批待测样品的图谱，获得多批待测样品之间的相似度。
120.可以理解地，上述的检测方法的技术方案类似前述石见穿药材或其标准汤剂的特征图谱构建方法，其中待测样品溶液的制备同供试品溶液的制备，在此不再赘述。
121.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。下述实施例中所用的原料、
试剂等，如无特殊说明，均为市售产品。
122.实施例1
123.本实施例提供一种石见穿及其标准汤剂的特征图谱构建方法，具体如下：
124.1、仪器、试剂与试药
125.(1)仪器
126.waters高效液相色谱仪(waters h-class，沃特世公司)，thermo高效液相色谱仪(thermo vanquish，赛默飞公司)，agilent高效液相色谱仪(agilent 1290，安捷伦公司)；thermo scientific
tm q exactive
tm focus组合型四极杆orbitrap质谱仪(美国赛默飞公司)；mzvault质谱数据库(美国赛默飞公司)；waters beh c18色谱柱(100mm
×
2.1mm，1.7μm)，ymc triart c18色谱柱(100mm
×
2.1mm，1.9μm)，agilent sb c18色谱柱(100mm
×
2.1mm，1.8μm)；万分之一天平(me204e，梅特勒-托利多公司)，百万分之一天平(xp26，梅特勒-托利多公司)；数控超声波清洗器(kq500de，昆山市超声仪器有限公司)，恒温水浴锅(hws28型，上海一恒科技有限公司)，超纯水系统(milli-q direct，默克股份有限公司)。
127.(2)试剂
128.甲醇(分析纯，西陇科学股份有限公司)；
129.液相用乙腈(色谱级，默克股份有限公司)；
130.甲酸(hplc色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司)；
131.水为超纯水(实验室自制)。
132.(3)试药
133.石见穿对照药材(批号：121579-201802，中国食品药品检定研究院)；丹参素纳对照品(批号：110855-201915，含量：97.8％，中国食品药品检定研究院)；咖啡酸对照品(批号：110885-201703，含量：99.7％，中国食品药品检定研究院)；绿原酸对照品(批号：110753-202018，含量：96.1％，中国食品药品检定研究院)；迷迭香酸对照品(批号：111871-202007，含量：98.1％，中国食品药品检定研究院)；丹酚酸b对照品(批号：111562-201917，含量：96.6％，中国食品药品检定研究院)；
134.15批石见穿药材经广东一方制药有限公司质量中心鉴定为唇形科植物华鼠尾草salvia chinensis benth.的干燥地上部分，产地及编号信息见表1。
135.表1样品信息表
136.137.2、参照物溶液和供试品溶液的制备
138.2.1对照药材参照物溶液的制备
139.取石见穿对照药材1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为50％的甲醇25ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，摇匀，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液。
140.2.2对照品参照物溶液的制备
141.取咖啡酸对照品、绿原酸对照品、迷迭香酸对照品、丹酚酸b对照品适量，精密称定，加入体积分数为50％的甲醇分别制成每1ml含咖啡酸50μg、绿原酸50μg、迷迭香酸100μg、丹酚酸b 50μg的溶液，即得相应的对照品参照物溶液；
142.取丹参素钠对照品适量，精密称定，加入体积分数为50％的甲醇制成每1ml含50μg的溶液(相当于每1ml含丹参素45μg)，即得丹参素的对照品参照物溶液。
143.2.3供试品溶液的制备
144.(1)石见穿标准汤剂冻干粉的制备：取石见穿药材，除去杂质，喷淋清水，稍润，切段，干燥，得到石见穿饮片。取石见穿饮片100g，置于电陶瓷壶中，加水煎煮两次：第一次加入12倍量(按质量比计)的水浸泡30min，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸30min，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第二次加10倍量(按质量比计)的水，武火加热煮沸后文火保持微沸25min，煎液用350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。合并两次煎液，浓缩至90ml～110ml的浸膏，分装至6ml～14ml容器中，每瓶分装体积为2ml～3ml，分装完毕后冻干，取出，轧铝盖，即得石见穿标准汤剂冻干粉。
145.(2)取石见穿药材粉末(过三号筛)1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为50％的甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用体积分数为50％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得石见穿药材的供试品溶液。
146.(3)取步骤(1)制得的石见穿标准汤剂冻干粉0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为50％的甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用体积分数50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得石见穿标准汤剂的供试品溶液。
147.3色谱条件的确定
148.(1)检测波长的确定
149.采用waters beh c18(100mm
×
2.1mm，1.7μm)色谱柱；以乙腈为流动相a，以体积分数为0.1％的甲酸水溶液为流动相b，按如下表2中的规定进行梯度洗脱；流速为0.4ml/min；柱温为40℃；进样量为1μl。取石见穿药材(s1)的供试品溶液进行全波长扫描，考察不同色谱波长的情况，选择最优检测波长，结果见图1和图2。
150.表2梯度洗脱表
[0151][0152]
结果显示，选取290nm作为检测波长时，各特征色谱峰响应较好，峰信息较全，故选取290nm作为检测波长。
[0153]
(2)流动相的确定
[0154]
在表2梯度条件基础上，选择检测波长为290nm，色谱柱为waters beh c18(100mm
×
2.1mm，1.7μm)，以乙腈为流动相a，分别以体积分数为0.1％的磷酸水溶液、体积分数为0.1％的乙酸水溶液、体积分数为0.1％的甲酸水溶液作为流动相b，考察三种不同的流动相b对石见穿药材色谱峰的影响，结果见图3。
[0155]
结果显示，以体积分数为0.1％的甲酸水溶液为流动相b，各色谱峰峰型及分离度较佳，故选择体积分数为0.1％的甲酸水溶液作为流动相b、乙腈为流动相a。
[0156]
(3)色谱柱的确定
[0157]
在表2梯度条件基础上，选择检测波长为290nm，以乙腈为流动相a，以体积分数为0.1％的甲酸水溶液为流动相b，分别考察waters beh c18色谱柱(100mm
×
2.1mm，1.7μm)、ymc triart c18色谱柱(100mm
×
2.1mm，1.9μm)、agilent sb c18色谱柱(100mm
×
2.1mm，1.8μm)对石见穿药材色谱峰的影响，结果见图4。
[0158]
结果显示，采用waters beh c18色谱柱时，各色谱峰的峰型及分离度最优，故选择waters beh c18色谱柱作为石见穿药材特征图谱色谱柱。
[0159]
(4)色谱条件的确定
[0160]
通过前述考察，可确定色谱条件为：
[0161]
色谱柱：waters beh c18(100mm
×
2.1mm，1.7μm)色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
[0162]
流动相：以乙腈为流动相a，0.1％甲酸水溶液作为流动相b，按表2中的规定进行梯度洗脱；
[0163]
流速：0.4ml/min；柱温：40℃；紫外检测波长：290nm。
[0164]
4、特征峰的确定
[0165]
取表1中15批石见穿药材按“2.3”项下方法制备石见穿药材的供试品溶液ⅰ，取供试品溶液ⅰ及对照药材溶液按“3”项下确定的色谱条件进行测定，得到15批石见穿药材的特征图谱(图5)以及石见穿对照药材的特征图谱(图6)。
[0166]
取表1中15批石见穿药材，按“2.3”项下方法制备石见穿标准汤剂以及相应的供试品溶液ⅱ，取供试品溶液ⅱ按“3”项下确定的色谱条件进行测定，得到15批石见穿药材相应的标准汤剂的特征图谱(图7)。
[0167]
通过比较图5～图7，可确定6个共有峰，这6个共有峰均能稳定地从石见穿药材传递到石见穿标准汤剂中，故把这6个共有峰设为石见穿药材的特征峰，并进一步对特征峰进行指认和确认，明确其化学成分。
[0168]
5、特征峰的指认与确认
[0169]
5.1特征峰的指认
[0170]
利用uplc－qe－orbitrap－ms对石见穿的特征图谱中的特征峰进行化学成分指认。
[0171]
(1)uplc色谱条件：同“3”项下确定的色谱条件。
[0172]
(2)质谱条件：具体参数如下表3所示。
[0173]
表3质谱参数
[0174][0175]
(3)精密吸取石见穿药材(s1)供试品溶液1μl，注入液质联用系统，得到紫外和总离子流色谱图(图8)。采用mzvault质谱数据库对采集到的数据进行分析，从高分辨系统得到精确的质量数，对其进行元素组成分析并得到化合物的化学式，根据化合物的二级质谱信息，结合本地质谱数据库及相关文献分析，推测石见穿中6个特征峰的成分信息如下表4所示。
[0176]
表4石见穿药材特征峰质谱指认信息
[0177][0178][0179]
5.2特征峰的确认
[0180]
根据表4中的指认信息按“2.2”项下方法配制咖啡酸、绿原酸、迷迭香酸、丹酚酸b和丹参素的对照品参照物溶液，取对照品参照物溶液、石见穿药材及其标准汤剂的供试品溶液按“3”项下确定的色谱条件进行检测，结果如图9所示。
[0181]
通过与对照品的保留时间以及紫外—可见3d光谱进行比对，初步可确认石见穿药材中的5个特征峰的化学成分，其中：特征峰1为丹参素，特征峰3为咖啡酸，特征峰4为绿原酸，特征峰5为迷迭香酸，特征峰6为丹酚酸b，特征峰2根据质谱信息仅得到以c7h5o3为母核的化合物，该类化合物种类较多，暂时无法确认成分。
[0182]
结合表4的指认信息和15批石见穿药材及其标准汤剂的特征图谱(图5、图7)，可发现特征峰5在石见穿药材及标准汤剂中峰面积均较稳定，且对照品易得，故选择特征峰5即迷迭香酸色谱峰作为参照峰。
[0183]
6、方法学的考察
[0184]
6.1精密度的考察
[0185]
取石见穿药材(s1)，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“3”项下确定的色谱条件重复进样测定6次，以迷迭香酸峰为参照峰s，计算6个特征峰与s峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd。结果表明，6个特征峰的相对保留时间及相对峰面积rsd均小于3％(结果如表5、表6所示)，说明仪器精密度良好。
[0186]
表5精密度考察实验结果(相对保留时间)
[0187][0188]
表6精密度考察实验结果(相对峰面积)
[0189][0190]
6.2重复性考察
[0191]
取同一批的石见穿样品(s1)，按照“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“3”项下确定色谱条件进样测定，以迷迭香酸峰为参照峰s，计算6个特征峰与s峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd。结果表明，6个特征峰的相对保留时间及相对峰面积rsd均小于3％(结果如表7、表8所示)，表明本方法重复性良好。
[0192]
表7重复性考察实验结果(相对保留时间)
[0193][0194][0195]
表8重复性考察实验结果(相对峰面积)
[0196][0197]
6.3稳定性考察
[0198]
取同一石见穿药材(s1)供试品溶液，按“3”项下确定色谱条件，分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h和24h进样，以迷迭香酸峰为参照峰s，计算6个特征峰与s峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd。结果表明，6个特征峰的相对保留时间及相对峰面积rsd均小于3％(结果如9、表10所示)，表明供试品溶液在24h内稳定。
[0199]
表9稳定性考察实验结果(相对保留时间)
[0200][0201]
表10稳定性考察实验结果(相对峰面积)
[0202][0203][0204]
6.4专属性的考察
[0205]
取石见穿药材(s15)，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液、“2.2”项下的对照品参照物溶液与空白溶剂各1μl，按“3”项下确定的色谱条件进样分析(结果如图10所示)。结果表明，供试品与对照品在相应的保留时间处有相同的色谱峰，且空白溶剂无干扰，说明建立的方法专属性良好。
[0206]
6.5耐用性的考察
[0207]
(1)不同流速的考察
[0208]
取石见穿药材(s1)供试品溶液，在“3”项色谱条件的基础上比较流速为0.38ml/min、0.40ml/min、0.42ml/min时的色谱图，以迷迭香酸峰为参照峰s，计算6个特征峰的与s峰相对保留时间及相对峰面积的rsd。结果表明，6个特征峰的相对保留时间及相对峰面积rsd均小于5％(结果如表11、表12所示)，表明建立的方法流速耐用性良好，流速较小的变动对图谱影响较小。
[0209]
表11流速考察实验结果(相对保留时间)
[0210][0211]
表12流速考察实验结果(相对峰面积)
[0212]
[0213][0214]
(2)不同柱温的考察
[0215]
取石见穿药材(s1)供试品溶液，在“3”项色谱条件的基础上比较柱温为38℃、40℃、42℃时的色谱图，以迷迭香酸峰为参照峰s，计算6个特征峰与s峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd。结果表明，6个特征峰的相对保留时间及相对峰面积rsd均小于5％(结果如表13、表14所示)，表明本方法柱温耐用性良好，
±
2℃柱温变动对图谱影响较小。
[0216]
表13柱温考察实验结果(相对保留时间)
[0217][0218]
表14柱温考察实验结果(相对峰面积)
[0219][0220]
(3)不同品牌色谱仪考察
[0221]
取石见穿药材(s1)供试品溶液，在“3”项色谱条件的基础上比较采用waters h-class、thermo vanquish、agilent 1290三种不同品牌仪器采集的色谱图，并以迷迭香酸峰为参照峰s，计算6个特征峰与s峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd。结果表明，石见穿药材特征图谱在三种不同品牌仪器上均能良好重现，6个特征峰的相对保留时间及相对峰面积rsd均小于5％(结果如表15、表16所示)，表明本方法对不同品牌色谱仪的耐用性良好。
[0222]
表15色谱仪考察实验结果(相对保留时间)
[0223][0224][0225]
表16色谱仪考察实验结果(相对峰面积)
[0226][0227]
7、石见穿药材的特征图谱的建立
[0228]
对15批石见穿药材的特征图谱进行分析，以迷迭香酸峰为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算rsd值，实验结果见表17、表18。
[0229]
表17 15批石见穿药材特征图谱相对保留时间
[0230][0231]
表18 15批石见穿药材特征图谱相对峰面积
[0232][0233]
将15批石见穿药材及其标准汤剂的特征图谱导入《中药色谱特征图谱相似度评价系统》，分别生成石见穿药材与石见穿标准汤剂对照特征图谱(图11～图13)。
[0234]
结果显示，15批石见穿药材具有6个共有特征峰，且6个特征峰均能稳定地从石见穿药材传递到石见穿标准汤剂中，即石见穿药材特征图谱与其标准汤剂特征图谱中的6个特征峰相对应。以峰5迷迭香酸峰为参照峰s，15批石见穿药材特征图谱的其他5个特征峰相对保留时间rsd在0.13％～1.80％，均小于3％，符合石见穿药材特征图谱的标准要求，且相对保留时间较为稳定，可利用相对保留时间对特征峰进行定位。15批石见穿药材特征图谱中除s峰外的其他5个特征峰相对峰面积rsd在30.43％～97.40％，相对峰面积相差较大，说明不同批次石见穿药材各特征峰所代表的化学成分的比例存在较大的差异，这种差异可能与产地、生长年限、采收期等多种因素有关，暂不宜对相对峰面积作出规定。
[0235]
综上，可确定石见穿药材特征图谱的标准为：供试品色谱图中应呈现6个特征峰，并应与石见穿对照药材参照物的特征图谱中的6个特征峰保留时间相对应；其中峰1、峰3、峰4、峰5、峰6应分别与丹参素、咖啡酸、绿原酸、迷迭香酸、丹酚酸b对照品参照物峰的保留时间相对应；以与迷迭香酸参照物峰相对应的峰为s峰，计算峰2的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
10％范围之内，规定值为：0.24(峰2)。
[0236]
本发明通过以上研究，确立了石见穿及其标准汤剂的特征图谱构建方法，并建立了石见穿药材及其标准汤剂的特征图谱。该方法对石见穿标准汤剂与药材共有的水溶性特征成分进行研究，并作为特征峰确定的依据，能够很好的表征药材原料到汤剂的物质传递，充分展示了石见穿的临床汤剂物质基础特征，经方法学考察该方法具有较好的精密度、重现性、稳定性、专属性，构建的特征图谱信息丰富，特征性强，重现性好，可以快速、全面实现对石见穿药材多个特征成分的质量监控，为临床提供符合石见穿标准汤剂要求的原料，为
石见穿药材质量控制提供科学的新方法。
[0237]
实施例2
[0238]
本实施例提供一种石见穿药材的检测方法
[0239]
1、仪器、试剂与试药
[0240]
(1)仪器
[0241]
waters高效液相色谱仪(waters h-class，沃特世公司)，waters beh c18色谱柱(100mm
×
2.1mm，1.7μm)，万分之一天平(me204e，梅特勒-托利多公司)，百万分之一天平(xp26，梅特勒-托利多公司)；数控超声波清洗器(kq500de，昆山市超声仪器有限公司)，恒温水浴锅(hws28型，上海一恒科技有限公司)，超纯水系统(milli-q direct，默克股份有限公司)。
[0242]
(2)试剂同实施例1。
[0243]
(3)试药同实施例1。其中，以表1中编号为s16的石见穿药材作为待测石见穿药材。
[0244]
2、供试品溶液的制备
[0245]
按实施例1“2.3(2)”项下方法制备待测石见穿药材(s16)的供试品溶液。
[0246]
3、色谱条件
[0247]
以waters beh c18(100mm
×
2.1mm，1.7μm)为色谱柱，以乙腈为流动相a，以体积分数为0.1％的甲酸水溶液作为流动相b，按表2中的规定进行梯度洗脱；流速：0.4ml/min；柱温：40℃；紫外检测波长：290nm。
[0248]
4、测定
[0249]
取待测石见穿药材(s16)的供试品溶液1μl，注入液相色谱仪，按照前述“3”项下的色谱条件进行测定，即得待测石见穿药材的uplc色谱图，结果见图14与表19。
[0250]
表19待测石见穿药材特征图谱的相对保留时间
[0251][0252][0253]
将该待测石见穿药材的uplc色谱图(图14)与石见穿药材对照特征图谱(图11)进行比较：采用该方法对待测石见穿药材进行检测，能够检出6个特征峰，并与对照特征图谱中的6个特征峰相对应。数据结果显示(表19)，该待测石见穿药材6个特征峰的相对保留时间均在标准规定的范围内，表明该批次石见穿药材质量合格，满足临床汤剂的使用需求。
[0254]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0255]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。